CN109112085A - 一种假柠檬酸杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种假柠檬酸杆菌及其应用，具体涉及一种假柠檬酸杆菌及其在木质素和染料降解中的应用，属于微生物技术领域，本发明所述的假柠檬酸杆菌MP‑4，于2018年04月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.15574，来源于巴基斯坦小白蚁肠道；该细菌能够以碱木质素、亚甲基蓝、天青B、苯酚红、刚果红或苯胺蓝为唯一碳源的无机盐培养基上生长，并且该菌具有降解木质素和使得染料脱色降解的能力；经试验验证，假柠檬酸杆菌MP‑4可对木质素进行有效降解，并且在短时间内对碱木质素和多种染料的降解率在80%以上，此菌可以应用于造纸、印染、纺织等行业废水处理。

Description

一种假柠檬酸杆菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一种假柠檬酸杆菌及其应用，具体的，涉及一种假柠檬酸杆菌及其在木质素和染料降解中的应用。
背景技术
木质素是全球储量较为丰富的生物质之一，在生物质能源领域及生物材料领域具有巨大的应用价值。木质素结构是由芳香族化合物通过多种不同类型化学键（如：醚键、碳碳键等）链接而成的无定型芳香性高聚物，从而造成其难降解的特性。由于木质素特殊的结构及性质，使其广泛应用于工业、农业和医药等行业领域。我国制浆造纸工业每年大约产生5000万吨的副产品—木质素，大部分随废水直接排放，从而造成很大的资源浪费及环境污染。因此，通过合理有效的方法将木质素转化为高附加值的化学品，对农、林、工业经济发展和环境治理保护都具有实际意义。
目前，木质素降解主要采用物化法、化学法和生物法，其中物理和化学法所需均为大型设备、技术成本高、效率低以及存在二次污染的缺陷，然而微生物处理方法具有操作简单、成本低、无二次污染等优点，微生物法被认为是绿色环保的技术。微生物降解法不仅可以缓解环境污染，并且特别种类微生物还可以利用木质素为碳源生产油脂或生物塑料前体聚羟基脂肪酸酯，亦或者通过调控解聚途径生成高附加值的芳香族化合物，从而实现废物资源再利用。木质素的完全降解普遍认为是真菌、细菌等多种微生物相互作用的结果，其中真菌（如：白腐菌和褐腐菌等）降解木质素的研究较多，但由于真菌在蛋白表达和基因操纵等方面存在很大的挑战，至今未能利用真菌开发出一种能够商业化应用的木质素生物降解技术。近些年来越来越多的研究表明，细菌在液体基质中降解木质素展现出更多的优势和更广阔的应用前景。
自然界中细菌种类繁多，关于木质素降解菌报道较多的细菌种类，如下假单胞菌(Pseudomonas)、红球菌属(Rhodococcus)、丛毛单胞菌属（Comamonas）、贪铜菌属(Cupriavidus)、诺卡氏菌属(Nocardia)、鞘脂菌属(Sphingobium)、芽孢杆菌属(Bacillum)、新鞘氨醇杆菌属（Novosphingobium）等，但据文献报道显示它们环境（比如：温度、体系pH等）适应能力较差；因此，筛选环境适应能力强的细菌成为目前研究热点。自然界中存在许多天然的木质素生物转化系统，比如：食木白蚁可以高效降解木质素，与其肠道内共生微生物有着密不可分的关系；经研究发现白蚁肠道内寄居着大量形态和密度都不同的细菌，后肠和混合节中细菌数量可达 10-5~10-11个/mL，并且据相关研究报道有的白蚁种类肠道微环境属于极端环境，如后肠是pH 8~10的碱性环境。在白蚁肠道共生菌降解木质素方面已有报道的细菌，如下肠杆菌属（Enterobacter）、特拉布尔西氏菌属（Trabulsiella）、伯克氏菌属（Burkholderia）和不动杆菌属（Acinetobacter）等。相关研究表明上述这些细菌适应环境能力较弱，比如：生长pH一般在6.0~7.5之间，或需要添加其他碳源促进生长。
不同来源及不同属种的细菌在木质素降解途径方面具有较大差异性，所呈现的降解机制也不尽相同。因此，筛选不同类型细菌，尤其是筛选环境适应能力强、广谱性的细菌；对消除水体中存在种类繁多的芳香族化合物这一难题，具有深远的科学研究价值及现实应用意义。从食木白蚁肠道中筛选环境适应能力强并可降解木质素的共生细菌，可以丰富木质素降解菌种资源。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的缺陷，而提供一种能高效降解木质素和脱色偶氮染料的假柠檬酸杆菌，在废弃物资源再利用及造纸、印染废水处理等方面具有较大潜力。
为了达到上述技术目的，本发明通过以下技术方案实施：
本发明提供一株假柠檬酸杆菌（Pseudocitrobactersp.）MP-4，于2018年04月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.15574。
本发明所述假柠檬酸杆菌（Pseudocitrobactersp.）MP-4来源于西双版纳热带雨林采集的巴基斯坦小白蚁肠道，具有如下的形态和生理生化特性：采用常规细菌生理生化鉴定方法和显微镜观察，为革兰氏阴性杆状细菌，主要的生理生化特征兼性厌氧，具有运动性，脲酶、氧化酶阴性，吲哚和H2S试验阴性。
所述假柠檬酸杆菌（Pseudocitrobactersp.）MP-4的16S rRNA基因序列，如SEQ IDNO.1所示）：
SEQ ID NO.1：
CCCGGGGCGGGCGGCCTACACATGCAGTCGAACGGTAACAGAAAGCAGCTTGCTGCTTTGCTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCGGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGAGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCACAGCAATTGACGTTACTCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTTGAAACTGGCAAGCTTGAGTCTCGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACGAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGGGAACTTTGCAGAGATGAATTGGTGCCTTCGGGAACCGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTAGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCATATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTATGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTACCACTTTGTTTCAGT
所述假柠檬酸杆菌（Pseudocitrobactersp.）MP-4的培养条件：pH 5.0~9.0，优选pH7.5左右；温度20~40℃，优选30℃；转速100~200 rpm，优选180 rpm。
所述假柠檬酸杆菌（Pseudocitrobactersp.）MP-4应用于降解木质素，按照以下步骤进行：
用接种环挑取MP-4单菌落，接入到装有3-5 mL的LB培养基试管中培养；在温度为30℃，转速为150 rpm的条件下培养，至细菌在600 nm的吸光度达到1.0左右；将菌液离心，冲洗，按照接种量为1~5%（体积比）接入含有200 mL碱木质素的液体无机盐培养基的三角瓶中，在培养温度为30℃，转速为180 rpm的条件下震荡培养；其中碱木质素浓度为0.1~1 g/L；培养4-7天后，培养基经离心去除杂质后，冷冻干燥，取样品进行后续SEM和FTIR分析表征。
所述含有碱木质素的液体无机盐培养基的成分和含量如下：
碱木质素：1g、 K2HPO4：1g、KH2PO4 ：1g、(NH4)2SO4：2g、MgSO4：0.2g、
CaCl2：0.1g、FeSO4：0.05g、MnSO4：0.02g、CuSO4：0.001g、ZnSO4：0.001g、
蒸馏水1000mL、pH 7.0~7.5。
固体培养基为上述碱木质素培养基中加入15g/L的琼脂。
所述假柠檬酸杆菌（Pseudocitrobactersp.）MP-4应用于多种染料脱色降解，按照以下步骤进行：
将实验室保存的菌株MP-4，用接种环挑取单菌落，接入到装有3~5 mL的LB培养基试管中培养；在温度为30℃，转速为150 rpm的条件下培养，至细菌在600 nm的吸光度达到1.0左右；将菌液离心，冲洗，按照接种量为1~5%（体积比）接入200 mL含有染料的液体无机盐培养基中，在培养温度为30℃，转速为180 rpm的条件下震荡培养24~72小时；其中亚甲基蓝、天青B、苯酚红、刚果红和苯胺蓝浓度为100 mg/L。
所述含有染料的液体无机盐培养基为：含有碱木质素液体无机盐培养基中的碳源（碱木质素）更换为0.1g/L 的亚甲基蓝、天青B、苯酚红、刚果红或苯胺蓝；再添加0.02g/L辅助碳源（酵母粉或葡萄糖）。
本发明提供的假柠檬酸杆菌（Pseudocitrobactersp.）MP-4对碱木质素和染料具有高效降解作用，并且该菌与所筛选其他属可降解木质素细菌（Enterobacter、Trabulsiella、Comamonas、Burkholderia和Acinetobacter等）相比，生长速度快，培养基成分简单，环境适应性强，可以在pH 5.0~9.0，温度20~40℃范围内生长。该细菌可应用于造纸，生物质能源，纺织废水处理等环保领域，利用其高效降解性能进而解决木质素和染料在工业中降解难度大的问题。
附图说明
图1 是菌株MP-4基于16S rRNA构建的系统发育图。
图2是菌株MP-4在亚甲基蓝、天青B、苯酚红、刚果红和苯胺蓝脱色效果图。
图3是菌株MP-4降解碱木质素的扫描电镜图。
图4是菌株MP-4对木质素降解前后FTIR对比效果图。
具体实施方式
下面结合部分实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：菌株筛选及生物学鉴定
本发明所述的具有木质素解聚和多种染料脱色能力的假柠檬酸杆菌（Pseudocitrobactersp.）MP-4，于2018年04月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.15574；是本实验室从云南省中国科学院西双版纳热带植物园采集的巴基斯坦小白蚁（Microtermes pakistanicus）肠道中分离纯化而得到。
本发明中所述的含有碱木质素的液体无机盐培养基的成分和含量如下：
碱木质素：1g、 K2HPO4：1g、KH2PO4 ：1g、(NH4)2SO4：2g、MgSO4：0.2g、
CaCl2：0.1g、FeSO4：0.05g、MnSO4：0.02g、CuSO4：0.001g、ZnSO4：0.001g、蒸馏水1000mL、pH 7.0~7.5。
所述含有染料的液体无机盐培养基为：碱木质素培养基中的碳源更换为0.1g/L的亚甲基蓝、天青B、苯酚红、刚果红或苯胺蓝；再添加0.02g/L辅助碳源（酵母粉或葡萄糖）。
固体培养基为上述培养基中加入15g/L的琼脂。
具体方法如下：
（1）筛选木质素降解菌：
取30头左右白蚁放入无菌EP管中，用75%（v/v）乙醇表面消毒灭菌3 min~5 min 后，然后经无菌磷酸盐缓冲液清洗，去除头部，用镊子抽取白蚁肠道并收集于无菌生理盐水（0.8%，v/v）中，倒入匀浆器中充分研磨，即得到白蚁肠道匀浆。将肠道匀浆分别稀释10-1、10-2、10-3，涂布于以碱木质素为唯一碳源的固体培养基的培养皿上，置于 30℃恒温培养箱中进行培养，待菌落长出后，再用接种环挑单菌落进行LB液体培养，待长出菌体后，继续涂布于含有碱木质素的固体培养基上，以上分离纯化重复操作3~5次，直至获得各种菌株的纯培养。
（2）菌株鉴定：
分离并保存筛选菌株：将木质素固体培养基生长良好的单克隆菌株转接至LB培养基中，30℃，150rpm，12h条件下培养，待培养结束-80℃冻存菌株。
将纯化得到菌株MP-4进行形态和生理生化鉴定，结果如下：
菌落呈乳白色，表明光滑、边缘光滑，革兰氏阴性杆状细菌，兼性厌氧，具有运动性，脲酶、氧化酶阴性，可以利用葡萄糖、乳糖、棉籽糖产酸，可还原硝酸盐，吲哚和H2S试验阴性。
采用细菌基因组DNA试剂盒提取菌株基因组DNA，以菌株DNA为模板，采用细菌16SrRNA通用引物（27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；1492R：5’-GGTTACCTTGTTA- CGACTT -3’）扩增菌株16S rRNA片段，送至测序公司进行测序。将测序结果提交至NCBI的核酸数据库（www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast）进行Blast同源性比对，将测出的16S rRNA基因序列与GenBank中已登录的基因序列进行比对后用邻接法（Neighbor-Joining）构建系统发育树（如图1所示），可知该菌株与Pseudocitrobacter anthropi在同一分支，系统位置最接近；将该菌株鉴定为Pseudocitrobacter属，命名为假柠檬酸杆菌（Pseudocitrobactersp.）MP-4。
实施例2：Pseudocitrobactersp.MP-4对碱木质素的降解特性
将假柠檬酸杆菌（Pseudocitrobactersp.）MP-4单菌落接种于LB液体培养基中培养10~12小时，待菌液在OD600nm吸光度达到1.0时，将菌液离心，冲洗，以1~5%（v/v）的接种量转接入装有200mL含有碱木质素的液体无机盐培养基的锥形瓶中，在30℃，转速为120~200rpm的条件下震荡培养。经培养96小时后，采用紫外分光光度法测定木质素降解率，检测结果为85.6%。细菌处理后的木质素形貌，结果见图3所示，碱木质素特征峰强度变化情况见图4。
降解率的算法如下：降解率=（初始浓度-降解后浓度）/初始浓度
具体检测中，以超纯水为对照，利用紫外分光光度计全波长扫描确定木质素最大吸收波长为280nm左右。
由图3A所示，未经假柠檬酸杆菌（Pseudocitrobactersp.）MP-4处理的木质素，结构完整成致密圆形颗粒状；图3B所示，细菌处理后的木质素呈疏松片状，颗粒大小明显小于处理前的木质素。
由图4可知，降解前后的木质素特征峰发生明显变化，比如1596 cm-1、1513 cm-1、1455 cm-1 和1425 cm-1处的特征吸收峰强度明显降低和1374 cm-1处特征吸收峰消失，说明Pseudocitrobactersp. MP-4处理的碱木质素发生侧链氧化、去甲基化和芳香环骨架发生振动。1126 cm-1处特征吸收峰强度明显增强，是由于木质素中紫丁香基丙烷结构脱甲氧基变成为愈创木酚基结构。
综上所述结果充分说明，碱木质素经Pseudocitrobactersp. MP-4处理后，木质素结构发生解聚。
实施例3： Pseudocitrobactersp.MP-4对多种染料脱色能力
本实施例选用的染料与木质素结构存在一定的相似性，目前大多用它们证明所筛选细菌是否能够外分泌使木质素降解的相关酶（如：漆酶、过氧化物酶等），因此，有必要考察细菌MP-4对多种染料的脱色能力。
具体方法如下：将假柠檬酸杆菌（Pseudocitrobactersp.）MP-4单菌落接种于LB液体培养基中培养10~12小时，待菌液处于生长对数期时，用接种环蘸取菌液划线于含有亚甲基蓝、天青B、苯酚红、刚果红和苯胺蓝的固体无机盐培养基上，置于30℃培养箱中，培养4~7天，观察脱色情况，结果见图2所示。由图2可知，菌株MP-4在上述五种染料固体培养基上生长一段时间后，菌落周围会产生明显的脱色圈，表明此细菌可以分泌胞外酶使其发生脱色降解。
实施例4： Pseudocitrobactersp.MP-4对多种染料的脱色效果
将假柠檬酸杆菌（Pseudocitrobactersp.）MP-4单菌落接种于LB液体培养基中培养10-12小时，待菌液在OD600nm吸光度达到1.0时，将菌液离心，冲洗，以1~5%（v/v）的接种量转接入装有200mL的含有染料的液体无机盐培养基中，在好氧条件下培养，温度为30℃、转速150rpm，置于摇床中培养24~72小时。
用脱色率评价细菌的脱色能力：在200~800nm波长范围内扫描染料溶液，选取最大吸收峰M的波长作为染料吸收值的测定波长。将待测染料降解液在10000rpm下离心5min，取上清液测定吸光值；按照以下公式计算脱色率：
A0：染料培养基初始的吸光值；Ai：染料培养基培养一段时间后的吸光值
经实验验证，假柠檬酸杆菌（Pseudocitrobactersp.）MP-4经24~48小时培养后，测得培养48小时后亚甲基蓝、天青-B、苯酚红和刚果红的脱色率分别可达91.2%、96.3%、82.7%和80.8%以上，而培养24小时后苯胺蓝的脱色率可达96%，最高可达100%。
序列表
<110> 江苏大学
<120> 一种假柠檬酸杆菌及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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<212> DNA
<213> 假柠檬酸杆菌(Pseudocitrobacter sp.)
<400> 1
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<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (10)

1.一株假柠檬酸杆菌（Pseudocitrobactersp.）MP-4，于2018年04月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.15574。
2.根据权利要求1 所述的假柠檬酸杆菌（Pseudocitrobactersp.）MP-4，其特征在于，所述假柠檬酸杆菌（Pseudocitrobactersp.）MP-4的16S rRNA序列，如SEQ ID NO.1所示。
3.权利要求1 所述的假柠檬酸杆菌（Pseudocitrobactersp.）MP-4在生物降解和废水处理中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用为降解木质素。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，降解木质素包含以下步骤：将在600 nm的吸光度为1.0左右的假柠檬酸杆菌（Pseudocitrobactersp.）MP-4，按照体积比为1~5%的接种量接入含有碱木质素的液体无机盐培养基中，震荡培养。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的含有碱木质素的液体无机盐培养基中碱木质素浓度为0.1~1 g/L，培养基的pH 7.0~7.5。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用为染料的脱色降解。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述染料包括但不限于亚甲基蓝、天青B、苯酚红、刚果红或苯胺蓝。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，染料的脱色降解包含以下步骤：将在600nm的吸光度为1.0左右的假柠檬酸杆菌（Pseudocitrobactersp.）MP-4，按照体积比为1~5%的接种量接入含有染料的液体无机盐培养基中，震荡培养。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述含有染料的液体无机盐培养基中，亚甲基蓝、天青B、苯酚红、刚果红和苯胺蓝浓度为100 mg/L。
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