KR20130083172A - 좀개구리밥의 형광 특성을 이용한 수질 독성 평가 방법 - Google Patents

좀개구리밥의 형광 특성을 이용한 수질 독성 평가 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 측정용 용기에 수체 샘플을 넣는 단계; 수체 샘플을 함유하는 측정용 용기에 좀개구리밥을 투입하는 단계; 측정용 용기에 투입된 좀개구리밥을 배양하는 단계; 및 배양이 완료된 좀개구리밥의 엽록소 형광 특성인 유효 양자수율을 측정하는 단계;를 포함하는 수질 독성 평가 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 수질 독성 평가 방법은 좀개구리밥의 군체수 변화량이 아닌 좀개구리밥의 엽록소 형광 특성 중 하나인 유효 양자수율을 수질 독성 평가의 지표로 이용하기 때문에 수질 독성 판별 시간이 약 3일 정도 소요되고, 종래의 수질 독성 평가 시간(약 7일)보다 2배 이상 단축된다. 또한, 군체수 변화량 측정보다 엽록소 형광 특성을 수질 독성 평가의 지표로 이용하기 때문에 측정하는 것이 보다 간편하고, 아울러 수질 독성원에 대한 높은 민감성을 가진다.

Description

좀개구리밥의 형광 특성을 이용한 수질 독성 평가 방법{Method for evaluating aquatic ecotoxicity using fluorescent property of Lemna paucicostata}
본 발명은 수질 독성 평가 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 좀개구리밥의 형광 특성을 이용한 수질 독성 평가 방법에 관한 것이다.
인류의 활동과 산업의 발달로 새롭고 잠재적인 위해성을 지닌 화학물질이 생산되고 수서 생태계로 유입되고 있다. 현대화학의 발전은 알려진 유용한 화학물의 생산량을 높이는데 기여했을 뿐만 아니라 매일 1200 여종 가량의 새로운 물질도 만들어내고 있다. 물질의 이동과 변환이 급속하게 일어나는 수서 생태계의 특성상, 이러한 독성 물질에 대한 위해성을 평가하고 법적인 대처를 취하는 노력이 이루어지지 않는다면 매년 수천 종의 화학물질을 함유한 산업폐수와 도시하수에 의해서 위기에 처하게 될 위험성에 노출되어 있다.
하천 및 호소를 오염시키는 오염물질에는 산업체에서 유래하는 중금속과 VOCs, 농업용 제초제, 살충제 그리고 인구 밀집도시에서 방출되는 방대한 생활폐수에 함유된 질소와 인 화합물 등이 있는데 이러한 오염물질들에 의한 위해성을 평가하기 위해서 전통적으로 이화학적 방법이 사용되고 있다. 이화학적 방식이란 수체 내의 용존산소량 (DO), 생물화학적 산소요구량 (BOD), 화학적 산소요구량 (COD), 탁도, 전기전도도 및 pH등과 부영양화를 유발시키는 질산염과 인산염을 정량적으로 측정하거나 중금속을 분석하여 수질 오염 정도의 기준으로 삼는 방식을 지칭한다. 그러나, 이러한 방법은 장시간, 고비용, 전문기술 등을 필요로 한다는 단점과 함께 생물학적 이용성, 복합효과(상승 또는 길항 작용 등)와 나아가 생태학적 의미에 대한 정보를 제공해줄 수 없다.
이 같은 제약점을 극복하기 위해 국제적으로 수중 미생물, 조류 (algae), 수중 무척추 동물 및 수생 관속 식물 등 지표 생물을 이용한 오염 진단 방식에 대한 관심이 고조되어 최근 국제 사회에서 제정한 환경 규약을 보면 환경 독성을 평가하는데 있어서 지표 생물에 의한 독성평가 자료를 차용하고 있음을 알 수 있다. 이러한 지표 생물을 이용한 오염 진단방식은 종래에 생물체 내의 오염물질의 농도를 직접 측정하거나 서식처의 오염 등급별 서식종의 존재 여부로 판정하는 Bioindicator식 개념에서 현재는 생물 개체 또는 그 하위의 생물학적 조직 단위의 특성을 이용하여 오염물질을 진단하는 Biomonitor식 방법으로 진화하고 있다. 후자의 방법은 생물의 다양한 생리학적 변화를 통해 환경에 존재하는 단독 혹은 혼합 물질의 위해성을 정량화하거나 그 물질의 잠재적인 영향력을 평가할 수 있으므로 환경오염이 광역화되기 이전에 그 징후를 사전에 파악할 수 있고 생태학적 의미를 찾을 수 있다는 장점을 내포하고 있다.
과거 국제적으로 독성 연구에 사용되었던 생물종은 대부분의 경우 수서 척추동물 또는 무척추 동물이었지만 최근 들어 수서 생태계 내의 수생 식물의 역할이 부각되어 수생 식물을 이용한 독성 평가 방법에 대해 관심이 증가하고 있다. 수생 식물은 수중 생태계의 1차 생산자로서 동식물 플랑크톤, 무척추동물 및 어류의 서식처가 되며, 많은 유기물질을 흡수정화하는 능력을 갖고 있다.
특히 수생 식물 중 개구리밥은 수서 독성과 광독성 테스트 모델로 권장되고 있다. 개구리밥과(Lemnoideae)에 속하는 식물은 가장 작은 단자엽의 일년생 수생 식물로 논 물, 호수, 연못 등의 정수나 유속이 느린 물에 살며 물 표면에 떠서 살기도 하고, 물에 잠겨서 사는 것도 있다. 개구리밥과 식물은 개구리밥속(Spirodela), 좀개구리밥속(Lemna), 좀분개구리밥속(Wolffia), Landoltia 및 Wolffiella 등과 같은 5개의 속으로 나뉘고, 세계적으로 약 30종이 분포하고 있는 것으로 알려져 있다.
현재까지 국제표준화기구(ISO), 미국 환경보호청(EPA), 및 경제협력개발기구(OECD)에 등록된 종래의 개구리밥을 이용한 수질 독성 평가 방법을 살펴보면 개구리밥을 수체 샘플에 배양한 후 잎의 수(frond number), 잎의 면적(frond area), 군체수(population growth rate), 습중량(fresh weight), 건중량(dry weight), 또는 색소 함량(pigment contents)의 변화량을 측정하는 것으로 구성된다. 그러나, 종래의 개구리밥을 이용한 수질 독성 평가 방법은 유효한 변화량을 확보하기 위하여 배양 시간이 약 7일 정도 소요되고 독성원에 대한 민감성이 떨어지는 등의 문제가 있으며, 이를 개선시켜야 할 필요가 있다.
본 발명은 종래의 문제점을 해결하기 위하여 도출된 것으로서, 본 발명의 목적은 좀개구리밥의 엽록소 형광 특성 중 하나인 유효 양자수율을 수질 독성 평가의 지표로 이용하여 보다 간편하고 평가시 소요되는 시간이 현저히 단축되며 동시에 민감성이 높은 수질 독성 평가 방법을 제공하는데에 있다.
본 발명의 상기 목적을 해결하기 위하여, 본 발명은 (a) 측정용 용기에 수체 샘플을 넣는 단계; (b) 수체 샘플을 함유하는 측정용 용기에 좀개구리밥을 투입하는 단계; (c) 측정용 용기에 투입된 좀개구리밥을 배양하는 단계; 및 (d) 배양이 완료된 좀개구리밥의 엽록소 형광 특성으로 하기 수학식 2로 표시되는 유효 양자수율을 측정하는 단계;를 포함하는 수질 독성 평가 방법.
[수학식 2]
Figure pat00001
상기 수학식 2에서 Fv' = Fm' - Ft이고, Fm'는 광적응 상태에서 포화광에 의한 최대형광값을 의미하고, Ft는 광적응 후 정상상태 형광값을 의미한다.
이때, 상기 (a) 단계의 수체 샘플은 바람직하게는 원수 및 희석 배수가 서로 다른 적어도 2개 이상의 희석 원수로 구성되고 상기 희석 원수는 원수를 스테인버그(Steinberg) 인공 배지로 희석하여 제조된다. 또한, 상기 수체 샘플은 더 바람직하게는 원수의 대조군으로 좀개구리밥의 광합성 효율을 저해하는 독성 물질을 포함하지 않는 배양액을 더 포함한다.
또한, 상기 (a) 단계의 수체 샘플은 바람직하게는 pH가 4~10으로 조정된다.
또한, 상기 (a) 단계의 수체 샘플은 바람직하게는 염분 농도가 4‰ 이하로 조정된다.
또한, 상기 (c) 단계의 배양시 광 조사량은 바람직하게는 10~250 μ㏖ photon/㎡·s 이다.
또한, 상기 (c) 단계의 배양시 배양 온도는 바람직하게는 15~35℃이다.
본 발명에 따른 수질 독성 평가 방법은 좀개구리밥의 군체수 변화량이 아닌 좀개구리밥의 엽록소 형광 특성 중 하나인 유효 양자수율을 수질 독성 평가의 지표로 이용하기 때문에 수질 독성 판별 시간이 약 3일 정도 소요되고, 종래의 수질 독성 평가 시간(약 7일)보다 2배 이상 단축된다. 또한, 군체수 변화량 측정보다 엽록소 형광 특성을 수질 독성 평가의 지표로 이용하기 때문에 측정하는 것이 보다 간편하고, 아울러 수질 독성원에 대한 높은 민감성을 가진다.
도 1은 식물의 잎 절편을 20분간 암적응시킨 후 포화 펄스 방법(Saturation pulse method)을 이용하여 엽록소 형광의 변화을 측정한 일반적인 그래프이고, 도 2는 도 1의 엽록소 형광 변화를 암적응 상태와 광적응 상태로 나누어 도시한 것이며, 도 3은 포화 펄스 방법(Saturation pulse method)을 이용하여 엽록소 형광의 변화를 측정하는 구체적인 과정을 나타낸 그래프이다.
도 4는 다양한 배양 조건에서의 좀개구리밥의 엽록소 형광 특성인 유효 양자수율을 나타낸 그래프이다.
도 5는 단일 금속류 독성 물질 농도에 따른 좀개구리밥의 엽록소 형광 특성인 유효 양자수율을 나타낸 그래프이고, 도 6은 단일 금속류 독성 물질 농도에 따른 좀개구리밥의 엽록소 형광 특성인 최대 양자수율을 나타낸 그래프이다.
본 발명은 수체 샘플에 대해 간편하고, 판별 시간이 짧으며 독성 물질(금속 독성 물질, 휘발성 유기 화합물 독성 물질, 제초제, 살충제 등)에 대한 반응 민감성이 높은 수질 독성 평가 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 수질 독성 평가 방법은 측정용 용기에 수체 샘플을 넣는 단계; 수체 샘플을 함유하는 측정용 용기에 좀개구리밥을 투입하는 단계; 측정용 용기에 투입된 좀개구리밥을 배양하는 단계; 및 배양이 완료된 좀개구리밥의 엽록소 형광 특성인 유효 양자수율을 측정하는 단계;를 포함한다. 이하, 본 발명에 따른 수질 독성 평가 방법을 구성요소별로 나누어 설명한다.
수체 샘플
수체(water body) 샘플은 물이 주요 부피를 차지하는 샘플을 말하는 것으로서, 본 발명에 따른 수체 샘플은 해수, 하천, 호수, 폐수, 방류수, 오수, 슬러지 용출수, 토양 용출수, 퇴적토 용출수 등에서 채취한 샘플을 포함한다.
최초의 수체 샘플(이하, 원수)은 원수 이외에 원수를 인공 배지나 물과 같이 독성 물질을 포함하지 않는 액체로 희석하여 적어도 2가지 이상, 바람직하게는 4가지 이상의 농도로 구배화시킨 희석 원수들로 구성되는 것이 바람직하다. 이때, 사용되는 희석 방법은 크게 제한되지 않으며, 일 예로 반수 희석법[100%(원수 자체), 50%(원수의 1/2 농도로 희석한 것), 25%(원수의 1/4 농도로 희석한 것), 12.5%(원수의 1/8 농도로 희석한 것), 6.25%(원수의 1/16 농도로 희석한 것)]이 있다. 원수를 희석하기 위한 액체는 좀개구리밥의 광합성 효율을 저해하는 독성 물질을 포함하지 않고 좀개구리밥의 배양과 양립할 수 있는 것이라면 그 종류가 크게 제한되지 않으며, 구체적으로 물, 스테인버그(Steinberg) 인공 배지 등이 있으며, 이 중 좀개구리밥의 원활한 배양을 고려할 때 스테인버그(Steinberg) 인공 배지인 것이 바람직하다.
또한, 수체 샘플은 바람직하게는 원수의 대조군으로 좀개구리밥의 광합성 효율을 저해하는 독성 물질을 포함하지 않는 배양액을 더 포함하는 데, 대조군으로 는 공지의 다양한 인공 배지가 있으며, 이 중 좀개구리밥의 원활한 배양을 고려할 때 스테인버그(Steinberg) 인공 배지인 것이 바람직하다. 이때, 좀개구리밥의 광합성 효율을 저해하는 독성 물질은 예를 들어 은(Ag; Silver), 알루미늄(Al; Aluminum), 비소(As; Arsenic), 카드뮴(Cd; Cadmium), 코발트(Co; Cobalt), 크롬(Cr; Chromium), 구리(Cu; Copper), 철(Fe; Iron), 수은(Hg; Mercury), 니켈(Ni; Nickel), 납(Pb; Lead), 및 아연(Zn; Zinc)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 금속류로 구성될 수 있다.
한편, 대조군, 원수 및 희석 원수들로 구성된 수체 샘플은 측정용 용기에 넣어지기 전에 좀개구리밥의 원활한 배양을 위해 pH 및 염분 농도가 조정되는 것이 바람직하다. 구체적으로 수체 샘플의 pH는 4~10으로 조정되는 것이 바람직하고, 4~9로 조정되는 것이 더 바람직하며, 5~9로 조정되는 것이 더 바람직하다. 또한, 수체 샘플의 염분 농도는 4‰ 이하로 조정되는 것이 바람직하고, 2‰ 이하로 조정되는 것이 더 바람직하며, 1‰ 이하로 조정되는 것이 더 바람직하다.
본 발명에 있어서, 염분 농도 및 pH가 조정된 수체 샘플(예를 들어 대조군, 원수, 4개 이상의 희석 원수들)을 배양액으로 하여 좀개구리밥을 배양하는 경우 원수의 희석 농도에 따른 좀개구리밥의 엽록소 형광 특성, 특히 광적응된 좀개구리밥의 광합성 효율을 구할 수 있고, 이를 기초로 수체 샘플의 수질 독성을 평가하는 경우 정확한 반수 유효 농도(독성 물질을 포함하지 않는 대조군에서 배양된 좀개구리밥의 유효 양자수율보다 50% 감소된 유효 양자수율을 보이는 독성 물질의 농도로서 단일 독성 물질의 경우 특정 농도로 표시되고 미지의 원수의 경우 희석률로 표시됨; Half maximal effective concentration, EC50) 내지 무영향 농도(독성 물질을 포함하지 않는 대조군에서 배양된 유효 양자수율과 유의적 차이가 없는 수준으로 유효 양자수율을 유지시키는 독성 물질의 농도로서 단일 독성 물질의 경우 특정 농도로 표시되고 미지의 원수의 경우 희석률로 표시됨; No Observed Effect Concentration, NOEC)를 평가할 수 있다.
측정용 용기
측정용 용기는 수체 샘플 및 좀개구리밥을 수용하고, 이후 배양기에 넣어져 좀개구리밥을 배양하기 것으로서, 그 형태는 크게 제한되지 않으며, 일 예로 웰 플레이트(Well plate) 등이 있다. 본 발명에서 웰 플레이트는 적어도 6개 이상의 웰(Well)을 포함하는 것이 바람직한데, 1개의 웰에는 대조군으로서 독성 물질을 포함하지 않는 인공 배지를 넣어 개구리밥과 식물을 배양하고, 나머지 5개의 웰에는 원수와 4개의 희석 원수들을 넣어 좀개구리밥을 배양한다. 또한, 본 발명에서 웰 플레이트는 다양한 원수들의 수질 독성을 한번에 평가할 수 있는 측면을 고려할 때 더 바람직하게는 12개 이상의 웰, 가장 바람직하게는 24개 이상의 웰을 포함하는 것이 바람직하다.
좀개구리밥
좀개구리밥(Lemna paucicostata)은 외떡잎식물 천남성목 개구리밥과의 여러해살이풀로서, 물 위에 떠서 자라는 수생 식물이다. 본 발명은 수질 독성의 평가를 위한 바이오마커로서 수생 식물에 속하는 좀개구리밥의 엽록소 형광 특성, 보다 구체적으로 광적응된 좀개구리밥의 광합성 효율을 나타내는 유효 양자수율(Effective quantum yield)을 이용한다. 일반적으로 식물의 광합성 효율은 후술하는 바와 같이 암적응된 상태에서의 광합성 효율인 최대 양자수율(Maximum quantum yield)과 광적응된 상태에서의 광합성 효율인 유효 양자수율로 나타내는데, 수질 독성의 지표로 유효 양자수율을 사용하는 경우 최대 양자수율을 사용하는 경우보다 민감도 및 신뢰성이 높다. 또한, 좀개구리밥의 엽록소 형광 특성인 유효 양자수율은 단시간 내에 신속하게 측정할 수 있다. 특히, 좀개구리밥의 엽록소 형광 특성인 유효 양자수율을 수질 독성 평가의 지표로 이용하는 경우, 군체수와 같은 생장 특성을 이용하는 경우보다 독성 물질에 대한 반응 감응성을 크게 향상시킬 수 있으며 동시에 형광과 같은 시각적 표시가 가능하다는 장점이 있다.
좀개구리밥의 배양
좀개구리밥 및 수체 샘플을 함유하는 측정용 용기는 배양기에 옮겨지고, 이후 소정 시간 동안 좀개구리밥이 배양된다. 이때, 배양 시간은 크게 제한되지 않으나 수질 독성 평가의 신뢰성을 확보하는 측면에서 적어도 60시간 이상인 것이 바람직하고, 70시간 이상인 것이 더 바람직하며, 72시간 이상인 것이 가장 바람직하다. 또한, 수생 식물에 속하는 좀개구리밥(Lemna paucicostata)의 배양시 유효 양자수율을 위한 광 조사량은 바람직하게는 10~250 μ㏖ photon/㎡·s 인 것이 바람직하고, 50~200 μ㏖ photon/㎡·s 인 것이 더 바람직하다. 또한, 배양 온도는 15~35℃인 것이 바람직하고, 25~30℃인 것이 더 바람직하다. 또한, 배양액의 pH는 4~10인 것이 바람직하고, 5~9인 것이 더 바람직하다. 또한, 배양액의 염분 농도는 0~4‰인 것이 바람직하고, 0~2‰인 것이 더 바람직하다.
좀개구리밥의 엽록소 형광 특성 측정
좀개구리밥을 수체 샘플이 담겨진 측정용 용기에 넣고 특정 배양 조건에서 약 72시간 동안 배양하면 좀개구리밥의 엽록소 형광 특성은 수체 샘플에 함유된 독성물질의 종류 및 함량에 따라 달라진다. 도 1은 식물의 잎 절편을 20분간 암적응시킨 후 포화 펄스 방법(Saturation pulse method)을 이용하여 엽록소 형광의 변화을 측정한 일반적인 그래프이고, 도 2는 도 1의 엽록소 형광 변화를 암적응 상태와 광적응 상태로 나누어 도시한 것이며, 도 3은 포화 펄스 방법(Saturation pulse method)을 이용하여 엽록소 형광의 변화를 측정하는 구체적인 과정을 나타낸 그래프이다.
도 1 내지 도 3에서 보이는 바와 같이 암적응된 잎에 순간적으로 펄스 형태의 포화광(Saturating Light, SL)을 비추면 엽록소 형광은 기저 상태 값인 초기형광값(Fo)에서 최대형광값(Fm)까지 증가한다. 암적응된 잎은 광계 Ⅱ(Photosystem Ⅱ)의 첫 번째 전자 수용체인 QA가 완전히 산화되며, 광계 Ⅱ의 반응중심은 모두 열린 상태에 있다. 또한, 초기형광값(Fo)에서 최대형광값(Fm)에 도달하였을때 광계 Ⅱ(Photosystem Ⅱ)의 첫 번째 전자 수용체인 QA가 완전히 환원되며, 광계 Ⅱ의 반응중심은 모두 닫힌 상태에 있다. QA가 완전히 환원되면 하기 수학식 1로 표시되는 광계 Ⅱ의 최대 양자수율을 측정할 수 있다. 하기 수학식 1로 표시되는 최대 양자수율은 암적응 상태, 즉 광합성이 최대의 효율로 운영될 때의 광계 Ⅱ(Photosystem Ⅱ)의 광화학 반응에 대한 양자수율을 의미한다.
[수학식 1]
Figure pat00002
상기 수학식 1에서 Fv = Fm - Fo이고, Fm은 암적응 상태에서 포화광에 의한 최대형광값을 의미하고, Fo는 암적응 상태에서의 초기형광값을 의미한다.
이후, 계속해서 광합성을 일어나게 할 수 있는 연속광(Actinic Light, AL)을 비추면 형광이 일시적으로 증가하는 것을 볼 수 있다. 이것은 탄소고정이 시작되기 전의 유도기(Lag phase)이다. 빛을 비추기 시작한 후 수 밀리초(miliseconds)내에 전자전달이 일어나기 시작하여, 탄소 고정 효소(Carobon Fixing Enzymes) 중 일부는 빛에 의해 활성화된다. 광합성과 열의 방출이 활성화되면 엽록소 형광은 감소되기 시작하여(소광, quenching이라 함) 정상 상태의 형광값(Ft)에 도달하게 된다. 이렇게 광적응된 잎에 연속광(Actinic Light, AL)의 존재 하에서 다시 펄스 형태의 포화광(Saturating Light, SL)을 비추면 암적응 후에 측정한 최대형광값(Fm)보다 낮은 값을 가지는 최대형광값(Fm')을 얻을 수 있다. 보다 구체적으로 도 3에서 보이는바와 같이 연속광(Actinic Light, AL)의 존재 하에서 펄스 형태의 포화광(Saturating Light, SL)을 일정 시간 간격으로 비추면 특정 시점에서 형광 피크가 일정하게 유지되고 정상 상태에 도달하게 되며, 이때 나타난 형광 피크를 통해 하기 수학식 2로 표시되는 유효 양자수율을 측정할 수 있다. 하기 수학식 2로 표시되는 유효 양자수율은 광적응 상태에서 광계 Ⅱ(Photosystem Ⅱ)의 광화학 반응에 대한 양자수율을 의미한다. Fm' 특정시 QA는 완전히 환원된다. Fm'와 Ft의 차이는 광합성 반응에 의한 소광, 즉 광화학적 소광(Photochemical quenching)을 반영하며, Fm과 Fm'의 차이는 열의 소산에 의한 소광, 즉 비광화학적 소광(Non-photochemical quenching)을 반영한다.
[수학식 2]
Figure pat00003
상기 수학식 2에서 Fv' = Fm' - Ft이고, Fm'는 광적응 상태에서 포화광에 의한 최대형광값을 의미하고, Ft는 광적응 후 정상상태 형광값을 의미한다.
한편, 엽록소 형광 특성 측정은 약 72시간 동안 배양된 좀개구리밥을 암흑 상태에서 약 15분간 적응시킨 후, 엽록소 형광 측정 장치를 이용하여 수행된다. 엽록소 형광 측정 장치는 엽록소 형광 특성을 측정하는 것으로 최종 값은 형광 색상과 같이 가시적인 값으로 환산되어 표시될 수 있고, 최대 양자수율 또는 유효 양자수율과 같은 수치로 표시될 수도 있다. 이러한 엽록소 형광 측정 장치는 광합성의 활성이 변화하는 것을 탐지하기 위해 제작된 것이며, 환경 스트레스 하에서 식물의 광합성 기구 활성을 신속하고 비파괴적인 방법으로 탐지할 수 있는 기구로 알려져 있다.
수질 독성의 평가
수체 샘플의 수질 독성은 원수와 희석 원수와 같은 수체 샘플에서 배양된 좀개구리밥의 엽록소 형광 특성인 유효 양자수율을 독성 물질을 포함하지 않는 대조군에서 배양된 좀개구리밥의 엽록소 형광 특성인 유효 양자수율과 비교하여 평가되며, 구체적으로 반수 유효 농도(Half maximal effective concentration, EC50) 내지 무영향 농도(No Observed Effect Concentration, NOEC) 값으로 표시된다. 이때, 수질 독성 평가 기준으로 좀개구리밥의 엽록소 형광 특성인 유효 양자수율을 이용하는 경우 좀개구리밥의 엽록소 형광 특성인 최대 양자수율을 이용하는 경우보다 독성 물질에 대한 반응 감응성이 향상되므로 보다 정확하게 수질 독성을 평가할 수 있다.
반수 유효 농도(Half maximal effective concentration, EC50)는 엽록소 형광 특성인 유효 양자수율을 독성 물질을 포함하지 않는 대조군에서의 값을 기준으로 50% 감소시키는데 효과적인 수체 샘플의 농도를 의미하는 것으로서, 단일 독성 물질을 포함하는 수체 샘플의 경우 단일 독성 물질의 특정 농도로 표시되고 다수의 독성 물질을 포함하는 미지의 원수의 경우 원수의 희석률로 표시된다. 무영향 농도는 엽록소 형광 특성인 유효 양자수율을 독성 물질을 포함하지 않는 대조군에서의 값과 유의적 차이가 없는 수준으로 유지시키는데 효과적인 수체 샘플의 농도를 의미하는 것으로서, 반수 유효 농도와 마찬가지로 단일 독성 물질을 포함하는 수체 샘플의 경우 특정 농도로 표시되고 다수의 독성 물질을 포함하는 미지의 원수의 경우 희석률로 표시된다. 한편, 반수 유효 농도의 크기와 커질수록 실제 수체 샘플의 독성은 상대적으로 작다는 것을 의미하기 때문에 반수 유효 농도를 실제 수체 샘플 독성으로 환산하기 위해 독성 단위(Toxic Unit, TU)을 다음과 같이 표시할 수 있다.
TU = 100/반수 유효 농도(%)
본 발명에 따른 수질 독성 평가 방법의 용도
본 발명의 수질 독성 평가 방법은 수체 샘플, 좀개구리밥, 측정용 용기, 배양 장치 및 엽록소 형광 측정 장치를 포함하는 수질 독성 평가 시스템에 의하여 실시될 수 있고, 추가적으로 배양된 좀개구리밥의 엽록소 형광 특성인 유효 양자수율을 측정하여 이를 전송하고 분석한 후 그 결과를 다시 반송하는 유비쿼터스 시스템(원격조정시스템)으로 구성될 수도 있다. 본 발명의 수질 독성 평가 방법으로 평가할 수 있는 독성 물질로는은(Ag; Silver), 알루미늄(Al; Aluminum), 비소(As; Arsenic), 카드뮴(Cd; Cadmium), 코발트(Co; Cobalt), 크롬(Cr; Chromium), 구리(Cu; Copper), 철(Fe; Iron), 수은(Hg; Mercury), 니켈(Ni; Nickel), 납(Pb; Lead), 및 아연(Zn; Zinc) 등과 같은 중금속 류가 있다.
본 발명의 수질 독성 평가 방법은 하수 및 폐수 오니를 투척하기 전에 생태계에 부정적인 영향을 끼치지 않도록 하기 위해서 취해야할 오니 희석 배수를 신속하게 결정하는데도 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 종래의 화학적 분석 방식에 의존한 수질 오염 측정법에 내재된 문제점 중 미지의 독성 물질이 수체 내에 투입되었을 때 그것을 탐지해낼 수 없고, 더 나아가 화학적 분석에 의한 결과 수치만을 가지고는 실제 생태계에 끼칠 수 있는 수질 오염의 영향에 대해 전혀 예측할 수가 없다는 단점을 보완한 실용적인 기법이라고 할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명에 따른 수질 독성 평가 방법을 구현할 수 있는 수질 독성 평가 키트에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 수질 독성 평가 키트는 좀개구리밥; 수체 샘플 및 좀개구리밥을 수용하고 좀개구리밥을 배양하기 위한 측정용 용기;및 수체 샘플을 희석하기 희석수 도는 인공 배지;를 포함한다. 또한, 본 발명에 따른 수질 독성 평가 키트는 은(Ag; Silver), 알루미늄(Al; Aluminum), 비소(As; Arsenic), 카드뮴(Cd; Cadmium), 코발트(Co; Cobalt), 크롬(Cr; Chromium), 구리(Cu; Copper), 철(Fe; Iron), 수은(Hg; Mercury), 니켈(Ni; Nickel), 납(Pb; Lead), 및 아연(Zn; Zinc)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 금속류 독성 물질을 희석수 또는 인공배지에 용해시켜 제조한 표준 독성 물질 용액을 더 포함할 수 있는데, 표준 독성 물질 용액은 수체 샘플의 수질 독성을 평가하기 전에 좀개구리밥의 상태, 즉 독성 물질에 대한 반응 감응성 여부를 테스트하는데 이용될 수 있다. 구체적으로 본 발명에 따른 표준 독성 물질 용액이 구리를 독성 물질로 포함하는 용액인 경우, 다양한 구리 용액 및 대조군에서의 좀개구리밥의 엽록소 형광 특성인 유효 양자수율에 대한 데이터를 미리 확보하여 수질 독성 평가 키트와 함께 제공할 수 있다. 사용자는 구리 용액에 대한 좀개구리밥의 엽록소 형광 특성인 유효 양자수율을 측정하고 이를 미리 제공하는 데이터와 비교하여 좀개구리밥이 독성 물질에 대해 정상적으로 반응하는지 여부를 판단하고, 일정 범위(예를 들어, 본래 반응 감응성의 80% 이상)의 반응 감응성을 보이는 경우 미지의 수체 샘플에 대한 수질 독성 평가를 진행할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 다만, 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 명확하게 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 보호범위를 제한하는 것은 아니다.
1. 좀개구리밥의 최적 배양 조건 확립
(1) 좀개구리밥의 전처리 배양
좀개구리밥(Lemna paucicostata)을 1.5L의 스테인버그(Steinberg) 인공 배지를 담은 가로 25㎝, 세로 10㎝, 높이 15㎝의 수조에 넣은 뒤 배양기로 옮겨 연속광 조건하에 20-30 μ㏖ photon/㎡·s의 광 조사량 및 15~20℃의 온도에서 정지 배양하였다. 이때 배양 pH는 약 7로 조정되었고(스테인버그 인공 배지의 pH는 7±0.2이다), 인공 배지는 7일 간격으로 전량 교체해 주었다.
표 1은 본 발명의 실시예에서 사용된 인공 배지인 스테인버그(Steinberg) 인공 배지에 포함되는 성분과 농도를 나타낸 것이다. 표 1에 나타나는 바와 같이 인공 배지는 총 5개의 스톡 용액(Stock solution)을 포함하며, 각각의 스톡 용액은 좀개구리밥의 배양에 필요한 무기 성분 내지 유기 성분을 포함하는 용액으로 구성된다.
스톡 용액 구분 스톡 용액을 구성하는
성분의 종류		 스톡 용액내에서의 구
성 성분의 농도(g/ℓ)		 인공 배지 1리터당 스
톡 용액이 차지하는
부피(㎖/ℓ)
Ⅰ KNO3 17.5 20
K2HPO4 4.5
KH2PO4 0.63
Ⅱ MgSO47H2O 5 20
Ⅲ Ca(NO3)24H2O 14.75 20
Ⅳ H3BO₃ 0.12 1
ZnSO47H2O 0.18
Na2MoO42H2O 0.044
MnCl24H2O 0.18
Ⅴ FeCl36H2O 0.76 1
Na2-EDTA2H2O 1.5
(2) 좀개구리밥의 배양
전처리 배양된 좀개구리밥을 24웰 플레이트에 넣고 뚜껑을 닫아 배양기에 옮겨 넣은 후, 다양한 광 조사량, 배양액의 pH , 배양액의 염분 농도 및 배양 온도 조건하에서 배양하였다. 72시간 배양이 끝난 후 좀개구리밥을 암흑 상태에서 15분간 적응시키고, 형광 측정 장치(Imaging pulse-amplitude-modulated fluorometer; Imaging PAM; Walz Co., Erlangen, Germany)를 사용하여 각 웰 내에서 배양된 좀개구리밥의 유효 양자수율(Fv'/Fm')를 측정하였다. 구체적으로 암적응된 좀개구리밥에 약한 측정광을 비추어 암적응 상태에서의 초기형광값인 Fo를 측정하고, 이후 광 조사량이 6,000 μ㏖ photon/㎡·s인 포화광(Saturating Light)을 비추어 암적응 상태에서 포화광에 의한 최대형광값인 Fm을 측정하였다. 이후, 광 조사량이 55 μ㏖ photon/㎡·s인 연속광(Actinic Light, AL)을 비추어 좀개구리밥의 광합성을 유발하고, 연속광의 존재하에서 다시 포화광을 20초 간격으로 약 315초간 비추어 엽록소 형광 변화를 조사하였고, 엽록소 형광 변화가 안정화되었을 때의 형광 피크를 통해 광적응 상태에서 포화광에 의한 최대형광값인 Fm'와 광적응 후 정상상태 형광값인 Ft를 측정하였다. 측정된 Fm'와 Ft를 이용하여 하기 수학식 2로 표시되는 유효 양자수율를 구하였다.
[수학식 2]
Figure pat00004
상기 수학식 2에서 Fv' = Fm' - Ft
도 4는 다양한 배양 조건에서의 좀개구리밥의 엽록소 형광 특성인 유효 양자수율을 나타낸 그래프이다. 좀개구리밥의 엽록소 형광 특성인 유효 양자수율을 최대화하는 좀개구리밥의 최적 배양 조건을 살펴보면, 배양 온도는 15~30℃, 바람직하게는 25~30℃이었고, 광 조사량은 10~210 μ㏖ photon/㎡·s, 바람직하게는 10~120 μ㏖ photon/㎡·s 이었고, 배양액의 염분 농도는 0~4‰, 바람직하게는 0~2‰이었고, 배양액의 pH는 4~10, 바람직하게는 5~8이었다.
2. 좀개구리밥의 엽록소 형광 특성을 이용한 단일 금속류 독성 물질 용액의 수질 독성 평가
(1) 단일 금속류 독성 물질 용액의 준비
단일 금속류 독성 물질로 각각 은(Ag), 비소(As), 카드뮴(Cd), 6가 크롬(Cr6 +), 수은(Hg), 및 니켈(Ni)을 포함하는 독성 물질 용액(pH는 7±0.2로 조정함)을 준비하였다. 또한, 상기 독성 물질 용액을 반수 희석법에 의해 Steinberg 인공 배지로 희석하여 초기 농도의 50%, 25%, 12.5%, 6.25%로 희석된 독성 물질 용액을 준비하였다. 또한, 대조군 용액으로는 독성 물질을 포함하지 않는 Steinberg 인공 배지(인공 배지의 pH 는 7±0.2임)를 사용하였다.
(2) 좀개구리밥의 배양
24웰 플레이트의 웰에 대조군 용액, 독성 물질 용액, 및 희석된 독성 물질 용액을 넣고, 여기에 좀개구리밥(Lemna paucicostata)을 넣은 후 24웰 플레이트를 배양기에 옮겨 넣었다. 이후 90~100 μ㏖ photon/㎡·s의 광 조사량 및 25℃의 온도에서 72시간 동안 배양하였다.
(3) 좀개구리밥의 엽록소 형광 특성 측정
72시간 배양이 끝난 후 좀개구리밥을 암흑 상태에서 15분간 적응시키고, 형광 측정 장치(Imaging pulse-amplitude-modulated fluorometer; Imaging PAM; Walz Co., Erlangen, Germany)를 사용하여 각 웰 내에서 배양된 좀개구리밥의 유효 양자수율(Fv'/Fm')를 측정하였다. 구체적으로 암적응된 좀개구리밥에 약한 측정광을 비추어 암적응 상태에서의 초기형광값인 Fo를 측정하고, 이후 광 조사량이 6,000 μ㏖ photon/㎡·s인 포화광(Saturating Light)을 비추어 암적응 상태에서 포화광에 의한 최대형광값인 Fm을 측정하였다. 측정된 Fm과 Fo를 이용하여 하기 수학식 1로 표시되는 최대 양자수율을 구하였다.
[수학식 1]
Figure pat00005
상기 수학식 1에서 Fv = Fm - Fo
이후, 광 조사량이 55 μ㏖ photon/㎡·s인 연속광(Actinic Light, AL)을 비추어 좀개구리밥의 광합성을 유발하고, 연속광의 존재하에서 다시 포화광을 20초 간격으로 약 315초간 비추어 엽록소 형광 변화를 조사하였고, 엽록소 형광 변화가 안정화되었을 때의 형광 피크를 통해 광적응 상태에서 포화광에 의한 최대형광값인 Fm'와 광적응 후 정상상태 형광값인 Ft를 측정하였다. 측정된 Fm'와 Ft를 이용하여 하기 수학식 2로 표시되는 유효 양자수율를 구하였다.
[수학식 2]
Figure pat00006
상기 수학식 2에서 Fv' = Fm' - Ft
도 5는 단일 금속류 독성 물질 농도에 따른 좀개구리밥의 엽록소 형광 특성인 유효 양자수율을 나타낸 그래프이고, 도 6은 단일 금속류 독성 물질 농도에 따른 좀개구리밥의 엽록소 형광 특성인 최대 양자수율을 나타낸 그래프이다. 도 6에서 보이는 바와 같이 좀개구리밥의 엽록소 형광 특성인 유효 양자수율은 일정 범위에서 금속류 독성 물질의 농도와 선형 관계를 나타내었다. 또한, 도 5 및 도 6에서 보이는 바와 같이 좀개구리밥의 엽록소 형광 특성 중 유효 양자수율이 최대 양자수율보다 독성 물질에 대해 훨씬 민감한 결과를 보였다.
(4) 좀개구리밥의 엽록소 형광 특성을 이용한 단일 금속류 독성 물질의 수질 독성 판단
도 5 내지 도 6에 표시된 좀개구리밥의 엽록소 형광 특성인 유효 양자수율 내지 최대 양자수율을 기준으로 단일 금속류 독성 물질의 반수 유효 농도(EC50) 내지 무영향 농도(NOEC)를 계산하였다. 이때 EC50 값은 점예측기법(point estimation techniques)을 써서 계산하였고, NOEC 값은 Dunnett 과정과 같은 가설 검정 방법을 써서 계산하였다. 표 2는 좀개구리밥의 엽록소 형광 특성인 유효 양자수율(Fv'/Fm')과 최대 양자수율(Fv/Fm)을 수질 독성 평가 기준으로 하였을 때의 단일 금속류 독성 물질의 반수 유효 농도(EC50) 내지 무영향 농도(NOEC)를 나타낸 것이다.
금속류 독성 물질 유효 양자수율(Fv'/Fm') 기준 최대 양자수율(Fv/Fm) 기준
NOEC(㎎/L) EC50(㎎/L) NOEC(㎎/L) EC50(㎎/L)
Ag 0.0625 0.1803 > 0.5 > 0.5
As < 0.03125 0.1201 < 0.03125 0.17
Cd < 0.75 2.6525 > 12 > 12
Cr6 + 0.15625 4.0895 0.3125 4.9203
Hg 0.03125 0.7619 > 4 > 4
Ni < 0.75 4.521 0.75 8.7096
표 2에서 보이는 바와 같이 좀개구리밥의 엽록소 형광 특성인 유효 양자수율(Fv'/Fm')을 수질 독성 평가 기준으로 하였을 때 최대 양자수율(Fv/Fm)을 수질 독성 평가 기준으로 하였을 때보다 단일 금속류 독성 물질에 대한 반응 민감성이 훨씬 높게 나타났다.
상기의 실시예에서는 비록 성분과 농도가 특정된 독성 물질에 의한 수질 독성을 평가하였으나, 미지의 독성 물질을 포함하는 수체 샘플에 변형되어 실시될 수 있고, 그때의 EC50 값이나, NOEC 값을 통해 미지의 독성 물질이 수질에 미치는 영향을 파악할 수 있음은 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명하다 할 것이다.

Claims (10)

  1. (a) 측정용 용기에 수체 샘플을 넣는 단계;
    (b) 수체 샘플을 함유하는 측정용 용기에 좀개구리밥을 투입하는 단계;
    (c) 측정용 용기에 투입된 좀개구리밥을 배양하는 단계; 및
    (d) 배양이 완료된 좀개구리밥의 엽록소 형광 특성으로 하기 수학식 2로 표시되는 유효 양자수율을 측정하는 단계;를 포함하는 수질 독성 평가 방법.
    [수학식 2]
    Figure pat00007

    상기 수학식 2에서 Fv' = Fm' - Ft이고, Fm'는 광적응 상태에서 포화광에 의한 최대형광값을 의미하고, Ft는 광적응 후 정상상태 형광값을 의미한다.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 수체 샘플은 원수 및 희석 배수가 서로 다른 적어도 2개 이상의 희석 원수로 구성되고
    상기 희석 원수는 원수를 스테인버그(Steinberg) 인공 배지로 희석하여 제조된 것을 특징으로 하는 수질 독성 평가 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 희석 원수는 반수 희석법에 의해 희석되는 것을 특징으로 하는 수질 독성 평가 방법.
  4. 제 2항에 있어서, 상기 수체 샘플은 원수의 대조군으로 좀개구리밥의 광합성 효율을 저해하는 독성 물질을 포함하지 않는 배양액을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 수질 독성 평가 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 독성 물질은 은(Ag; Silver), 알루미늄(Al; Aluminum), 비소(As; Arsenic), 카드뮴(Cd; Cadmium), 코발트(Co; Cobalt), 크롬(Cr; Chromium), 구리(Cu; Copper), 철(Fe; Iron), 수은(Hg; Mercury), 니켈(Ni; Nickel), 납(Pb; Lead), 및 아연(Zn; Zinc)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 금속류인 것을 특징으로 하는 수질 독성 평가 방법.
  6. 제 4항에 있어서, 상기 대조군은 스테인버그(Steinberg) 인공 배지인 것을 특징으로 하는 수질 독성 평가 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 수체 샘플은 pH가 4~10으로 조정되는 것을 특징으로 하는 수질 독성 평가 방법.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 수체 샘플은 염분 농도가 4‰ 이하로 조정되는 것을 특징으로 하는 수질 독성 평가 방법.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 배양시 광 조사량은 10~250 μ㏖ photon/㎡·s 인 것을 특징으로 하는 수질 독성 평가 방법.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 배양시 배양 온도는 15~35℃인 것을 특징으로 하는 수질 독성 평가 방법.
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KR102292115B1 (ko) * 2020-08-19 2021-08-20 (주)케이컴퍼니 원수 독성 검사 장치 및 그 제어 방법

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