KR101714190B1 - 파래를 이용한 수질 독성 측정 방법 - Google Patents

파래를 이용한 수질 독성 측정 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 파래의 포자 방출이 진행될 때 나타나는 색상을 기초로 하여 독성을 진단하는 방법으로서 파래가 방출한 포자의 건조 중량을 확인하여 파래의 생식률 및 건조 중량 간의 상관관계를 판단하여 독성을 진단하는 방법에 관한 것으로 이를 통해 저렴한 비용으로 간편하게 수질 독성을 측정 및 진단할 수 있으며, 다양한 독성 물질에 대해서도 높은 상관관계가 보장되어 다방면으로 활용이 가능하다.

Description

파래를 이용한 수질 독성 측정 방법{A Method for Evaluating Toxicity in Water Using Ulva}
본 발명은 파래의 포자 방출을 이용하여 독성을 시험하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 파래의 포자 방출이 진행될 때 나타나는 색상을 기초로 하여 독성을 진단하는 방법으로서 파래가 방출한 포자의 건조 중량을 확인하여 파래의 생식률 및 건조 중량 간의 상관관계를 판단하여 독성을 진단하는 방법에 관한 것이다.
산업이 고도화됨에 따라 수질에 포함되어 있는 독성 물질 및 유해 물질의 양도 함께 증가하여 심각한 피해가 발생되고 있다. 토양 오염, 수질 오염과 같은 환경 오염으로 인하여 자연 생태계가 파괴되고 있다. 이를 방지하기 위해 글로벌 차원에서 환경 규제를 강화하고 있는 추세이다. 하지만 환경 규제는 산업화의 속도를 따라가지 못하고 있으며 수질 오염을 간단히 검사하는 방법이 지속적으로 연구되어야 할 필요가 증가되고 있다.
생태 독성을 평가하는 방법 중에서 생물검정법(bioassay)이 널리 이용되고 있다. 유해 물질을 생물에 노출시켜 사망, 성장, 부화, 수정 등의 생물학적 반응 요소를 측정하여 해당 독성을 평가하는 방법이다. 종래의 방법은 화학적 분석에 의한 개별 물질의 농도를 측정하는 평가로 고가의 분석 장비와 고도로 숙련된 요원을 필요로 하고 있으며, 분석을 위한 시간이 많이 소요되며, 독성 물질의 성분이 정확하게 판단되지 못하는 경우에 분석이 불가하다. 또한, 분석을 위해 샘플을 장거리로 이동시킬 경우에 샘플 내 반응으로 성분 및 농도의 변화가 유발될 수 있다.
게다가 종래의 생물검정법에 이용되는 생물은 어류, 무척추 동물 또는 원생 동물을 이용하여 분석하였으나 마찬가지로 고가의 장비, 고도로 숙련된 요원 및 긴 분석 시간이 요구되어 단시간에 측정하기 어려운 문제가 있었다.
한편, 파래(특히, 구멍갈파래)는 서식 환경이 다양하고, 샘플 확보 및 배양이 용이하다는 것에 착안하여, 본 발명자들은 파래를 이용하여 수질 독성을 평가하는 방법(대한민국 등록특허 제653,100, 대한민국 등록특허 제653,101), 독성을 진단하기 위한 키트(대한민국 등록특허 제1,037,960) 및 파래의 보관 방법 및 보관 용액(대한민국 등록특허 제1,278,945)을 세계 최초로 발명해 낸 바 있다. 파래 등의 해조류는 생식 세포가 형성된 후 수중으로 방출되어 일정 기간 동안 플랑크톤으로 생활하다가 성장에 적합한 기질에 부착하여 엽체로 성장한다. 이 때 주변 해수의 독성 정도에 따라 생식 세포의 방출에 영향을 미친다는 점을 확인하여 해수에 유입되는 유해 물질의 독성을 간편하고 경제적으로 평가할 수 있도록 하였다. 이 방법은 미국이나 유럽에서 상용화되고 있는 발광 박테리아, 윤충류 등을 이용한 독성 평가 방법에 비하여 약 2배 이상의 민감도를 나타내어 소량의 독성 물질만 있어도 민감하게 반응하도록 한다.
이에 본 발명자들은 추가적인 연구를 통해 종래의 발명을 보다 개량하여 정확한 수준의 독성 평가를 위한 방법을 위한 방법을 개발하게 되었다.
본 발명자들은 수질의 독성 물질을 파래의 포자 방출률 및 파래의 건조 중량 사이의 확률적으로 유의미한 상관관계를 이용하여 수질의 독성을 측정할 수 있는 방법을 개발하였다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 파래의 포자 방출률 및 파래의 건조 중량 사이의 상관관계를 도출하여 포자 방출을 이용한 수질 독성 측정 방법을 제공하는데에 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 포자 방출을 이용한 수질 독성 측정 방법에 이용되는 영양 물질을 포함하는 인공염수를 제공하는데에 있다.
본 발명의 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 파래의 포자 방출을 이용한 수질 독성 측정 방법은 (a) 표준 독성 용액이 포함된 대상 수체가 담긴 웰 평판 배양기에 파래 잎을 넣는 단계(대조군 용액에도 파래 잎을 넣는 단계를 동시에 수행);
(b) 표준 독성 시험 온도, 광량, 광주기 조건은 각각 15 내지 20oC, 광도는 50 내지 200 ?mol/m2ㆍs의 광자 조사, 11 내지 13시간 : 13 내지 11 시간의 명암주기 조건 하에서 96 시간 동안 배양시키는 단계;
(c) 포자 방출이 진행될 때 눈금형의 측정 필름을 사용하여 파래 잎의 전체 면적을 기준으로 백색으로 색상이 변한 면적을 측정하거나, 영상분석장치로 측정하여 엽상체 전체면적 값을 측정하여 파래의 포자 방출률을 측정하는 단계;
(d) 측정을 마친 파래 절편이 포함하는 수분을 건조시켜 제거하여 건조된 파래 절편을 얻는 단계;
(e) 건조된 파래 절편의 건조 중량을 측정하는 단계; 및
(f) 파래의 포자 방출률에 따른 건조된 파래 절편의 건조 중량의 상관도를 분석하여 대상 수체에 포함되어 있는 독성 정도를 측정하는 단계를 포함한다.
상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 포자 방출을 이용한 수질 독성 측정 방법에 이용되는 영양 물질을 포함하는 인공염수는 그 성분이 NaCl, MgSO4ㆍ7H2O, MgCl2ㆍ6H2O, CaCl2ㆍ2H2O, KCl, NaBr, NaNO3, NaHCO3, H3BO3, Na2SiO3ㆍ9H2O, Na2HPO4 및 NaBr을 포함하는 포자 방출을 이용한 수질 독성 측정 방법에 이용되는 영양 물질을 포함한다.
기타 실시예들의 구체적인 사항들은 상세한 설명 및 도면들에 포함되어 있다.
본 발명의 효과에 대해서는 다음과 같다.
본 발명의 측정 방법은 저렴한 비용으로 간편하게 수질 독성을 측정 및 진단할 수 있다. 다양한 독성 물질에 대해서도 높은 상관관계가 보장되어 다양한 종류의 독성 물질의 양 또는 종류를 분석하는데 유용하다.
본 발명에 따른 효과는 이상에서 예시된 내용에 의해 제한되지 않으며, 더욱 다양한 효과들이 본 명세서 내에 포함되어 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 구멍갈파래를 이용한 포자 방출률을 측정하는 원리를 보여주는 이미지이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 영양 물질을 포함하는 인공염수를 제조하기 위한 실험도구 개요도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 독성 물질을 포함하는 표준 독성 용액을 제조하기 위한 실험 개요도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 반수희석법을 이용하여 다양한 농도의 표준 독성 용액을 제조하기 위한 실험 개요도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 반수 희석시킨 표준 독성 용액을 24-웰 플레이트에 분주시킨 개요도이다(독성 용액이 없는 대조군으로서의 인공염수 조건을 좌측에 준비한다).
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 표준 독성 용액이 분주된 24-웰 플레이트에 원형의 구멍갈파래 조각을 넣는 과정을 보여주는 개요도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 눈금형의 측정 필름을 사용하여 포자 방출률을 측정하는 과정을 보여주는 개요도이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 표준 독성 용액에 배양을 마친 구멍갈파래를 건조시켜 건조 중량을 측정하는 과정을 보여주는 개요도이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 구멍갈파래 생식세포 방출률과 건조 파래의 건조 중량 사이의 상관관계를 나타낸 그래프로, 각각 구리(좌측 상단), 6가 크롬(우측 상단), Diuron(DCMU, 좌측 하단), 4-클로로-2-나이트로벤젠(우측 하단)의 독성 물질 조건에서 수행하였다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 구멍갈파래 생식세포 방출률과 건조 파래의 건조 중량의 제곱 값 사이의 상관관계를 나타낸 그래프로, 각각 구리(좌측 상단), 6가 크롬(우측 상단), Diuron(DCMU, 좌측 하단), 4-클로로-2-나이트로벤젠(우측 하단)의 독성 물질 조건에서 수행하였다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
비록 제1, 제2 등이 다양한 구성요소들을 서술하기 위해서 사용되나, 이들 구성요소들은 이들 용어에 의해 제한되지 않음은 물론이다. 이들 용어들은 단지 하나의 구성요소를 다른 구성요소와 구별하기 위하여 사용하는 것이다. 따라서, 이하에서 언급되는 제1 구성요소는 본 발명의 기술적 사상 내에서 제2 구성요소일 수도 있음은 물론이다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 구멍갈파래를 이용한 포자 방출률을 측정하는 원리를 보여주는 이미지이다. 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 영양 물질을 포함하는 인공염수를 제조하기 위한 실험도구 개요도이다. 도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 독성 물질을 포함하는 표준 독성 용액을 제조하기 위한 실험 개요도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 반수희석법을 이용하여 다양한 농도의 표준 독성 용액을 제조하기 위한 실험 개요도이다. 도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 반수 희석시킨 표준 독성 용액을 24-웰 플레이트에 분주시킨 개요도이다(독성 용액이 없는 대조군으로서의 인공염수 조건을 좌측에 준비한다). 도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 표준 독성 용액이 분주된 24-웰 플레이트에 원형의 구멍갈파래 조각을 넣는 과정을 보여주는 개요도이다. 도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 눈금형의 측정 필름을 사용하여 포자 방출률을 측정하는 과정을 보여주는 개요도이다. 도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 표준 독성 용액에 배양을 마친 구멍갈파래를 건조시켜 건조 중량을 측정하는 과정을 보여주는 개요도이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 구멍갈파래 생식세포 방출률과 건조 파래의 건조 중량 사이의 상관관계를 나타낸 그래프로, 각각 구리(좌측 상단), 6가 크롬(우측 상단), Diuron(DCMU, 좌측 하단), 4-클로로-2-나이트로벤젠(우측 하단)의 독성 물질 조건에서 수행하였다. 도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 구멍갈파래 생식세포 방출률과 건조 파래의 건조 중량의 제곱 값 사이의 상관관계를 나타낸 그래프로, 각각 구리(좌측 상단), 6가 크롬(우측 상단), Diuron(DCMU, 좌측 하단), 4-클로로-2-나이트로벤젠(우측 하단)의 독성 물질 조건에서 수행하였다.
본 발명이 해결하고자 하는 파래의 포자 방출을 이용한 수질 독성 측정 방법은 (a) 표준 독성 용액이 포함된 대상 수체가 담긴 웰 평판 배양기에 파래 잎을 넣는 단계(대조군 용액에도 파래 잎을 넣는 단계를 동시에 수행); (b) 표준 독성 시험 온도, 광량, 광주기 조건은 각각 15 내지 20oC, 광도는 50 내지 200 μmol/m2ㆍs의 광자 조사, 11 내지 13시간 : 13 내지 11 시간의 명암주기 조건 하에서 96 시간 동안 배양시키는 단계; (c) 포자 방출이 진행될 때 눈금형의 측정 필름을 사용하여 파래 잎의 전체 면적을 기준으로 백색으로 색상이 변한 면적을 측정하거나, 영상분석장치로 측정하여 엽상체 전체면적 값을 측정하여 파래의 포자 방출률을 측정하는 단계; (d) 측정을 마친 파래 절편이 포함하는 수분을 건조시켜 제거하여 건조된 파래 절편을 얻는 단계; (e) 건조된 파래 절편의 건조 중량을 측정하는 단계; 및 (f) 파래의 포자 방출률에 따른 건조된 파래 절편의 건조 중량의 상관도를 분석하여 대상 수체에 포함되어 있는 독성 정도를 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 독성 평가에 사용되는 파래(Ulva)는 그 종류가 크게 제한되지 않으며, 예를 들어 창자파래(Ulvaintestinalis), 납작파래(Ulvacompressa), 잎파래(Ulvalinza), 가시파래(Ulvaprolifera), 격자파래(Ulvaclathrata), 갈파래(Ulvalactuca), 구멍 갈파래(Ulvapertusa) 등이 있으며, 이 중 구멍 갈파래(Ulvapertusa)가 독성 물질에 대한 민감성 측면에서 바람직하다. 또한, 실제 수질 독성 평가시 파래는 잎에 해당하는 엽체 부위가 이용되며 포자 형성률의 측정을 용이하게 하기 위해 원형, 사각형 등 특정 형태로 절편된 형태로 절단되는데, 보관 후 특정 형태로 절단하는 번거로움을 피하고 보관을 보다 쉽게 위해 원형으로 절편된 형태를 가지는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에 따른 파래의 포자 방출을 이용한 수질 독성 측정 방법에 적용될 수 있는 상기 대상 수체는 해수, 인공염수, 하천, 호수, 폐수, 방류수, 오수, 슬러지 용출수, 토양 용출수, 또는 퇴적토 용출수를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 파래의 포자 방출을 이용한 수질 독성 측정 방법을 통해 진단 가능한 유해 독성(오염) 물질로는 구리(Cu), 크롬(Cr), 카드뮴(Cd), 납(Pb), 아연(Zn)인 중금속류, DCMU(3-(3,4-디클로로페닐)-1,1-디메틸우레아), 4-클로로-2-나이트로벤젠, 휘발성 유기 화합물(VOC)류, 다환 방향족 탄화수소(PAH)류, 폴리클로로비페닐(PCB)류 또는 TBTO[비스(트리-n-부틸주석) 옥사이드]을 포함한다.
표준 독성 용액은 반수희석법(100％, 50％, 25％, 12.5％, 6.25％)으로 넣으며, 표준 독성 용액은 예컨대 구리 표준용액(CuSO4, CAS No. 7758-98-7)인 것이 바람직하다.
원형 구조의 파래 잎(엽체)은 50-200μmol 광자/m2·s의 광자 조사량(photon irradiance), 7-9의 pH, 25-35‰의 염도(salinity) 및 15 내지 20℃의 온도 조건하에서 96시간 동안 24-웰 평판기에서 배양되는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에 따른 파래의 포자 방출을 이용한 수질 독성 측정 방법은 포자 방출이 진행될 때 눈금형의 측정 필름을 사용하여 파래 잎의 전체 면적을 기준으로 백색으로 색상이 변한 면적을 측정하거나, 영상분석장치로 측정하여 엽상체 전체면적 값을 측정하는 단계를 포함한다.
이어서, 포자 방출이 진행될 때 눈금형의 측정 필름을 사용해서 잎의 전체 면적을 기준으로 백색으로 색상이 변한 면적을 측정하였다. 이어서, 프로그램을 이용한 데이터 산출 및 분석에 의해 독성을 판정하였다. 눈금형의 측정 필름을 사용하는 방식은 대한민국 등록 특허 10-1,037,960호에 기재되어 있다. 백색으로 색상이 변한 면적에 대한 백분율은 동전 모양의 파래를 관찰하기 위해 전체를 16등분하고, 각각의 면적에 백분율을 표시하여 16개 면적의 비를 관찰하고 간단하게 독성 유무를 판단할 수 있다. 예를 들어, 관찰 면적 수 9와 백분율 56％는 총 16개의 관찰 면적 중 9개가 백색으로 변한 면적이며, 독성도가 56％라고 판정할 수 있다.
또한, 영상분석장치를 이용하는 포자 방출을 이용한 수질 독성 측정 방법은 대한민국 공개특허 제10-2012-0041096호에서 참조할 수 있다.
파래의 생식율은 배양된 파래의 전체 면적과 색상이 흰색으로 변화된 부분의 면적의 비율을 구함으로써 산출될 수 있다. 상기 면적의 비로부터 대상 수질의 수질 오염도를 산출한다. 한편, 영상처리부는 파래의 생식율을 측정하기 위하여 파래의 색상변화의 속도를 측정할 수도 있다.
대상 수질의 독성은 대조군 파래와 실험군 파래의 색상 변화 면적비를 비교함으로써 산출될 수 있으며, 그 계산식은 다음과 같다.
독성 측정 대상 수질의 독성 = [1-(A-B/A)]×100(％)
여기서, A는 독성이 없는 배양 환경에서 배양된 대조군 파래의 백색으로 변한 면적비이고, B는 대상 수질에서 배양된 실험군 파래의 백색으로 변한 면적비이다. 예를 들어, A가 0.8이고, B가 0.5로 측정된 경우 해당 수질의 독성은 [1-(0.8-0.5/0.8)]×100 = 82.5%로 계산된다.
본 발명의 일 실시예에 따른 파래의 포자 방출을 이용한 수질 독성 측정 방법에 이용되는 파래는 대형 녹조 구멍갈파래(Ulva pertusa)인 것이 바람직하다. 녹조 구멍갈파래는 접근이 쉬운 조간대에 서식하고 군집을 이루고 있기 때문에 채집이 용이하고 풍부한 시료 획득이 가능하며, 배양 및 조작이 용이하여 다양한 환경 요인에 대한 생리 반응 연구에 편리한 종이기 때문이다. 구멍갈파래는 성숙하면 72-96시간 후에 엽체 가장자리 부위가 황색, 갈색, 흰색을 띠며 생식세포가 형성 및 방출되는데, 이러한 특징을 이용하여 구멍갈파래의 엽체를 다양한 농도의 대상 수질에 노출시킨 후, 포자가 형성되어 색상이 흰색으로 변하는 면적을 백분율로 산출하여 대상 수질의 독성을 측정할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 건조된 파래 절편의 건조 중량의 상관도 분석은 특정의 표준 독성 용액의 농도에서 측정된 포자 방출률에 대한 파래 절편의 건조 중량 값 사이의 상관도를 분석하는 것이 바람직하다. 상기 상관도 분석은 t-검정 쌍체 분석법 및 t 검정에 대한 피어슨 상관계수를 이용하며, 특정의 표준 독성 용액의 농도의 반복 구간의 변동계수(Coefficient of variation CV = 100*표준편차/평균)가 30%를 초과하는 경우 다시 배양과 측정을 수행하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 단계 (f)에서 상관도 분석에 이용하는 건조된 파래 절편의 건조 중량은 건조 중량 값 또는 건조 중량의 제곱 값 조건에서 분석하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 단계 (f)에서 건조된 파래 절편의 건조 중량의 상관도 분석은 특정의 표준 독성 용액의 농도에서 측정된 포자 방출률에 대한 파래 절편의 건조 중량 값 사이의 선형회귀분석 또는 t-검정 쌍체분석을 이용하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 상관도 분석은 t-검정 쌍체 분석법 및 t 검정에 대한 피어슨 상관계수를 이용하며, 특정의 표준 독성 용액의 농도의 반복 구간의 변동계수(Coefficient of variation CV = 100*표준편차/평균)가 30%를 초과하는 경우 다시 배양과 측정을 수행하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 단계 (f)에서 선형회귀분석에 의한 상관계수(r2)의 값이 0.72 이하인 경우 다시 배양과 측정을 수행하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 단계 (f)에서 t-검정에 의한 피어슨 상관계수의 값이 0.84 이하인 경우 다시 배양과 측정을 수행하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 상관도 분석에서 대조군 용액에서 측정한 파래 절편은 배양 후 포자 방출률이 80%이상인 바람직하며, 만일 80% 이하 조건이라면 다시 배양과 측정을 수행하는 것이 바람직하다.
본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 포자 방출을 이용한 수질 독성을 위한 인공염수는 그 성분이 NaCl, MgSO4ㆍ7H2O, MgCl2ㆍ6H2O, CaCl2ㆍ2H2O, KCl, NaBr, NaNO3, NaHCO3, H3BO3, Na2SiO3ㆍ9H2O, Na2HPO4 및 NaBr을 포함하는 포자 방출을 이용한 수질 독성 측정 방법에 이용되는 영양 물질을 포함하는 인공염수를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 인공염수는 pH 7 내지 9이도록 조절하며, 보다 바람직하게는 pH 7.5 내지 8.5이며, 가장 바람직하게는 7.8 내지 8.2이다. pH를 조절하기 위해 산 또는 염기를 처리할 수 있으며, 이는 공지의 산 또는 염기를 이용할 수 있다.
[실시예]
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 제시한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위하여 제시되는 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
제조예 1 : 배양 배지 제조 방법(인공염수 및 인공염수 영양액)
실험에 사용할 인공염수 배양액을 제조하기 위해 하기 표 1에 표기된 인공 해수(35‰) 조성물을 1 L 증류수에 용해하여 인공염수를 제조하였다(도 2). 인공염수의 pH를 필요할 경우 1 M HCl 또는 1 M NaOH를 이용하여 pH 8.0±0.2 정도로 조절하였다.
인공염수 영양액은 상기의 방법에 의해 제조된 인공염수에 영양 물질을 포함시켜 제조한 것으로 파래를 배양시키기 위한 영양 물질을 하기 표 2에 기재되어 있는 영양 물질을 포함시키도록 인공염수에 용해시켰다.
인공염수에 포함되는 화합물 양(g/l)
NaCl 21
MgSO4ㆍ7H2O 6
MgCl2ㆍ6H2O 5
CaCl2ㆍ2H2O 1
KCl 0.8
NaBr 0.1
인공염수 영양액에 포함되는 영양물질
(표 1의 성분 포함)		 양(g/l)
NaNO3 0.2
NaHCO3 0.2
H3BO3 0.06
Na2SiO3ㆍ9H2O 0.01
Na2HPO4 0.02
Sr(NO3)2 0.03
구멍갈파래는 10 L 투명 용기에 폭기 배양하여 배양 온도는 15oC, 광도는 5 내지 100μmol/m2s, 광주기는 12 : 12 시간의 명암주기로 하고 인공염수 배양액은 3일 간격으로 전량 교환하였다. 배양 실험 조건을 하기 표 3에 표기하였다.
시험형태 비교환 정수배양
광 조사량 백색광 80-100μmol/m2ㆍs(4000 - 5000 lux)
광 주기 12:12 시간 명암주기
시험 온도 14 - 16oC
염분 25 - 35‰
시험 용기 24-웰 플레이트
시험 용액 2.5 ml/replicate
시험 반복 수 직경 9.4 mm Ulva pertusa: 3회
시험 생물 크기 엽상체 가장자리에서 떼어낸 직경 9.4 mm 원형절편
시험 기간 96 시간
측정요소 원형 절편 전체 면적에 대한 포자가 방출된 면적비율 및
엽상체 시료의 건조중량
시험 적합도 기준 대조구에서의 포자 방출률이 80% 이상
(일반적으로 대조구에서의 포자 방출은 배양 후 3일 째
시작되어 4-5일 째 완성)
제조예 2 : 구멍갈파래 엽상체 원형절편(실험 샘플)의 제조
구멍갈파래가 생식하는 부위는 가장자리 부분으로 제한되어 있어, 구멍갈파래의 엽상체 끝에서부터 약 2 cm 이내의 가장자리 부위에서 코르크 보러(Cork borer)를 이용하여 원형 절편을 잘라내었다. 시험 대조군과 독성 농도별로 3개 이상의 엽상체 절편(각각 직경 9.4 mm)을 준비하였다. 실험 샘플의 안정화를 위해 구멍갈파래 원형절편은 시험 시작 하루 전에 준비하도록 하며, 실험 시작 전까지 냉장 온도(약 3 내지 7oC)에서 보관하였다.
제조예 3 : 독성 용액 및 배양 준비
생태 독성 평가를 위해 반수희석법에 따라 대조군을 제외한 5개의 독성 농도 구배 조건을 설정하였다(도 3 내지 도 8).
1) 0.1 ml 황산구리(CuSO4) 수용액을 9.9 ml 인공염수 배양액에 희석하였다.
2) 상기 희석용액에 78 ml의 인공염수 배양액을 다시 희석하여 0.25 mg/l의 구리 독성 용액을 제조하였다.
3) 반수희석법을 이용하여 위의 구리 독성 용액을 최고 농도로 하여 각각 인공염수 배양액에 희석하여 5개의 독성 농도 용액(0.25, 0.125, 0.0625, 0.03125, 0.015625 mg/l)을 제조하였다. 각 독성 용액의 용량은 약 40 ml로 하였으며, 대조군으로 일반 인공염수 배양액 40 ml를 준비하였다.
4) 독성 용액 제조를 마치고 각 농도별로 pH를 측정하여 시험조건에 맞도록(pH 8.0±0.2) 산 또는 염기를 처리하여 조절하였다.
5) 24구 웰-플레이트의 4개 웰(well)에 대조군 용액 2.5 ml를 각각 분주하였다.
6) 대조군 용액을 분주한 후, 옆의 4개의 웰에 구리 독성 용액 중 가장 낮은 농도부터 차례대로 각각 2.5 ml을 분주하여 1개의 배양 플레이트를 준비하였다.
7) 포셉을 이용하여 대조군부터 낮은 구리 독성 농도 순서대로 하나의 구멍갈파래 엽상체 절편을 하나의 웰에 각각 분주하였다.(실험 생물의 반복 수는 실험의 목적에 의해 달라질 수 있으며, 통계적으로 신뢰할 수 있는 표본 개수를 고려하여 동일한 농도의 반복수를 여러 개 수행할 수 있도록 하였다. 본 실험의 경우 24구 웰-플레이트를 이용하여 한 농도당 4개의 반복구로 이루어진 3개의 플레이트를 수행하도록 하였다.)
8) 표준 독성 시험 온도, 광량, 광주기 조건은 각각 15oC, 광도는 80 내지 100 ?mol/m2s, 광주기는 12 : 12 시간의 명암주기로 하였다.(광원의 종류는 4 내지 6개의 백색 형광등을 이용하는 것이 바람직하며, 시험 생물종 간은 최소 20 cm 간격으로 시험을 수행하였다. 또한, 배양 시에 구멍갈파래 절편은 기울어지거나 옆으로 세우지 않고 광원에 고루 노출될 수 있도록 반듯이 눕혀서 배양하였다.
상기의 황산구리 수용액 외에 6가 크롬 수용액, 제조제의 일종인 DCMU(3-(3,4-dichlorophenyl)-1,1-dimethylurea), 4-클로로-2-나이트로페놀 총 4 종류의 독성 용액을 상기와 같은 단계를 거쳐 각각 제조하였다.
실험예 1 : 독성 평가 결과 측정 1: 생식율 측정 방법
실험 개시 후, 96 시간 경과 후, 각 웰에서 포셉으로 구멍갈파래 절편을 각 조건구별로 꺼내어 한 개의 측정 필름 위에 놓았다. 파래의 포자 방출은 엽상체의 색의 변화로 확인한다. 엽상체의 색이 녹색에서 연한 올리브색이나 흰색으로 바뀐 면적의 칸 수를 세었다(도 1).
영상분석장치로 측정하는 경우, 포자가 방출된 부분과 엽상체 전체 면적 측정치를 백분율로 변환하여 구멍갈파래의 포자 형성률을 계산하였다. 눈금필름을 활용하는 경우 필름 오른쪽에 있는 표에 나타난 수치를 읽어 포자형성률을 확인하였다.
실험예 2 : 독성 평가 결과 측정 2: 건조 중량 측정
상기의 측정을 마친 엽상체 절편은 각 엽상체 별로 물기를 완전히 제거한 후, 유산지에 올려 놓고 50oC 오븐에 24 시간 동안 건조시켰다. 24 시간이 경과한 후에 꺼내어 전자 미량 저울에 올려서 각 절편마다 건조 중량을 측정하였다.
실험예 3 : 독성 평가 결과 측정 3: 통계 분석을 이용한 상관관계 분석
1) 자료 정리
생식 세포 형성률은 원형 절편 전체 면적에 대한 포자가 형성된 면적의 비율로 나타내며, 촬영한 엽상체 사진을 기존의 면적 측정 방법을 통해 측정하는 방법 및 건조 중량을 통해 측정하는 방법으로 각각 수행하여 두 결과를 비교하였다.
2) 통계처리
시험 결과를 이용하여 포자형성률 억제 농도(EC50)와 함께 신뢰구간을 측정하였다. 포자형성률 억제 농도(EC50) 값은 EPA에서 Linear Interpolation(ICp)와 같은 독성자료처리용 통계 프로그램을 다운로드 받아 사용하였다.(http://www.epa.gov/eerd/stat2.htm)
건조 중량의 경우 포자 형성 및 방출 정도에 반비례하여, 포자 형성 억제가 높을수록 건조 중량 역시 증가하므로 생식 세포 형성률과 동일한 수식을 이용하여 포자형성률 억제 농도(EC50) 값을 도출하기 위해 측정된 건조 중량에 각각 역수를 취하여 독성 영향 농도를 계산하는 수식에 대입하였다. 대조군에서의 포자형성률 억제 농도(EC50) 값이 20% 이상일 경우 또는 동일농도의 반복구간의 변동계수(coeffeicient of variation, CV=100*표준편차/평균)가 30% 이상일 경우에는 재실험 하였다.
3) 구멍갈파래 생식율과 건조 중량 간의 상관관계 분석
황산 구리 수용액, 6가 크롬 수용액, DCMU(3-(3,4-dichlorophenyl)-1,1-dimethylurea), 4-클로로-2-나이트로페놀에 대한 구멍갈파래 생태독성평가 수행 후, 구멍갈파래의 생식율과 건조 중량의 상관도(correlation diagram)을 작성하였다(도 9 및 도 10).
각 독성원별로 독성 농도에 따른 1) 생식 세포 방출률과 건조 중량, 2) 생식 세포 방출률과 건조 중량 제곱 간의 선형 회귀분석 결과 모든 분석결과에서 생식율이 증가할수록 건조 중량 또는 건조 중량의 제곱 수치는 감소하는 반비례적 선형 경향을 확인할 수 있었다.
상관계수(r2)의 계산 값은 0.7203에서 최대 0.983까지 나타나 생식율과 건조 중량 사이에 높은 상관성이 나타남을 확인할 수 있었다.
또한 상관계수를 바탕으로 생식율과 건조 중량 간의 t-검정 쌍체분석 및 t 검정에 대한 피어슨 상관계수를 확인하였다. 계산 결과 모든 독성원에서 생식율과 건조 중량 회귀계수를 이용하여 계산한 t 값이 자유도 11(n=12)인 t 값보다 크게 계산되어, 무상관에 대한 가설 검정에서 상관성이 있다는 점을 확인할 수 있었다. 하기 표 4에서 t 값에 대한 피어슨 상관분석 또한 결정계수가 0.8487에서 최대 0.9915로 계산되어 본 통계 분석을 통해서 생식율과 건조 중량 사이에 높은 상관관계가 있음을 입증할 수 있었다.
독성원 상관계수 t 값 피어슨 상관계수 P 값
Cu r 2.3492 0.9915 <0.05
r2 2.3020 0.9799 <0.05
Cr6+ r 2.5312 0.9053 <0.05
r2 2.5039 0.9313 <0.05
DCMU r 4.2611 0.8487 <0.05
r2 4.2063 0.8637 <0.05
4-클로로-2-나이트로페놀 r 2.9004 0.9714 <0.05
r2 2.8837 0.9855 <0.05
또한, 이상에서는 본 발명의 바람직한 실시 예에 대하여 도시하고 설명하였지만, 본 발명은 상술한 특정의 실시예에 한정되지 아니하며, 청구범위에서 청구하는 본 발명의 요지를 벗어남이 없이 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변형실시가 가능한 것은 물론이고, 이러한 변형실시들은 본 발명의 기술적 사상이나 전망으로부터 개별적으로 이해되어서는 안 될 것이다.

Claims (10)

  1. (a) 표준 독성 용액이 포함된 대상 수체가 담긴 웰 평판 배양기에 파래 잎을 넣는 단계(대조군 용액에도 파래 잎을 넣는 단계를 동시에 수행);
    (b) 표준 독성 시험 온도, 광량, 광주기 조건은 각각 15 내지 20 ℃, 광도는 50 내지 200 μmol/m2ㆍs의 광자 조사, 11 내지 13 시간 : 13 내지 11 시간의 명암주기 조건 하에서 96 시간 동안 배양시키는 단계;
    (c) 포자 방출이 진행될 때 눈금형의 측정 필름을 사용하여 파래 잎의 전체 면적을 기준으로 백색으로 색상이 변한 면적을 측정하거나, 영상분석장치를 이용하여 백색으로 색상이 변한 면적을 측정하는 단계;
    (d) 측정을 마친 파래 절편이 포함하는 수분을 건조시켜 제거하여 건조된 파래 절편을 얻는 단계;
    (e) 건조된 파래 절편의 건조 중량을 측정하는 단계; 및
    (f) 파래의 포자 방출률에 따른 건조된 파래 절편의 건조 중량의 상관도를 분석하여 대상 수체에 포함되어 있는 독성 정도를 측정하는 단계를 포함하고,
    상기 단계 (f)에서 건조된 파래 절편의 건조 중량의 상관도 분석은 특정의 표준 독성 용액의 농도에서 측정된 포자 방출률에 대한 파래 절편의 건조 중량 값 사이의 선형회귀분석 또는 t-검정 쌍체분석에 의하는 것을 특징으로 하는 파래의 포자 방출을 이용한 수질 독성 측정 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 대상 수체는 해수, 인공염수, 하천, 호수, 폐수, 방류수, 오수, 슬러지 용출수, 토양 용출수, 또는 퇴적토 용출수인 것을 특징으로 하는 파래의 포자 방출을 이용한 수질 독성 측정 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 측정 방법에 의해 측정 가능한 독성 물질은 구리(Cu), 크롬(Cr), 카드뮴(Cd), 납(Pb), 아연(Zn)인 중금속류, DCMU(3-(3,4-디클로로페닐)-1,1-디메틸우레아), 4-클로로-2-나이트로벤젠, 휘발성 유기 화합물(VOC)류, 다환 방향족 탄화수소(PAH)류, 폴리클로로비페닐(PCB)류 또는 TBTO[비스(트리-n-부틸주석) 옥사이드]인 것을 특징으로 하는 파래의 포자 방출을 이용한 수질 독성 측정 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 독성 물질은 황산구리, 6가 크롬, DCMU (3-(3,4-디클로로페닐)-1,1-디메틸우레아) 또는 4-클로로-2-나이트로벤젠인 파래의 포자 방출을 이용한 수질 독성 측정 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 표준 독성 용액은 반수희석법(100％, 50％, 25％, 12.5％, 6.25％)으로 넣는 것을 특징으로 하는 파래의 포자 방출을 이용한 수질 독성 측정 방법.
  6. 삭제
  7. 제 1항에 있어서, 상기 상관도 분석은 t-검정 쌍체 분석법 및 t 검정에 대한 피어슨 상관계수를 이용하며, 특정의 표준 독성 용액의 농도의 반복 구간의 변동계수(Coefficient of variation CV = 100*표준편차/평균)가 30%를 초과하는 경우 상기 배양과 측정을 다시 수행하는 것을 특징으로 하는 파래의 포자 방출을 이용한 수질 독성 측정 방법.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 단계 (f)에서 선형회귀분석에 의한 상관계수(r2)의 값이 0.72 이하인 경우 다시 배양과 측정을 수행하는 것을 특징으로 하는 파래의 포자 방출을 이용한 수질 독성 측정 방법.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 단계 (f)에서 t-검정에 의한 피어슨 상관계수의 값이 0.84 이하인 경우 다시 배양과 측정을 수행하는 것을 특징으로 하는 파래의 포자 방출을 이용한 수질 독성 측정 방법.
  10. 삭제
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