CN116855403A - 降解聚氯乙烯的芽孢杆菌pvc-6b及其生产的菌剂与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物技术领域，公开了一株降解聚氯乙烯的芽孢杆菌PVC‑6B，以及利用该株细菌生产的降解菌剂，和其在生物降解聚氯乙烯中的应用。该株细菌于2023年2月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2023115，分类名：Bacillus sp.PVC‑6B。该株细菌及其菌剂能够以无添加PVC为唯一碳源生长，并对PVC进行解聚，可通过发酵罐进行大量生产，生产成本低、使用方便，对缓解环境中PVC废弃物污染具有应用潜力。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一株降解聚氯乙烯的细菌，具体为芽孢杆菌PVC-6B(Bacillus sp.PVC-6B)，以及利用该株细菌生产的降解菌剂，和其在生物降解聚氯乙烯中的应用。
背景技术
聚氯乙烯(Polyvinyl chloride,PVC)是由氯乙烯单体聚合而成的高分子材料，具有较好的阻燃性和化学稳定性，且经改性具有优良的综合性能，已成为了世界第三大通用塑料，常被用作包装材料、管材和板材等。我国的PVC等塑料年产量更是位于全球首位，并且在逐年增长。
环境中大量积累的塑料废弃物的处理方式得到国际社会的广泛关注。微生物种类多、分解代谢能力强，是生态环境中物质循环的重要推动者。因此，筛选和制备PVC塑料降解细菌具有非常大的应用前景。
发明内容
本发明提供了一株聚氯乙烯的芽孢杆菌PVC-6B，该细菌从喂食了PVC的黄粉虫幼虫肠道中分离，命名为Bacillus sp.strain PVC-6B，能以无添加剂的PVC为唯一碳源生长并将其降解。通过凝胶渗透色谱检测到菌株能使PVC的数均、重均和z均分子量均有所下降；通过红外光谱检测到细菌使PVC膜表面产生了新的羟基和碳碳双键吸收峰；在原子力显微镜下观察到降解菌能够在PVC膜表面造成“腐蚀坑”；细菌处理后的PVC膜水接触角减小，表明其亲水性增加。从而在微生物水平和高分子材料两方面证明细菌Bacillus sp.PVC-6B降解和解聚PVC的能力。
本发明还提供了利用该株细菌生产的降解菌剂，和其在生物降解聚氯乙烯中的应用。
本发明的技术方案如下：
本发明公开了一株一种PVC降解细菌(Bacillus sp.PVC-6B)，其于2023年2月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC M 2023115，分类名：Bacillussp.PVC-6B(芽孢杆菌PVC-6B)，拉丁文学名：Bacillus sp.，保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内,第一附小对面，中国典型培养物保藏中心。
本发明还公开了芽孢杆菌PVC-6B在生物降解聚氯乙烯中的应用。
在本发明的一具体实施例，所述的芽孢杆菌PVC-6B在降解聚氯乙烯塑料中的应用。
在本发明的另一具体实施例，所述的聚氯乙烯塑料为聚氯乙烯塑料粉末、颗粒或者膜片。
本发明还公开一种利用上述的芽孢杆菌PVC-6B生产的降解菌剂。
本发明公开的一种制备上述的降解菌剂的方法，包括以下步骤：
(1)挑上述的芽孢杆菌PVC-6B至LB平板培养基活化，制得一级种子液，将此种子液扩大培养，得到发酵菌种；
(2)将此发酵菌种于发酵罐中培养5h，培养过程中无菌空气的通气量不小于3vvm，搅拌速度不低于400rpm，培养温度25～30℃，发酵完成后将菌体通过干燥制成粉剂。
本发明还公开了一种上述的降解菌剂在生物降解聚氯乙烯中的应用。
在本发明的一具体实施例，所述的降解菌剂在降解聚氯乙烯塑料粉末、颗粒或者膜片中的应用。
本发明还公开了一种用于降解聚氯乙烯塑料的方法，该方法包括培养上述的芽孢杆菌PVC-6B或上述的降解菌剂，将待降解的PVC塑料与菌株培养液或培养物接触。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
(1)本发明涉及的Bacillus sp.PVC-6B能够以无添加PVC为唯一的碳源生长；经过菌株PVC-6B处理后，PVC的分子量发生广泛的下降，并对PVC膜表面造成氧化、产生腐蚀坑，同时PVC的亲水性显著增加。丰富了此方面微生物资源库。
(2)本发明涉及的芽孢杆菌PVC-6B为原核生物，易于遗传操作，预期可在分子生物学水平揭示生物降解PVC的机理。
(3)本发明的降解菌剂可通过发酵罐进行大量生产，生产成本低、使用方便，微生物降解是一种环境友好型的处理方法，对缓解环境中PVC废弃物污染具有应用潜力。
附图说明
图1为本发明的一实施例菌株Bacillus sp.PVC-6B以PVC为唯一碳源的生长曲线图。
图2为本发明的一实施例经菌株Bacillus sp.PVC-6B处理PVC膜30天后，PVC膜分子量变化的柱状图。
图3为本发明的一实施例经菌株Bacillus sp.PVC-6B处理PVC膜30天后，PVC膜表面的红外光谱图。
图4为本发明的一实施例经菌株Bacillus sp.PVC-6B处理PVC膜30天后，PVC膜表面的原子力显微镜图。
图5为本发明的一实施例经菌株Bacillus sp.PVC-6B处理PVC膜30天后，PVC膜表面的水接触角变化示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应该理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限定本发明的保护范围。在实际应用中本领域技术人员根据本发明做出的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
PVC降解菌Bacillus sp.PVC-6B的筛选和制备及其生长特性检测
一、PVC降解菌Bacillus sp.PVC-6B的筛选和制备
向黄粉虫幼虫喂食聚氯乙烯PVC粉末，期间每隔3天喷洒适量超纯水保持湿度，3周后以15条黄粉虫为一组将其于蜡盘中解剖，取其中肠置于5mL生理盐水中，充分振荡后将肠道菌群悬液加入100mL液体无碳源基本培养基(liquid carbon free basal medium,LCFBM,内含0.7g/L KH2PO4,0.7g/LK2HPO4,0.7g/L MgSO4·7H2O,1.0g/L NH4NO3,0.005g/LNaCl,0.002g/LFeSO4·7H2O,0.002g/L ZnSO4·7H2O,0.001g/L MnSO4·H2O)中，同时加入无菌PVC粉末(1％,w/v)，在30℃，180rpm条件下进行富集培养，每隔30天取1mL富集液转入新的包含无菌PVC粉末的LCFBM中继续进行富集，重复10次富集培养之后，即得PVC降解菌群悬液。
然后将此菌群悬液于LB平板培养基(5g/L酵母粉，10g/L蛋白胨，10g/L氯化钠，1.5％(w/v)琼脂粉)上稀释涂布、划线分离，直至平板上形成形态均一的单菌落。挑取一个单菌落接种至LB培养基中培养至对数期，使用40％(v/v)的甘油保种，并使用通用引物对27F/1492R扩增其16S rRNA基因进行菌种鉴定，其基因序列如SEQ ID No.1所示，最终获得PVC降解单菌Bacillussp.PVC-6B。
二、PVC降解菌Bacillus sp.PVC-6B生长特性检测
挑PVC-6B单菌落于5mL LB液体培养基中活化，于30℃，180rpm培养至对数期(OD600约为0.8)。5mL新鲜菌液全部8000×g离心10min，弃上清，加2mL LCFBM重悬清洗两次，以1％(v/v)的接种量接种至100mL LCFBM中，并加入1％(w/v)的PVC粉末作为唯一碳源，于30℃，180rpm摇床中进行培养，使用分光光度计在30天内对OD600进行测定，并绘制生长曲线。以不添加底物作为阴性对照。如图1所示，阴性对照strain PVC-6B的OD600在17天内几乎没有变化，而处理组strain PVC-6B+PVC的OD600从0.01生长到0.04左右，数值增长4倍，说明菌株能以PVC为唯一碳源生长。
实施例2
菌株PVC-6B处理PVC塑料膜
PVC薄膜制备：向100mL环己酮中加入3g实施例1中的PVC粉末，不断搅拌至PVC彻底溶解。取20mL溶液滴加在直径90mm的玻璃培养皿中，静置一周至溶剂挥发即成PVC塑料薄膜。用镊子将膜从皿底揭下，于玻璃容器中室温下保存。以上操作均在通风橱中进行。
使用如实施例1中所述方法制得5mL PVC-6B活化的菌液，加2mL LCFBM重悬清洗两次，最后加400μL LCFBM重悬。将菌悬液滴加在液体无碳源基本培养基SCFBM(LCFBM中加1.5％(w/v)琼脂粉配制)上，在表面覆盖7-8片正反面均紫外灭菌20min以上的PVC塑料膜，30℃培养箱正向放置待菌液吸收，再倒置培养30天。以不加菌群孵育作为阴性对照。
测试前将PVC膜轻轻从培养基上接下来，置于玻璃培养皿中，先加2％SDS溶液5mL浸泡30min，以充分去除黏附在塑料表面的微生物，再用75％乙醇(v/v)、蒸馏水反复冲洗塑料膜的正反面，室温下自然风干后用于一系列检测实验。
实施例3
生物处理后的PVC塑料膜表征分析
一、凝胶渗透色谱分析
通过凝胶渗透色谱(Gel Permeation Chromatography,GPC)检测分子量变化是评价聚合物解聚和降解的重要度量。裁剪处理好的PVC膜约10mg，在10mL四氢呋喃中充分溶解，0.22μm尼龙过滤器过滤。使用HLC-8320GPC(Tosoh Corp,Japan)分析PVC膜的分子量分布。凝胶渗透色谱仪包含一个RI检测器，检测条件为Pol(+),Res(0.5s)，一个色谱柱(TSK凝胶Super Multi pore HZ-M(21488))和一个保护柱(TSK保护柱Super Multi pore HZ-M(21489))。以四氢呋喃为洗脱剂，用色谱柱分离。柱平衡后，流速为0.35mL/min，温度为40℃，过滤后的溶液(20μL)注入色谱柱进行分析。采用Tosoh Corp.的PS Quick MP-M公司的聚苯乙烯(266Da、370Da、474Da、5.97kDa、96.4kDa和706kDa)的重均分子量(Mw)进行标准曲线的校正。分子量数值如图2所示，与没有加菌处理的阴性对照Control相比，处理组PVC-6B的数均分子量Mn和重均分子量Mw均减少了约1kDa，z均分子量Mz减少了约2kDa，说明菌株能对PVC造成轻微的解聚。
二、红外光谱检测
通过红外光谱仪检测PVC塑料膜表面的氧化程度。将彻底干燥的PVC塑料膜使用红外光谱仪观察表面的基团组成，采用衰减全反射(Attenuated Total Refraction,ATR)模式，波长范围为4,000-500cm-1，累积32次扫描，分析软件为OMNIC(8.2.387版本)。红外光谱图如图3所示，与没有加菌处理的阴性对照Control相比，处理组PVC-6B分别在3300cm-1和1700cm-1附近产生了新的羟基峰和碳碳双键峰，说明菌株能够氧化PVC塑料膜表面，在600cm-1左右的碳氯键峰减弱，说明PVC在菌株的作用下发生了脱氯反应，由此看出菌株PVC-6B能够在PVC膜表面起降解反应。
三、原子力显微镜观察
采用原子力显微镜可以较为直观地观察细菌对PVC塑料薄膜表面的侵蚀与破坏程度。用2％(w/v)SDS溶液清洗PVC膜表面以彻底去除细菌菌体及其分泌物，接着用75％酒精浸泡PVC膜10min，再在其表面滴加100μL蒸馏水并用洗耳球吹干。室温干燥过夜后，使用原子力显微镜以1Hz的扫描速度对PVC塑料膜表面进行探针扫描，分析软件为Gwyddion(2.59.win64版本)。探针扫描生成的三维照片如图4所示，没有加菌处理的阴性对照Control表面分布较为均一，没有明显的起伏变化，而处理组PVC-6B表面出现了凹坑、粗糙度增加，是菌株在PVC膜表面腐蚀的结果。
四、水接触角测试
水接触角是表征材料表面亲疏水性的参数，可以通过光学视频接触角仪器在室温下测量的。将PVC膜使用2％ SDS溶液和无菌水彻底清洗后于室温下过夜干燥，用洗耳球将膜表面吹干，然后在PVC表面滴加5μL去离子水，每个PVC膜上选择3个不同的位置测量接触角的大小。如图5所示，经菌株PVC-6B处理过后，塑料膜表面的水接触角比阴性对照Control减少了约20°，说明菌株使PVC表面的亲水性增强，这是由增加的含氧基团和粗糙度所造成的，间接验证了菌株的降解作用。
实施例4
菌株PVC-6B降解菌剂的制备
将菌株PVC-6B划线活化培养出单菌落，挑单菌落至5mL LB活化制得一级种子液。将种子液按1％体积比接种于150mL LB培养基中，于30℃，180rpm振荡培养至对数期，制得发酵菌种。
将上述制得的发酵菌种按5％体积比接种于发酵罐的3L培养基中，培养过程中无菌空气的通气量3vvm，搅拌速度400rpm，培养温度30℃，培养时间5h，发酵完成后收菌、离心弃上清，将菌体通过干燥制成粉剂。
其中制备种子液和发酵菌种的培养基和发酵罐中的培养基培养相同，均为LB培养基，即胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，蒸馏水溶解、调pH＝7.2-7.4，定容至于1000mL后，121℃灭菌20min.
以本发明实施例4制备的菌剂，直接与聚氯乙烯塑料反应，同样可以有效达到实施例2和3的效果。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。
PVC-6B的16S rRNA基因序列，如SEQ ID No.1所示
Claims (9)
1.一株降解聚氯乙烯的芽孢杆菌PVC-6B，其特征在于，其于2023年02月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2023115。
2.如权利要求1所述的芽孢杆菌PVC-6B在生物降解聚氯乙烯中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的芽孢杆菌PVC-6B在降解聚氯乙烯塑料中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的聚氯乙烯塑料为聚氯乙烯塑料粉末、颗粒或者膜片。
5.一种利用权利要求1所述的芽孢杆菌PVC-6B生产的降解菌剂。
6.一种制备权利要求5所述的降解菌剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)挑权利要求1所述的芽孢杆菌PVC-6B至LB平板培养基活化，制得一级种子液，将此种子液扩大培养，得到发酵菌种；
(2)将此发酵菌种于发酵罐中培养5h，培养过程中无菌空气的通气量不小于3vvm，搅拌速度不低于400rpm，培养温度25～30℃，发酵完成后将菌体通过干燥制成粉剂。
7.一种权利要求6所述的降解菌剂在生物降解聚氯乙烯中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的降解菌剂在降解聚氯乙烯塑料粉末、颗粒或者膜片中的应用。
9.一种用于降解聚氯乙烯塑料的方法，其特征在于，该方法包括培养如权利要求1所述的芽孢杆菌PVC-6B或权利要求5所述的降解菌剂，将待降解的PVC塑料与菌株培养液或培养物接触。
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