CN111593000B - 一株降解塑料地膜的克雷伯氏菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，涉及一株降解塑料地膜的克雷伯氏菌及其应用；一株降解塑料地膜的克雷伯氏菌是Klebsiella pneumoniaeN3‑2，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:M 20191054；保藏时间为2019年12月16日。本发明经过分离筛选得到降解菌N3‑2，降解时，使得聚乙烯塑料地膜和PBAT塑料地膜均达到较高的失重率，实现对聚乙烯塑料地膜和PBAT塑料地膜的高效降解，生产成本低，应用前景广阔。

Description

一株降解塑料地膜的克雷伯氏菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一种降解菌及其应用，尤其涉及一株降解塑料地膜的克雷伯氏菌及其应用。
背景技术
塑料产品由于成本低廉、不易腐烂和适用范围广泛等，在人类生活中被大量使用，但同时，自然环境中的塑料污染问题愈发严重，特别在农业中，塑料地膜应用广泛，在提高农业产量的同时也使农田中产生了严重的白色污染问题。
现阶段，对废弃塑料的处置方式大多为填埋、焚烧、二次加工等，这些处理方式对环境的污染较大，处理成本高；相比而言，生物菌种对塑料进行降解的过程具有降解条件温和及降解产物无污染的特点，对环境比较友好，目前关于塑料地膜的降解方法还较少并且效果大多不太理想；同时关于地膜的降解菌种资源还较少。
传统聚乙烯塑料地膜是目前农田中应用最为广泛的地膜，但其降解性较低，对聚乙烯的降解一直以来都是难以攻克的难题，因此找到一种高效的聚乙烯塑料地膜降解菌株非常重要。近年来生物降解地膜的出现一定程度上减轻了农田中聚乙烯地膜的污染问题，而聚己二酸/对苯二甲酸丁二酯(Poly(butyleneadipate-co-terephthalate)，简称：PBAT)作为一种生物可降解材料应用在农田中，但实际应用过程中PBAT的降解情况一般，且生产成本较高，无法实现全面推广使用。因此，进一步寻找对PBAT有高效降解作用的菌株同样非常重要。
发明内容
针对现有塑料地膜降解性低，成本高的技术问题，本发明提供一种一株降解塑料地膜的克雷伯氏菌及其应用，具体是经过分离筛选得到降解菌，经过降解能使聚乙烯和PBAT塑料地膜达到较高的失重率，实现聚乙烯和PBAT塑料地膜的高效降解，生产成本低，应用前景广阔。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一株降解塑料地膜的克雷伯氏菌，是Klebsiella pneumoniaeN3-2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:M 20191054；保藏时间是2019年12月16日。
上述一株降解塑料地膜的克雷伯氏菌的16S rDNA基因序列是序列表No.1。
一株降解塑料地膜的克雷伯氏菌在降解地膜中的应用。
一株降解塑料地膜的克雷伯氏菌在降解塑料地膜中的应用。
一株降解塑料地膜的克雷伯氏菌在降解聚乙烯塑料地膜中的应用。
一株降解塑料地膜的克雷伯氏菌在降解PBAT塑料地膜中的应用。
一株降解塑料地膜的克雷伯氏菌降解聚乙烯塑料地膜的方法，包括：
1)将聚乙烯塑料地膜剪成膜片，进行无菌处理；
1.1)用2％SDS溶液将膜片浸泡，浸泡时间不低于4小时，浸泡期间超声30min；
1.2)用30％双氧水将步骤1.1)超声后的膜片浸泡10min；
1.3)依次用75％乙醇和95％乙醇，将步骤1.2)的膜片浸泡，浸泡时间不低于4小时，浸泡期间超声30min；
2)将一株降解塑料地膜的克雷伯氏菌接种至LB培养基中培养至对数生长期，转入离心管离心，去掉上清，将沉淀菌体用0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液洗涤；
3)将30mL无机盐培养基和步骤2)的沉淀菌体混合，重悬并调节菌液浓度，保持菌液的OD600值为0.8～1.0；
4)向步骤3)的OD600值为0.8～1.0菌液中加入步骤1)无菌处理后的聚乙烯塑料地膜膜片，放置于恒温震荡培养箱中28℃、180rpm培养8周。
一种一株降解塑料地膜的克雷伯氏菌降解PBAT塑料地膜的方法，包括：
1)将PBAT塑料地膜剪成膜片，进行无菌处理；
1.1)用2％SDS溶液将膜片浸泡，浸泡时间不低于4小时，浸泡期间超声30min；
1.2)用30％双氧水将步骤1.1)超声后的膜片浸泡10min；
1.3)依次用75％乙醇和95％乙醇，将步骤1.2)的膜片浸泡，浸泡时间不低于4小时，浸泡期间超声30min；
2)将一株降解塑料地膜的克雷伯氏菌接种至LB培养基中培养至对数生长期，转入离心管离心，去掉上清，将沉淀菌体用0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液洗涤；
3)将30mL无机盐培养基和步骤2)的沉淀菌体混合，重悬并调节菌液浓度，保持菌液的OD600值为0.8～1.0；
4)向步骤3)的OD600值为0.8～1.0的菌液中加入步骤1)无菌处理后的PBAT塑料地膜膜片，放置于恒温震荡培养箱中28℃、180rpm培养8周。
本发明的有益效果是：本发明经过分离筛选得到的菌株，对菌株进行生物鉴定分析，菌株为Klebsiella pneumoniaeN3-2；这种N3-2菌对聚乙烯和PBAT塑料地膜均具有良好的降解效果，通过生物降解处理8周后，聚乙烯和PBAT薄膜表面均有明显的生物侵蚀孔洞，膜片亲水性显著提升，且出现了新的极性官能团；聚乙烯地膜失重率可达3.360±0.082％，PBAT地膜失重率可达6.538±0.086％，为聚乙烯塑料地膜以及PBAT塑料地膜的生物降解提供了新资源，节约了生产成本，应用前景广阔。
附图说明
图1为本发明降解菌N3-2的菌落形态图；
图2为本发明降解菌N3-2的系统发育树；
图3为本发明提供的降解菌N3-2降解8周后聚乙烯塑料地膜和PBAT塑料地膜的扫描电子显微镜特征图；
图4为本发明提供的降解菌N3-2降解8周后聚乙烯塑料地膜和PBAT塑料地膜的原子力显微镜特征图；
图5为本发明提供的降解菌N3-2降解8周后聚乙烯塑料地膜和PBAT塑料地膜的红外光谱分析特征图；
图6为本发明提供的降解菌N3-2降解8周后聚乙烯塑料地膜和PBAT塑料地膜的水接触角变化图。
具体实施方式
现结合附图以及实施例对本发明做详细的说明。
一株降解塑料地膜的克雷伯氏菌，是Klebsiella pneumoniaeN3-2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:M 20191054；保藏时间是2019年12月16日。一株降解塑料地膜的克雷伯氏菌的16S rDNA基因序列是序列表No.1。
一株降解塑料地膜的克雷伯氏菌在降解地膜中的应用。
一株降解塑料地膜的克雷伯氏菌在降解塑料地膜中的应用。
一株降解塑料地膜的克雷伯氏菌在降解聚乙烯塑料地膜中的应用。
一株降解塑料地膜的克雷伯氏菌在降解PBAT塑料地膜中的应用。
一株降解塑料地膜的克雷伯氏菌降解聚乙烯塑料地膜的方法，包括：
1)将聚乙烯塑料地膜剪成膜片，进行无菌处理；
1.1)用2％SDS溶液将膜片浸泡，浸泡时间不低于4小时，浸泡期间超声30min；
1.2)用30％双氧水将步骤1.1)超声后的膜片浸泡10min；
1.3)依次用75％乙醇和95％乙醇，将步骤1.2)的膜片浸泡，浸泡时间不低于4小时，浸泡期间超声30min；
2)将一株降解塑料地膜的克雷伯氏菌接种至LB培养基中培养至对数生长期，转入离心管离心，去掉上清，将沉淀菌体用0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液洗涤；
3)将30mL无机盐培养基和步骤2)的沉淀菌体混合，重悬并调节菌液浓度，保持菌液的OD600值为0.8～1.0；
4)向步骤3)的OD600值为0.8～1.0的菌液中加入步骤1)无菌处理后的聚乙烯塑料地膜膜片，放置于恒温震荡培养箱中28℃、180rpm培养8周。
一种一株降解塑料地膜的克雷伯氏菌降解PBAT塑料地膜的方法，包括：
1)将PBAT塑料地膜剪成膜片，进行无菌处理；
1.1)用2％SDS溶液将膜片浸泡，浸泡时间不低于4小时，浸泡期间超声30min；
1.2)用30％双氧水将步骤1.1)超声后的膜片浸泡10min；
1.3)依次用75％乙醇和95％乙醇，将步骤1.2)的膜片浸泡，浸泡时间不低于4小时，浸泡期间超声30min；
2)将一株降解塑料地膜的克雷伯氏菌接种至LB培养基中培养至对数生长期，转入离心管离心，去掉上清，将沉淀菌体用0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液洗涤；
3)将30mL无机盐培养基和步骤2)的沉淀菌体混合，重悬并调节菌液浓度，保持菌液的OD600值为0.8～1.0；
4)向步骤3)的OD600值为0.8～1.0的菌液中加入步骤1)无菌处理后的PBAT塑料地膜膜片，放置于恒温震荡培养箱中28℃、180rpm培养8周。
实施例1降解菌N3-2的分离筛选
(1)将1g土样加入含有9mL微量碳源培养基的试管中；
本实施例中，微量碳源培养基为：在1000mL去离子水中加入Yeastextract 0.5g、NH4SO42.0g和100mL微量元素母液。
本实施例中，微量元素母液(g/L)：1.0gFeSO4·7H2O、1.0gMgSO4·7H2O、0.1gCuSO4·5H2O、0.1gMnSO4·H2O和0.1gZnSO4·7H2O；pH＝7.0左右；
(2)试管中加入一片2*1.5cm的聚乙烯地膜，180rpm，28℃震荡培养10天；
(3)再将膜片转接入10mL新的微量碳源培养基中培养10天；
(4)再用PBS溶液震荡清洗膜片，制成菌悬液，全部转接入30mL液体无机盐培养基中；同时，按0.35％(w/v)的比例加入约0.1g左右的聚乙烯地膜膜片，180rpm，28℃摇瓶震荡培养30天；
本实施例中，无机盐培养基配方为：KH2PO4 0.7g、K2HPO4 0.7g、MgSO4·7H2O 0.7g、NH4NO3 1.0g、NaCl 0.005g、FeSO4·7H2O 0.002g、ZnSO4·7H2O 0.002g、MnSO4·H2O0.001g；称取上述试剂并溶解于1000mL去离子水中，用1mol/LNaOH调节其pH至7.0。
(5)培养完成后用稀释平板涂布法分离菌株，将菌液浓度稀释到10-4，吸取50μL的菌液涂布到LB培养基中，并多次划线纯化分离得到的菌株；
(6)通过上述的分离与筛选工作，多次分离纯化，获得一株生长迅速的对聚乙烯塑料地膜有降解能力的菌N3-2。
本实施例中，将筛选得到的菌Klebsiella pneumoniaeN3-2，保藏于中国典型培养物保藏中心；地址为：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山；保藏编号CCTCC NO:M 20191054；保藏时间为：2019年12月16日。
本实施例中，还可向试管中加入一片2*1.5cm的PBAT塑料地膜，培养10天；然后得到对PBAT地膜塑料地膜有降解能力的菌N3-2。
实施例2采用N3-2降解聚乙烯塑料地膜
1)将聚乙烯塑料地膜剪成2*1.5cm大小的膜片，称重后置于无菌的10mL离心管中进行无菌处理；
具体的处理过程是：
1.1)用2％SDS溶液将膜片浸泡4小时以上，浸泡期间超声30min；
1.2)再用30％双氧水将膜片浸泡10min；
1.3)最后依次用75％乙醇以及95％乙醇，将膜片浸泡4小时以上，浸泡期间超声30min；
2)将塑料降解菌N3-2接种至LB培养基中培养至对数生长期，转入10mL离心管，4℃、8000rpm离心10min，去掉上清液，沉淀菌体用0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液洗涤3次以去除其表面的培养基；
3)锥形瓶中加入30mL无机盐培养基，加入菌体进行重悬并调节菌液浓度，保持菌液的OD600值为0.8～1.0；
4)锥形瓶中加入0.1g表面灭菌的膜片，将锥形瓶放置于恒温震荡培养箱中28℃、180rpm培养8周。
实施例3采用N3-2降解PBAT塑料地膜
1)PBAT塑料地膜剪成2*1.5cm大小的膜片，称重后置于无菌的10mL离心管中进行无菌处理；
具体的处理过程是：
1.1)用2％SDS溶液将膜片浸泡4小时以上，浸泡期间超声30min；
1.2)再用30％双氧水将膜片浸泡10min；
1.3)依次用75％乙醇以及95％乙醇，将膜片浸泡4小时以上，浸泡期间超声30min；
2)将塑料降解菌N3-2接种至LB培养基中培养至对数生长期，转入10mL离心管，4℃、8000rpm离心10min，去掉上清液，沉淀菌体用0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液洗涤3次以去除其表面的培养基；
3)锥形瓶中加入30mL无机盐培养基，加入菌体进行重悬并调节菌液浓度，保持菌液的OD600值为0.8～1.0；
4)锥形瓶中加入0.1g表面灭菌的PBAT膜片，锥形瓶放置于恒温震荡培养箱中28℃、180rpm培养8周。
对照组1(CK1)
1)将聚乙烯塑料地膜剪成2*1.5cm大小的膜片，称重后置于无菌的10mL离心管中进行无菌处理；
具体的处理过程是：
1.1)用2％SDS溶液将膜片浸泡4小时以上，超声30min；
1.2)再用30％双氧水将膜片浸泡10min；
1.3)依次用75％乙醇以及95％乙醇，将膜片浸泡4小时以上，浸泡期间超声30min；
2)锥形瓶中加入30mL无机盐培养基，再加入0.1g表面灭菌的聚乙烯膜片，将锥形瓶放置于恒温震荡培养箱中28℃、180rpm培养8周。
对照组2(CK2)
1)PBAT塑料地膜剪成2*1.5cm大小的膜片，称重后置于无菌的10mL离心管中进行无菌处理；
具体的处理过程是：
1.1)用2％SDS溶液将膜片浸泡4小时以上，浸泡期间超声30min；
1.2)再用30％双氧水将膜片浸泡10min；
1.3)依次用75％乙醇以及95％乙醇，将膜片浸泡4小时以上，浸泡期间超声30min；
2)锥形瓶中加入30mL无机盐培养基，再加入0.1g表面灭菌的PBAT膜片，将锥形瓶放置于恒温震荡培养箱中28℃、180rpm培养8周。
进一步的，为了说明本发明分离筛选的降解菌的种类特性以及降解菌对聚乙烯塑料地膜和PBAT塑料地膜的降解效果，对降解菌的生理特征及分子生物学进行鉴定，并对其降解聚乙烯塑料地膜和PBAT塑料地膜的结果进行对比验证。
试验1
通过上述的分离与筛选工作，多次分离纯化，获得一株降解菌，在LB平板上观察其形态。结果如图1所示。
从图1可以看出：该降解菌在LB平板上菌落呈淡黄色，形状为圆形，表面光滑湿润，边缘整齐。
此外，菌株的革兰氏染色呈红色，菌株为革兰氏阴性菌。
试验2分子生物学鉴定试验
对实施例1得到的菌株16S rDNA基因序列进行了扩增测序，具体的，用试剂盒提取实施例1分离获得的单一菌株的DNA，采用细菌通用引物27F、1492R作为扩增引物进行PCR扩增。
16SrDNA序列引物27F：5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'，1492R：5'-GGT TACCTT GTT ACG ACT T-3'。
PCR扩增体系(50μL)：模板DNA2μL，Mix(2×)25μL，引物27F 2μL，引物1492R 2μL，ddH2O 19μL。
扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸2min，循环30次；最后72℃延伸10min，4℃保存。
本试验中，16SrDNA测序结果参见序列表No.1。
对扩增产物进行电泳检测，委托生工生物工程(上海)股份有限公司测序。将所得的序列与NCBI数据库中已有的序列进行BLAST分析，并选取同源性相近的菌株，采用MEGA X软件构建系统发育树，构建方法为Neighbor-joining。结果如图2所示。
从图2可以看出：所得菌株与Klebsiella pneumoniae DSM 30104的相似性为99％，且在进化距离上相对较近，结合菌株的生理生化特征，初步将N3-2鉴定为克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae N3-2(MN889033))。
试验3失重率测定试验
膜片重量的降低是其被降解的最基本现象，因此对膜片的失重率进行试验。
具体的，
处理组：实施例2和实施例3中聚乙烯和PBAT两种降解前后的膜片；
对照组：对照组1和对照组2中聚乙烯和PBAT两种降解前后的膜片；
将上述膜片分别按照下述流程处理：用无菌镊子将膜取出，置于无菌的10mL离心管中，使用2％SDS溶液浸泡4小时以上，超声30min，再用30％双氧水浸泡10min，最后用75％乙醇以及95％乙醇，依次分别浸泡4小时以上，浸泡期间超声30min；将洗涤后的膜片放置在滤纸上干燥后称重。
本试验中，每组膜片的处理设置3个重复。
本试验中，将实施例2与对照组1进行对比，结果如表1；
本试验中，将实施例3与对照组2进行对比，结果如表2。
膜片的失重率(％)＝(膜片初始质量-膜片被降解后质量)/膜片初始质量×100％。
表1PE聚乙烯塑料地膜与对照组1的失重结果对比
处理 膜原始重量 8周后膜重量 ΔR 失重率％ 失重率平均值％
N3-2(1) 0.0998 0.0966 -0.0032 3.20641 3.3596
N3-2(2) 0.1004 0.0969 -0.0035 3.48606
N3-2(3) 0.1004 0.0970 -0.0034 3.38645
CK1(1) 0.1004 0.0993 -0.0011 1.09562 0.9644
CK1(2) 0.1004 0.0995 -0.0009 0.89641
CK1(3) 0.1003 0.0994 -0.0009 0.9012
从表1中可以看到：经过8周的培养后，处理组聚乙烯地膜的失重率达3.360±0.082％，对照组1聚乙烯地膜的失重率为0.964±0.066％。(对照组1出现膜片失重情况的原因可能为，在摇瓶震荡过程中以及试验操作过程中膜片受到机械破坏)
表2PBAT塑料地膜与对照组2的失重结果对比
处理 膜原始重量 8周后膜重量 ΔR 失重率％ 失重率平均值％
N3-2(1) 0.1 0.0933 -0.0067 6.7 6.5376
N3-2(2) 0.0999 0.0934 -0.0065 6.50651
N3-2(3) 0.0999 0.0935 -0.0064 6.40641
CK2(1) 0.0998 0.0953 -0.0045 4.50902 4.4697
CK2(2) 0.1000 0.0956 -0.0044 4.4
CK2(3) 0.1000 0.0955 -0.0045 4.5
从表2可以看到：经过8周的培养后处理组PBAT地膜的失重率达6.538±0.086％，对照组2的PBAT塑料地膜的失重率为4.470±0.035％。(对照组2出现膜片失重情况的原因可能为，在摇瓶震荡过程中以及试验操作过程中膜片受到机械破坏。)
试验4扫描电子显微镜的观察试验
处理组：实施例2和实施例3中聚乙烯和PBAT两种降解前后的膜片；
对照组：对照组1和对照组2中聚乙烯和PBAT两种降解前后的膜片；
具体的试验过程是：将膜片清洗干净后自然干燥，固定喷金后在扫描电子显微镜(S-4800；Hitachi，Japan)下观察其微观形貌特征，放大倍数为3000×。试验结果如图3所示。
其中图3(a1)表示实施例2未经处理的原始聚乙烯膜片；图3(a2)为对照组1未加菌处理的聚乙烯膜片；图3(a3)为实施例2加菌处理后的聚乙烯膜片；
其中图3(b1)表示实施例3未经处理的原始PBAT膜片；图3(b2)为对照组2未加菌处理的PBAT膜片；图3(b3)为实施例3加菌处理后的PBAT膜片。
由图3可以得到：
(1)图3(a1)中，聚乙烯地膜原膜(未经试验操作)，其表面光滑平整；图3(a2)中，对照组1的聚乙烯地膜的表面出现非常细微的粗糙点；图3(a3)中，经过8周的培养后，处理组聚乙烯地膜的表面粗糙，并出现明显的孔洞以及沟壑；表明本发明N3-2菌种对聚乙烯地膜进行了很好的降解；
(2)图3(b1)中，PBAT地膜原膜(未经试验操作)，其表面光滑平整；图3(b2)中，对照组2的PBAT地膜的表面出现非常细微的粗糙点；图3(b3)中，经过8周的培养后，处理组PBAT地膜的表面粗糙，并出现明显的沟壑；表明本发明的N3-2菌种对PBAT地膜进行了很好的降解。
试验5原子力显微镜的观察试验
处理组：实施例2和实施例3中聚乙烯和PBAT两种降解前后的膜片；
对照组：对照组1和对照组2中聚乙烯和PBAT两种降解前后的膜片；
具体的试验过程是：将上述的膜片清洗干净后自然干燥，利用原子力显微镜(Multimode-8；Bruker，USA)在常温下扫描塑料地膜的表面特征，通过NanoScope Analysis软件对得到的图像进行分析。试验结果如图4所示。
其中图4(a1)表示实施例2未经处理的原始聚乙烯膜片；图4(a2)为对照组1未加菌处理的聚乙烯膜片；图4(a3)为实施例2加菌处理后的聚乙烯膜片；
其中图4(b1)表示实施例3未经处理的原始PBAT膜片；图4(b2)为对照组2未加菌处理的PBAT膜片；图4(b3)为实施例3加菌处理后的PBAT膜片。
由图4可以得到：
(1)图4(a1)中，聚乙烯地膜原膜(未经试验操作)，其表面光滑平整；图4(a2)中，对照组1的聚乙烯地膜的表面粗糙程度非常轻；图4(a3)中，经过8周的培养后，处理组聚乙烯地膜的表面粗糙程度较深，并出现明显的沟壑；表明本发明的菌种对聚乙烯地膜具有很好的降解作用；
(2)图4(b1)中，PBAT地膜原膜(未经试验操作)，其表面光滑平整；图4(b2)中，对照组2的PBAT地膜的表面粗糙程度非常轻；图4(b3)中，经过8周的培养后，处理组PBAT地膜的表面粗糙程度较深，并出现明显的沟壑；表明本发明的菌种对PBAT地膜具有很好的降解作用。
试验6红外光谱分析试验
试验组：实施例2和实施例3中聚乙烯和PBAT两种降解后的膜片；
具体过程是：将两组膜片分别清洗干净并自然干燥，使用傅里叶红外光谱仪(Vetex70；Bruker，Germany)测定膜片表面的官能团，扫描波长范围为400-4000cm-1。结果如图5所示。
图5(a)为实施例2加菌处理后的聚乙烯膜片；图5(b)为实施例3加菌处理后的PBAT膜片。
由图5(a)可见，经过8周的培养，聚乙烯地膜的化学结构中新引入了含氧官能团如羰基(～1716cm-1处)，表明N3-2菌株对聚乙烯地膜产生降解作用。
由图5(b)可见，经过8周的培养，PBAT地膜的化学结构中引入了碳碳三键(～2349cm-1)和羟基(～3288cm-1)等极性官能团。表明菌株N3-2同样对PBAT地膜产生降解作用。
因此，当本发明提供的菌株N3-2对塑料降解时，菌株可以在塑料表面引入极性官能团，增大膜结构的不稳定性，从而利于塑料膜的后期降解。
试验7水接触角试验
处理组：实施例2和实施例3中聚乙烯和PBAT两种降解前后的膜片；
对照组：对照组1和对照组2中聚乙烯和PBAT两种降解前后的膜片；
具体的试验过程是：将处理组和对照组的膜片分别使用水接触角计(JC2000D1；Powereach，China)进行静水接触角(n＝3)的测定，进而分析地膜表面疏水性的变化。试验结果如图6所示。
其中图6(a1)表示实施例2未经处理的原始聚乙烯膜片；图6(a2)为对照组1未加菌处理的聚乙烯膜片；图6(a3)为实施例2加菌处理后的聚乙烯膜片；
其中图6(b1)表示实施例3未经处理的原始PBAT膜片；图6(b2)为对照组2未加菌处理的PBAT膜片；图6(b3)为实施例3加菌处理后的PBAT膜片。
由图6可以得到：
(1)图6(a1)中，聚乙烯地膜原膜(未经试验操作)，膜片的水接触角为101.7±1.3°；图6(a2)中，对照组1的聚乙烯地膜膜片的水接触角为99.7±1.9°；图6(a3)中，经过8周的培养后，处理组聚乙烯地膜膜片的水接触角为95.9±0.4°；
(2)图6(b1)中，PBAT地膜原膜(未经试验操作)，膜片的水接触角为98.5±1.6°；图6(b2)中，对照组2的PBAT地膜膜片的水接触角为98.4±0.9°；图6(b3)中，经过8周的培养后，处理组PBAT地膜膜片的水接触角为92.7±0.1°。
上述结果表明，降解菌N3-2能显著降低聚乙烯塑料地膜膜片以及PBAT塑料地膜膜片的疏水性，使其更易于被微生物附着。
上述试验说明本发明分离筛选出的菌株N3-2对聚乙烯和PBAT塑料地膜均具有良好的降解效果。通过生物降解处理8周后，聚乙烯和PBAT薄膜表面均有明显的生物侵蚀孔洞，膜片亲水性显著提升，且出现了新的极性官能团，8周后，聚乙烯地膜失重率可达3.360±0.082％，PBAT地膜失重率可达6.538±0.086％，降解效果好，生产成本较低，应用前景广阔。
Figure IDA0002723791850000011
Figure IDA0002723791850000021

Claims (5)

1.一株降解塑料地膜的肺炎克雷伯氏菌，其特征在于：为肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）N3-2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO: M 20191054；保藏时间是2019年12月16日。
2.一种如权利要求1所述的一株降解塑料地膜的肺炎克雷伯氏菌在降解聚乙烯塑料地膜中的应用。
3.一种如权利要求1所述的一株降解塑料地膜的肺炎克雷伯氏菌在降解PBAT塑料地膜中的应用。
4.一种基于权利要求1所述的一株降解塑料地膜的肺炎克雷伯氏菌降解聚乙烯塑料地膜的方法，其特征在于：所述方法包括：
1）将聚乙烯塑料地膜剪成膜片，进行无菌处理；
1.1）用2%SDS溶液将膜片浸泡，浸泡时间不低于4小时，浸泡期间超声30 min；
1.2）用30%双氧水将步骤1.1）超声后的膜片浸泡10 min；
1.3）依次用75%乙醇和95%乙醇，将步骤1.2）的膜片浸泡，浸泡时间不低于4小时，浸泡期间超声30 min；
2）将权利要求1所述的一株降解塑料地膜的肺炎克雷伯氏菌接种至LB培养基中培养至对数生长期，转入离心管离心，去掉上清，将沉淀菌体用0.01 mol/L磷酸盐缓冲溶液洗涤；
3）将30 mL无机盐培养基和步骤2）的沉淀菌体混合，重悬并调节菌液浓度，保持菌液的OD600值为0.8~1.0；
4）向步骤3）的OD600值为0.8~1.0的菌液中加入步骤1）无菌处理后的聚乙烯塑料地膜膜片，放置于恒温震荡培养箱中28℃、180 rpm培养8周。
5.一种基于权利要求1所述的一株降解塑料地膜的肺炎克雷伯氏菌降解PBAT塑料地膜的方法，其特征在于：所述方法包括：
1）将PBAT塑料地膜剪成膜片，进行无菌处理；
1.1）用2%SDS溶液将膜片浸泡，浸泡时间不低于4小时，浸泡期间超声30 min；
1.2）用30%双氧水将步骤1.1）超声后的膜片浸泡10 min；
1.3）依次用75%乙醇和95%乙醇，将步骤1.2）的膜片浸泡，浸泡时间不低于4小时，浸泡期间超声30 min；
2）将权利要求1所述的一株降解塑料地膜的肺炎克雷伯氏菌接种至LB培养基中培养至对数生长期，转入离心管离心，去掉上清，将沉淀菌体用0.01 mol/L磷酸盐缓冲溶液洗涤；
3）将30 mL无机盐培养基和步骤2）的沉淀菌体混合，重悬并调节菌液浓度，保持菌液的OD600值为0.8~1.0；
4）向步骤3）的OD600值为0.8~1.0的菌液中加入步骤1）无菌处理后的PBAT塑料地膜膜片，放置于恒温震荡培养箱中28℃、180 rpm培养8周。
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