CN110106099B

CN110106099B - 全氟辛基磺酰胺降解菌的筛选驯化方法及其应用

Info

Publication number: CN110106099B
Application number: CN201810853556.3A
Authority: CN
Inventors: 王鹏红; 蒋海珍; 牛莉莉; 康宇飞; 郝健; 万文
Original assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Current assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Priority date: 2018-07-30
Filing date: 2018-07-30
Publication date: 2022-07-12
Anticipated expiration: 2038-07-30
Also published as: CN110106099A

Abstract

本发明涉及一种全氟辛基磺酰胺降解菌的筛选驯化方法及其应用。该菌株的保藏号为NO.14085，其碱基序列为SEQ ID NO.1所示。该菌能切断全氟化合物的碳‑氟键（C‑F），释放出氟负离子。可应用于全氟化合物污染治理，为生物修复工作提供资源。

Description

全氟辛基磺酰胺降解菌的筛选驯化方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种全氟辛基磺酰胺降解菌的筛选驯化方法及其应用。

背景技术

全氟有机化合物(Perfluorochemicals，PFCs)具有很多化学键能极强的碳氟共价键(Blake D K, Robert D, [J]. Environ. Sci.Technol., 1997, 31, 2445-2454)，另外，1,3-位的氟原子之间存在电子及立体排斥，所以全氟化合物的碳链具有螺旋形结构，氟原子有序地包裹在碳链周围，使得PFCs化学性质极其稳定，能够经受高温加热、光照、耐强酸强碱等化学作用。同时上述结构特点(Yu H, Zhang C, Zhou Q,[J].Chinese J. Environ. Sci., 2007, 28(1), 204) 使得PFCs具有良好的疏水疏油特性，因此全氟有机化合物被广泛应用于合成聚合物（聚四氟乙烯PTFE）添加剂、表面活性剂、涂料、化工、电镀、纺织品、农用化学品、皮革、医学用品、地板打磨、合成洗涤剂、表面防污剂、灭火泡沫(朱嘉丽, 氟表面活性剂在电镀行业的应用, [J]. 化工新型材料, 2003, 31(1), 46- 47)、炊具制造（如不粘锅）、毛毯制造、室内装演、纸制食品包装材料等诸多工业与民用领域，为人们的生产和生活带来了很多的便利。但对数百种PFCs的产品使用研究发现，其在环境和生物体的最终分解代谢物多是全氟辛磺酸（PFOS）和全氟辛羧酸（PFOA）类化合物(So M K,Taniyasu S, Yamashita N, [J]. Environ. Sci. Technol., 2004, 38(15), 4056-4063; Nakata H, Kannan K, Nasu T, [J]. Environ. Sci.Technol., 2006, 40, 4916-4921)。而此类化合物具有很高的化学稳定性和生物惰性, 能够随着生物链的传递在生物体内不断累积，对环境、生物以及人类健康带来的极大的影响及危害(Johansson N,Fredriksson A, Eriksson P, [J]. Neurotoxicology, 2008, 29(1), 60-169)。因此，2005年，联合国环境署将PFOA和PFOS一起列入了“关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约”中持久性有机污染物（POPs）的候选名单。

目前为止，对于PFOS和PFOA等“持久性有机污染物”治理方法大都采用物理或化学的降解。由于物理和化学降解方法操作复杂，难于实现散布于自然界环境中的PFOS和PFOA的降解。而微生物降解技术由于其成本低廉、绿色环保且可以大规模地应用于自然界实际的污染治理、修复污染环境等优势而具有巨大的应用潜力。

虽然目前已经有研究者采用生物法对不同全氟类化合物开展了以降解方法的研究，但是此技术仍处于理论研究阶段，且主要以降解FTOH(全氟调聚醇) 以及PFOS为主(KimM H, Wang N, McDonald T, [J]. Biotechnol. Bioeng,2012, 109(12), 3041-3048;HeN, Zhou M, Wang L, [J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 2013, 33(2), 383-388;Kwon B G, Lim H J, Chung S Y, [J]. Chemosphere, 2015, 138, 1039-1044)。作为全氟辛磺酸前体化合物，研究全氟辛磺酰胺（PFOSA）微生物降解研究具有着重要的实用价值。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一株全氟辛磺酰胺PFOSA降解菌M-9（Acinetobactersp.M-9）。该菌株的保藏号为NO.14085，其碱基序列为SEQ ID NO.1所示的碱基序列。该菌能切断全氟化合物的碳-氟键（C-F），释放出氟负离子。

本发明的目的之二在于提供该全氟辛磺酰胺（PFOSA）降解菌的筛选驯化方法。

本发明的目的之三在于提供该全氟辛磺酰胺（PFOSA）降解菌在降解微生物中的应用。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一株全氟辛磺酰胺降解菌，其特征在于该全氟辛磺酰胺降解菌的保藏编号为：CGMCC NO.14085。

一种筛选驯化上述的全氟辛磺酰胺降解菌的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：

a. 称取采于化工厂污水污染地区的污泥土样，加无菌蒸馏水，搅拌均匀配成质量百分比浓度为5%-30%的悬浊液；180 rpm、30 ºC活化5-24小时。

b.将步骤a 所得的悬浊液以3-30%（V/V）接种于基础无机盐MSM培养基，加入10-100 ml 100 mg/L降解底物全氟辛基磺酰胺和0.01-0.3% 葡萄糖作为共代谢物，于30 ºC、180 rpm培养2-5天。

c. 重复步骤b ，所述的降解底物全氟辛基磺酰胺的浓度从浓度100 mg/L开始，以100 mg/L 的间隔递增至1000 mg/L；待全氟辛基磺酰胺的浓度增加至1000 mg/L后，进行驯化培养3个月，上述全氟辛基磺酰胺降解菌株驯化过程均在30 ºC、180 rpm的恒温摇床中进行。

d. 将步骤c 驯化得到的细菌培养液，稀释涂布于LB固体培养基中，37 ºC培养2-3天；挑取单菌落在固体LB 培养基上划线纯化3 次，获得纯菌种。

上述的基础无机盐（MSM）培养基为：NaCl 1.0 g/L、(NH4)₂SO₄1.0 g/L、K₂HPO₄ 1.5g/L、KH₂PO₄0.5 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.2 g/L。

上述的全氟化合物降解菌在降解全氟辛基磺酰胺中的应用。

本发明通过富集培养，驯化筛选得到一株能够降解全氟辛基磺酰胺的菌株M-9。并对全氟辛基磺酰胺高效降解菌株的生长条件以及降解特性进行研究，研究结果可以应用于全氟化合物污染治理，为生物修复工作提供生物资源。

生物材料保藏信息：本发明所述全氟辛基磺酰胺的降解菌M-9(Acinetobactersp.M-9), 已于2017年05月02日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。邮编：100101。保藏号为CGMCC NO.14085。

附图说明

图1 本发明菌株M-9的16S rRNA系统发育进化树；

图2 菌株M-9生长量与对应降解效率关系图；

图3 全氟辛基磺酰胺的标准工作曲线。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明中所述的室温是指进行实验的操作间的温度，一般为25 ºC。

实施例1、本发明菌株M-9的筛选驯化

称取采于化工厂污水污染地区的污泥土样2.0 g，加100 mL无菌蒸馏水，磁力搅拌均匀配成10%的悬浊液。180 rpm、30 ℃活化5-24小时。在降解底物全氟辛基磺酰胺的作用下，驯化培养3个月。然后将其稀释涂布于LB固体培养基中，37 ℃培养1-5天。挑取单菌落在固体LB 培养基上划线纯化3次，获得纯菌种。

LB固体培养基（g/L）：胰蛋白胨10.0、酵母提取物5.0、NaCl 10.0、pH值为7.0。

将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），其保藏编号为NO.14085。

实施例2、本发明菌株M-9的表观特征

1. 菌落特征

将菌株M-9接种到LB固体培养基上，37 ºC 培养24 h，观察其菌落的大小、颜色、边缘、凸起、光滑度、粘性、透明度等特点。结果显示，菌株M-9在LB固体培养基上形成边缘整齐、光滑、湿润、乳黄色、不透明，具有圆滑、饱满、易挑取等生长特性。

2. 细胞形态学特征

菌株M-9为革兰氏阳性杆菌，无鞭毛、菌体细胞大小约为0.1 μm×0.5 μm。

实施例3、本发明菌株M-9的生长特性

菌株M-9接种到LB液体培养基，37 ºC摇床培养20~24 h，作为种子。

LB液体培养基的组成（g/L）：胰蛋白胨10.0、NaCl 10.0、酵母提取物5.0，蒸馏水定容至1000 mL。

1. 生长温度：

将所培养的M-9菌种子液按1%(v/v)接种量接种于LB液体培养基。分别置于4、10、15、20、25、30、37、40、45、50和60 ºC 的水浴培养，每个温度梯度做三个平行，分别在24 h和48 h时测定其生长情况。得到菌株M-9生长温度范围为20~50 ºC，最适温度30-37 ºC。

2. 生长pH范围

用无菌的1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH将灭好菌的MSM培养基调至pH值分别为3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0、8.5、9.0，将所培养的种子液按10%接种量接入，37 ºC培养，分别于24 h和48 h的生长状态做记录。得到菌株M-9生长的pH范围为6.0~8.0，最适pH为6.5~7.5。

实施例4、本发明菌株M-9的生理生化特性

利用常规的生理生化测定方法（东秀珠，蔡妙英等，2001）对菌株M-9及相关的同属菌株进行生理生化特征鉴定：

生化试验	实验结果
		淀粉水解试验	+
V-P试验	-
		甲基红试验	-
明胶液化试验	+
		尿素酶试验	+
氧化酶试验	-
		过氧化氢酶试验	-
苯丙氨酸脱氨基试验	+
		柠檬酸盐试验	-

注：“+”表示反应为阳性；“-”表示反应为阴性

菌株M-9的主要生理生化特征：该菌具有淀粉水解试验阳性、V-P试验阴性、甲基红试验阴性、明胶液化试验阳性、尿素酶试验阳性、氧化酶试验阴性、过氧化酶试验阴性、苯丙氨酸脱氨基试验阳性、柠檬酸盐利用试验阴性等生理生化特性。

实施例5、本发明菌M-9的16S rRNA基因的PCR扩增和序列测定及16S rRNA系统发育特征

1. 提取基因组DNA

将菌株M-9接种于LB液体培养基，将生长至对数晚期的发酵液，12000 rpm/min离心1 min，去除上清液；用TES (50 mM Tris，50 mM EDTA-Na₂，50mM NaCl，pH 8.0-8.2)溶液洗3遍；用0.4 mL TES溶液将菌体混匀，加入适量溶菌酶，37 ºC保温1 h；加入0.04 mL 20%SDS，60 ºC保温30 min；加入0.18 mL 5 M NaClO₄，混匀；加入等体积氯仿-异戊醇(24:1)，轻轻摇匀1 min左右，离心（12000 rpm/min，10 min），吸取上清液；上清液加入20 μl 0.2%RNA酶37 ºC保温30 min，氯仿-异戊醇（24:1, v/v）处理一遍；上清液加入20 μl蛋白酶K(50-70 μg/mL)，37 ºC保温1 h，氯仿-异戊醇（24:1, v/v）处理一遍；上清液用2倍体积冰乙醇沉淀，70%冰乙醇溶液浸泡5 min，12000 rpm/min离心5 min。晾干后溶于无菌水中作为模板DNA。

2. 16S rRNA基因的PCR扩增及测序

用于PCR扩增的引物：

Sequence-1514R: (5’-AAg gAg gTg ATC CAg CC-3’)

Sequence -27F: (5’-AgAg TT TgA TCM Tgg CTC Ag-3’)

PCR反应体系（20 μl）为：10×buffer 2 μl、25 mmol/L MgCl₂2 μl、10 mmol/LdNTPs 1.5 μl、30 pmol/L 引物各1 μl、ddH₂O 13.4 μl、Taq DNA酶 1 μl、模板1 μl。PCR反应条件为：95 ºC 10 min，95 ºC 1 min，55 ºC 1 min，72 ºC 1 min 30 s，30个循环；72 ºC10 min，4 ºC保存。

PCR产物的测序采用ABI BigDye3.1测序试剂盒 (Applied Biosystems) 和 DNA自动测序仪 (model ABI3730; Applied Biosystems)。测序结果表明，菌株M的16S rRNA基因序列长度为1532 bp。其16S rRNA基因的核苷酸序列如序列为SEQ ID NO.1所示的碱基序列。如上所述的16S rRNA 序列使用软件MEGA version6.0.software package绘制进化关系树。采用neighbor-joining计算，并以maximum-likelihood 和maximum-parsimony 进行验证计算，bootstrap设置为1000个循环。结果如图1 所示。同源性分析表明，菌株M-9属于不动杆菌属。参见图1。

实施例 6、降解特性研究

一、降解模式研究

采用分析级的氟化钠（NaF）作为标准物质，准确称取0.22112 g NaF用适量超纯水溶解。溶解后，转移至100 mL容量瓶中，用超纯水定容至100 mL，即得1000 ppm（mg/L）的氟负离子标准溶液。用容量瓶依次将1000 ppm的标准溶液稀释至100 ppm、50 ppm、25 ppm。然后用移液枪分别吸取100 ppm、50 ppm标准液各1 mL，定容至10 mL。即得到10 ppm、5ppm的氟负离子的标准溶液。按照这种方法分别配置20 ppm、10ppm、5 ppm、2ppm、1 ppm和0.5 ppm一系列氟负离子的标准溶液。将上述配置的标准氟负离子样品送至上海大学环境与化学工程学院测试中心，进行氟负离子色谱（IC）检测。对氟负离子的峰进行积分，以离子峰的积分面积作为纵坐标，以对应的氟负离子浓度作为横坐标，绘制氟负离子标准曲线。经过拟合得到氟负离子标准曲线方程为：

y=3.4124x+283.05 (x, ppm)

氟负离子标准曲线方程拟合指数R²为0.9962。该标准工作曲线方程可用于对降解体系氟负离子进行定量分析研究。

向100 mL 氮源培养基加入200 mg PFOSA，115 ºC高温高压灭菌20 min。冷却至室温的培养基按照10 %（V/V）接菌量分别接入降解菌株。将接过菌的培养基置于30 ºC、180rpm的恒温摇床中培养。未接降解菌株的培养基作为空白对照组，用于检测底物全氟辛基磺酰胺的损耗以及其它干扰因素。分别取不同时间段的上述降解体系1.5 mL，于12,000 rpm、高速离心10 min，保留上清液。用0.22 μm滤膜过滤上清液，以便过滤体系中的细菌及其碎片并用干净干燥的样品管接收滤液。吸取1.0 mL滤液于10 mL样品管，定容至10 mL。将降解样品送至上海大学环境与化学工程学院测试中心进行IC检测。以标准氟离子色谱谱图作比较，以降解体系中是否产生F^-及F^-浓度确定所筛选菌株的降解性能。参见图2。

表1：菌株M-9生长量和降解效率随时间的变化

由曲线可以看出菌株M-9降解底物全氟辛基磺酰胺与菌株的生长繁殖是同步进行的。当菌株M-9处于迟缓期时，全氟辛基磺酰胺几乎没有降解。表现在降解体系中F^-浓度较低，C-F键的几乎未断裂。当菌株M-9进入对数期，底物开始被快速降解。主要表现为体系中F^-浓度迅速增长，全氟辛基磺酰胺结构中C-F键断裂产生大量的氟负离子，且其浓度达到最大值。当M-9菌生长进入稳定期，降解体系中的F^-浓度趋于稳定，并出现轻微的下降。

二、全氟辛基磺酰胺标准工作曲线的制备

①配置梯度浓度差的全氟辛基磺酰胺标准液(2000ppm、1000ppm、500ppm、200ppm、100ppm、50ppm)。

②每个梯度样品测试5次，去除最大值和最小值后得到3组全氟辛基磺酰胺的响应峰面积，求平均值。

③以全氟辛基磺酰胺的积分面积作为纵坐标，以对应的全氟辛基磺酰胺的浓度（ppm）作为横坐标，绘制全氟辛基磺酰胺的标准工作曲线。

经过拟合得到全氟辛基磺酰胺的标准曲线方程为：

y = 0.186x + 32.518(y, ppm)

全氟辛基磺酰胺的标准曲线方程拟合指数R²为0.9997。该标准曲线方程可用于对降解体系中全氟辛基磺酰胺进行定量分析研究。参见图3。

三、全氟辛基磺酰胺的降解体系

配置两瓶50 mL MSM培养基，加入100 mg的全氟辛基磺酰胺，用50 μL甲醇助溶。培养基于115 ℃高温高压灭菌20 min。挑取平板上M-9菌的单菌落，然后接种于装有MSM培养液的试管中，180 rpm、30 ℃的恒温摇床培养6~8 h。将制备好的菌种，按照10%的接种量，接种于已灭菌的50 mL MSM培养基中。 30 ℃，180 rpm的恒温摇床降解培养24 h。另一瓶未接种降解菌的为空白对照。

四、底物全氟辛基磺酰胺的提取及测定

降解结束后，采用冷冻干燥方法处理降解液。再使用甲醇回收降解体系中全氟辛基磺酰胺。具体的操作如下：

①将降解体系以12,000 rpm的转速离心30 min。然后分别回收上清液和沉淀。

②将上清液置于-80 ºC冻存2 h，然后用冷冻干燥机除去体系中的水分。空白组则直接冷冻干燥。

③将上一步回收得到的沉淀以及冷冻干燥后的固体，用50 mL甲醇反复萃取六次。将上清液与沉淀的甲醇洗涤液收集合并，用旋转蒸发仪除掉甲醇。

④将制得的样品放于装有P₂O₅的真空干燥箱进行干燥处理。

⑤降解体系样品，用分析级的甲醇重新溶解。利用GC检测降解体系中底物含量。五、全氟辛基磺酰胺降解效率的计算

利用GC测得的全氟辛基磺酰胺的标准工作曲线对底物全氟辛基磺酰胺进行定量，通过降解底物全氟辛基磺酰胺的剩余从而给出降解效率。

降解率% = (C降解前- C降解后剩余)/ C降解前×l00 %

通过GC定量，可以求得降解体系全氟辛基磺酰胺剩余量为0.0715 g，而降解体系初始全氟辛基磺酰胺含量为101 mg，则菌株对底物全氟辛基磺酰胺降解率为29.2%。

<110> 上海大学

<120>全氟辛基磺酰胺降解菌的筛选驯化方法及其应用

<160> 1

<210> 1

<211> 1532

<212> DNA

<213> Acinetobacter sp.

<400> 1

AGAGTTTGAT CATGGCTCAG ATTGAACGCT GGCGGCAGGC TTAACACATG CAAGTCGAGC 60

GGAGAGAGGT AGCTTGCTAC TGATCTTAGC GGCGGACGGG TGAGTAATGC TTAGGAATCT 120

GCCTATTAGT GGGGGACAAC ATTTCGAAAG GAATGCTAAT ACCGCATACG TCCTACGGGA 180

GAAAGCAGGG GATCTTCGGA CCTTGCGCTA ATAGATGAGC CTAAGTCGGA TTAGCTAGTT 240

GGTGGGGTAA AGGCCTACCA AGGCGACGAT CTGTAGCGGG TCTGAGAGGA TGATCCGCCA 300

CACTGGGACT GAGACACGGC CCAGACTCCT ACGGGAGGCA GCAGTGGGGA ATATTGGACA 360

ATGGGCGCAA GCCTGATCCA GCCATGCCGC GTGTGTGAAG AAGGCCTCAT GGTTGTAAAG 420

CACTTTAAGC GAGGAGGAGG CTACTTTAGT TAATACCTAG AGATAGTGGA CGTTACTCGC 480

AGAATAAGCA CCGGCTAACT CTGTGCCAGC AGCCGCGGTA ATACAGAGGG TGCAAGCGTT 540

AATCGGATTT ACTGGGCGTA AAGCGCGCGT AGGCGGCTAA TTAAGTCAAA TGTGAAATCC 600

CCGAGCTTAA CTTGGGAATT GCATTCGATA CTGGTTAGCT AGAGTGTGGG AGAGGATGGG 660

TAGAATTCCA GGTGTAGCGG TGAAATGCGT AGAGATCTGG AGGAATACCG ATGGCGAAGG 720

CAGCCATCTG GCCTAACACT GACGCTGGGG TGCGAAAGCA TGGGGAGCAA ACAGGATTAG 780

ATACCCTGGG TAGTCCATGC CGTAAACGAT GTCTACTAGC CGTTGGGGCC TTTGAGGCTT 840

TAGTGGCGCA GCTAACGCGA TAAGTAGACC GCCTGGGGAG TACGGTCGCA AGACTAAAAC 900

TCAAATGAAT TGACGGGGGC CCGCACAAGC GGTGGAGCAT GTGGTTTAAT TCGATGCAAC 960

GCGAAGAACC TTACCTGGCC TTGACATAGT AAGAACTTTC CAGAGATGGA TTGGTGCCTT 1020

CGGGAACTTA CATACAGGTG CTGCATGGCT GTCGTCAGCT CGTGTCGTGA GATGTTGGGT 1080

TAAGTCCCGC AACGAGCGCA ACCCTTTTCC TTATTTGCCA GCGAGTAATG TCGGGAACTT 1140

TAAGGATACT GCCAGTGACA AACTGGAGGA AGGCGGGGAC GACGTCAAGT CATCATGGCC 1200

CTTACGGCCA GGGCTACACA CGTGCTACAA TGGTCGGTAC AAAGGGTTGC TACCTAGCGA 1260

TAGGATGCTA ATCTCAAAAA GCCGATCGTA GTCCGGATTG GAGTCTGCAA CTCGACTCCA 1320

TGAAGTCGGA ATCGCTAGTA ATCGCGGATC AGAATGCCGC GGTGAATACG TTCCCGGGCC 1380

TTGTACACAC CGCCCGTCAC ACCATGGGAG TTTGTTGCAC CAGAAGTAGC TAGCCTAACT 1440

GCAAAGAGGG CGGTTACCAC GGTGTGGCCG ATGACTGGGG TGAAGTCGTA ACAAGGTAGC 1500

CGTAGGGGAA CCTGCGGCTG GATCACCTCC TT 1560

Claims

1.一株全氟辛基磺酰胺降解菌，其特征在于该全氟辛基磺酰胺降解菌的保藏编号为：CGMCC NO.14085。

2.一种权利要求1 所述的全氟辛基磺酰胺降解菌在降解全氟辛基磺酰胺中的应用。