CN114196596A

CN114196596A - 一种Cr(VI)去除复合菌剂及其制备方法

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Publication number: CN114196596A
Application number: CN202111680983.4A
Authority: CN
Inventors: 毛航球; 杨秋婵; 张保安
Original assignee: Guangdong Zhongwei Environmental Protection Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangdong Zhongwei Environmental Protection Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-12-30
Filing date: 2021-12-30
Publication date: 2022-03-18

Abstract

本发明提供了一种Cr(VI)去除复合菌剂及其制备方法，其中，Cr(VI)去除复合菌剂包括节杆菌属Arthrobacter sp.菌剂、假单胞菌属Pseudomonas sp.菌剂、蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus菌剂、醋酸钙不动杆菌Acenetobacter calcoaciticus菌剂、葡萄球菌Staphylococcus arlettae菌剂和解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens菌剂。本发明采用6种菌剂复合可提高微生物对Cr(VI)的吸附、还原、酶促反应等，从而提高菌剂对Cr(VI)的去除效果。

Description

一种Cr(VI)去除复合菌剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及污染土壤修复技术领域，尤其涉及Cr(VI)去除复合菌剂，更加涉及聚氨酯泡沫固定化Cr(VI)去除菌及其制备方法。

背景技术

铬污染主要是指由工业活动引起的Cr(VI)大量排放造成的水体或土壤污染。污染土壤中的铬来源有：铬盐生产排放的铬渣引起堆放处周围土壤污染；大气沉降引起的土壤铬污染，其来源是能源、冶金、运输和建筑材料生产产生的粉尘；利用制革、冶金、电镀等行业污染排放的污水灌溉引起的土壤铬污染；农药化肥的使用。铬的毒性与其存在形式有关，通常认为金属铬毒性最小，Cr(Ⅲ)毒性很低，而Cr(VI)毒性最大，这主要由于人体吸收途径不同，例如人体胃肠道对Cr(Ⅲ)的吸收为1％左右，对Cr(VI)的吸收是Cr(Ⅲ)的3～5倍。同时，Cr(VI)的生物毒性约比Cr(Ⅲ)要高100倍，是强致突变物质，美国的环境保护机构(USEPA)已将其认定为是严重危害人类健康的17种化学物质之一。

铬污染土壤的治理和修复，通常采用两种方式：一是将污染物从土壤中完全去除；二是将土壤中污染物影响如毒性、水溶性等较大的价态，采用物理、化学或生物方法转化成其他影响较小的价态，力求使之固定或沉淀，减小生物可利用性，不再随自然界的循环而扩大污染范围。非生物的传统治理方法，每种方法各有利弊，但总体而言，治理方法耗资庞大，并可能造成二次化学污染。传统治理方法的措施存在一定的缺陷和局限性，都未能成为较为理想的土壤铬污染治理措施。

因此，研发者开发出微生物修复技术对Cr(VI)污泥进行修复。已知本领域技术中有采用固定化微生物法修复Cr(VI)污泥，可以提高单位被污染土壤内的微生物量，加强生物修复技术的效果，达到修复Cr(VI)污染土壤的生态效果。目前，从提高生物量角度，主要是采用固定化技术。传统的固定化载体材料采用海藻酸钙，其在碱性、高盐度条件下具有易分解、耐受性差的问题。后面采用聚氨酯泡沫作为载体，但仍存在表面积不够大，制得微生物不够稳定，对Cr(VI)处理去除率不高的问题。

发明内容

基于上述问题，本发明提供了一种Cr(VI)去除复合菌剂及其制备方法，其对Cr(VI)具有较好的去除效果，较适用于修复Cr(VI)污染的土壤。

为了解决上述问题，本发明第一方面提供了一种Cr(VI)去除复合菌剂，包括节杆菌属Arthrobacter sp.菌剂、假单胞菌属Pseudomonas sp.菌剂、蜡状芽孢杆菌Bacilluscereus菌剂、醋酸钙不动杆菌Acenetobacter calcoaciticus菌剂、葡萄球菌Staphylococcus arlettae菌剂和解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens菌剂。

Cr(VI)的微生物去除可能包括多种同步反应，如，与具有某些官能团的细胞表面分子形成化学键，Cr⁶⁺被吸附在微生物细胞上；吸附的Cr⁶⁺可通过铬酸盐还原酶还原成Cr³⁺；Cr⁶⁺通过摄取系统(硫酸盐转运蛋白)进入微生物细胞；在细胞内，它通过高度不稳定的中间体Cr⁴⁺/Cr⁵⁺还原成Cr³⁺，在金属结合蛋白的帮助下发生Cr⁶⁺的细胞内易位；细胞壁内Cr⁶⁺的积累；通过铬特异性外排系统从细胞中除去过量的Cr⁶⁺。本发明采用6种菌剂复合可提高微生物对Cr(VI)的吸附、还原、酶促反应等从而提高菌剂对Cr(VI)的去除效果。

作为一较佳技术方案，所述节杆菌属Arthrobacter sp.菌剂的基因序列如SEQ IDNO:1所示，其来源可为国家标物中心网上的C23408号产品。所述假单胞菌属Pseudomonassp.菌剂的基因序列如SEQ ID NO:2所示，其来源可为国家标物中心网上的C23438号产品。所述蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus菌剂的基因序列如SEQ ID NO:3所示，其来源可为明舟生物的BMZ135313产品。所述醋酸钙不动杆菌Acenetobacter calcoaciticus菌剂的基因序列如SEQ ID NO:4所示，其来源可为明舟生物的B84273产品。所述葡萄球菌Staphylococcusarlettae菌剂的基因序列如SEQ ID NO:5所示，其来源可为明舟生物的CCUG 33610产品。所述解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens菌剂的基因序列如SEQ ID NO:6所示，其来源可为明舟生物的BMZ135127产品。

作为一较佳技术方案，所述节杆菌属Arthrobacter sp.菌剂、所述假单胞菌属Pseudomonas sp.菌剂、所述蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus菌剂、所述醋酸钙不动杆菌Acenetobacter calcoaciticus菌剂、所述葡萄球菌Staphylococcus arlettae菌剂和所述解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens菌剂的复配生物量比例为6:3:3:1:1:1。采用此比例的复合菌剂，其Cr(VI)去除效率最高。

作为一较佳技术方案，所述节杆菌属Arthrobacter sp.菌剂、所述假单胞菌属Pseudomonas sp.菌剂、所述蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus菌剂、所述醋酸钙不动杆菌Acenetobacter calcoaciticus菌剂、所述葡萄球菌Staphylococcus arlettae菌剂和所述解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens菌剂经皮革厂排水口污泥筛选、驯化及鉴定可得。通过一系列的筛选、驯化、鉴定、复配出最佳组合的Cr(VI)去除菌菌剂，测定其最小抑制浓度，最终将该菌剂应用于Cr(VI)污染土壤生态修复中。该方法高效、无二次污染、成本低廉、对环境友好。

本发明第二方面提供了一种聚氨酯泡沫固定化Cr(VI)去除菌，包括聚氨酯泡沫载体和吸附固载于所述聚氨酯泡沫载体中的前述的Cr(VI)去除复合菌剂。

本发明采用聚氨酯泡沫作为固定化载体固定化Cr(VI)去除菌，具有较好的亲水性、孔结构、微生物亲和性以及耐生物去除性等特点，固定化聚氨酯泡沫载体中的Cr(VI)去除菌在好氧条件下可将毒性较大的Cr(VI)转化成毒性较小的Cr(Ⅲ)并固定在土壤中，达到污染治理的效果。

作为一较佳技术方案，所述聚氨酯泡沫载体包括具有第一孔径的第一聚氨酯泡沫载体和具有第二孔径的第二聚氨酯泡沫载体，所述第一孔径的尺寸为2.74±0.56mm，所述第二孔径的尺寸为1.18±0.33mm。本发明复配两种不同孔径的聚氨酯泡沫载体制得固定化Cr(VI)去除菌，以满足不同时期的Cr(VI)去除菌，可大幅提高去除效率。

作为一较佳技术方案，所述第一聚氨酯泡沫载体的制备原料包括按重量份数计的聚酯多元醇37～43份、三乙醇胺1.5～2.5份、水1.5～2.5份、甲基硅油1.5～2.5份、二月桂酸二丁基锡1.5～2.5份、石墨毡粉末1.6～2.4份和二苯基甲烷二异氰酸酯47～53份。所述第二聚氨酯泡沫载体的制备原料包括按重量份数计的聚酯多元醇37～43份、三乙醇胺1.5～2.5份、水1.5～2.5份、甲基硅油1.5～2.5份、二月桂酸二丁基锡1.5～2.5份和二苯基甲烷二异氰酸酯47～53份。通过配方不同而制备两种不同孔径的聚氨酯泡沫载体。

本发明第三方面提供了聚氨酯泡沫固定化Cr(VI)去除菌的制备方法，包括步骤：

(1)聚氨酯泡沫载体的制备

将制备原料的各组分搅拌均匀后进行自然发泡；

(2)聚氨酯泡沫载体的改性

将所述聚氨酯泡沫载体依次浸泡于二甲基甲酰胺溶液、丁二酰亚胺溶液和氢氧化钠溶液中，再烘干备用；

(3)聚氨酯泡沫载体固定化Cr(VI)去除菌

将步骤(2)改性后的所述聚氨酯泡沫载体用蒸馏水清洗数次后干燥，再置于LB固体培养基中，经灭菌处理后加入Cr(VI)去除复合菌剂，于28～31℃，110～150rpm下振荡培养2～4d。

本发明的聚氨酯泡沫载体在吸附固载去除菌之前，先依次浸泡于二甲基甲酰胺溶液、丁二酰亚胺溶液和氢氧化钠溶液中，以对聚氨酯泡沫进行改性。其中，二甲基甲酰胺为有机溶剂，丁二酰亚胺是为了引入羧基等化学基团，改善聚氨酯载体表面电荷的分布，提高亲水性能，进而改善载体固定化微生物膜结合力等，氢氧化钠是让载体质子化以使微生物更容易与载体结合。经改性后的聚氨酯泡沫具有比表面积更大，制得的固定化微生物小球性能更稳定，单体体积内可容纳的Cr(VI)去除菌更多、对环境耐受性更优良、不易受微生物分解、使用寿命更长。其中，二甲基甲酰胺溶液的浓度可为5～10wt.％，氢氧化钠溶液可为10wt.％的加热溶液。

本发明第四方面提供了聚氨酯泡沫固定化Cr(VI)去除菌在Cr(VI)污染土壤修复中的应用。

通过控制土壤的含水率为10～40％、溶解氧为2～5mg/L、pH为7～9且具备必备营养元素等系列条件可使Cr(VI)去除菌保持最佳的处理效率。经过本发明的聚氨酯泡沫固定化Cr(VI)去除菌去除污泥后，Cr(VI)小于3mg/kg，符合《建设用地土壤污染风险标准》的规定，经过处理后的污泥没有破坏本身土壤的物化结构，处理后的土壤可以直接填制当做正常的土壤使用，实现污染物的无害化及资源化利用。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和有益效果，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。需说明的是，下述实施所述方法是对本发明做的进一步解释说明，不应当作为对本发明的限制。

实施例1(Cr(VI)去除复合菌剂)

(1)筛选及驯化

A.将1wt％皮革厂排水口污泥接种到富集培养基中进行培养，培养条件为：温度25～30℃，pH为7～9，转速为150～180rpm/min，培养2～3d，得到富集培养基悬浮液，其中，富集培养基包括蛋白胨5g/L、酵母膏浸出粉5g/L、NaCl 10g/L。

B.将处于对数期的富集培养基悬浮液接种到含Cr(VI)LB液体培养基上进行培养(每次培养3～4d)，并逐渐提高Cr(VI)浓度，直至Cr(VI)对菌株具有明显抑制。Cr(VI)LB液体培养基包括：Cr(VI)(50、100、200、300、400、500mg/L)、蛋白胨5g/L、NH₄NO₃ 0.5g·L^-1、KH₂PO₄ 0.5g·L^-1、NaCl 0.3g·L^-1、MgSO₄·7H₂O 0.25g·L^-1、FeCl₃ 0.05g·L^-1、CaCl₂0.02g·L^-1，微量元素，121℃灭菌30min。微量元素为2％，微量元素包括：H₃BO₄ 2.86g/L，MnCl₂·4H₂O 1.81g/L，ZnSO₄ 0.222g/L，Na₂MoO₄ 0.39g/L，CuSO₄·5H₂O 0.079g/L，Co(NO₃)₂·6H₂O 49.4g/L。

C.最小抑制浓度测定，试验所用试剂K₂Cr₂O₇配制成高浓度母液(10000mg/L Cr⁶⁺)，并用微孔滤膜过滤除菌。对LB培养基进行高压蒸汽灭菌(121℃，20min)，待其冷却到50℃左右，加入适量的重金属母液(用滤膜过滤筛菌)，配置不同浓度梯度的重金属培养基Cr6⁺(20、50、100、150、200、250、300、350mg/L)调节pH≤5，防止金属离子沉淀。在无菌操作台中用打孔器在空白处理菌落边缘取生长状况良好的菌饼(D＝5mm)，倒置放于重金属培养基的正中央，于26℃生化培养箱中培养。每个浓度设置3个重复，培养观察14d，测定菌株最小抑制浓度，MIC为重金属抑制生物细胞生长的最低浓度。采用十字交叉法测量菌落直径并记录菌落形态(质地、形状、颜色等)。

D.将处于对数期的富集培养基悬浮液接种到含Cr(VI)LB液体培养基上进行培养，直至所述LB固体培养基表面长出清晰菌落。将LB固体培养基上的菌落通过平板划线法进行3次纯化得到单一菌落(命名菌A、B、C、D等)。

E.将供试菌株(菌A、B、C、D等)接入到以无机盐Cr(VI)培养基，进行去除试验，检测培养基中Cr(VI)去除情况，去除率高的即为目标菌种。

F.通过正交实验将筛选出的高效Cr(VI)去除菌进行复配，接入到以无机盐Cr(VI)培养基，进行去除试验，检测培养基中Cr(VI)去除率，去除率高的复配菌株即为高效Cr(VI)去除菌。

(2)纯化和PCR扩增

A.将菌株生长在空白LB固体培养基培养2～3d，通过刀片刮去表面的菌株放入研磨皿中研磨后的菌粉放入1.5ml离心管中，分别加入0.2ml的磷酸缓冲液(PBS，pH7.4)，涡旋器上振荡10min。12000×4℃离心2min，然后重复加入0.2ml的PBS，共洗涤3次。提取的DNA采用Promega基因组DNA纯化试剂盒，进行纯化。

B.将纯化所得DNA进行适当稀释后作为模板，使用16S rDNA中V3区特异性引物扩增目的片段。扩增前预先测定和调整各模板的DNA浓度，使不同样品尽可能以等量DNA作为模板进行PCR扩增。每100μl反应体系中正反向引物浓度为0.1μmol/L，每种dNTP的浓度为0.2mmol/L，Taq酶含量为5U，并设置阴性对照。为提高扩增产物的特异性，使用热启动降落PCR，反应条件为94℃5min，冷却至80℃时加入Taq酶，65℃退火30s，以后每个循环温度降低1℃，直至退火温度为55℃，72℃1min延伸。并且在55℃进行15个循环，72℃最终延伸7min，扩增产物用1.5％琼脂糖检验。

(3)鉴定

将PCR扩增后的DNR产物送入华大基因(广州)进行测序，将所得序列提交到GenBank数据库，用Blast软件在GenBank数据库中进行相似性比较，获取同源性较高的相关菌株的16S rRNA基因序列。进过鉴定，上述分离到的Cr(VI)去除菌及菌株号分别为节杆菌属Arthrobacter sp.(菌株号ar1482)、假单胞菌属Pseudomonas sp.(菌株号ps1369)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)(菌株号ba556)、醋酸钙不动杆菌(Acenetobactercalcoaciticus)(菌株号ac469)、葡萄球菌(Staphylococcus arlettae(菌株号st2516)、解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens(菌株号ba3313)。且六种菌剂的复配生物量比例为6:3:3:1:1:1。

其中，节杆菌属Arthrobacter sp.为杆状，革兰氏阴性，其基因序列如SEQ ID NO:1所示。

假单胞菌属Pseudomonas sp.为球状，革兰氏阴性，其基因序列如SEQ ID NO:2所示。

蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus为杆状，革兰氏阴性，其基因序列如SEQ ID NO:3所示。

醋酸钙不动杆菌Acenetobacter calcoaciticus为杆状，革兰氏阴性，其基因序列如SEQ ID NO:4所示。

葡萄球菌Staphylococcus arlettae为球状，革兰氏阴性，其基因序列如SEQ IDNO:5所示。

解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens为杆状，革兰氏阴性，其基因序列如SEQ ID NO:6所示。

实施例2(聚氨酯泡沫固定化Cr(VI)去除菌)

(1)聚氨酯泡沫载体的制备

按重量份计，将聚酯多元醇40份、三乙醇胺2份、水2份、甲基硅油2份、二月桂酸二丁基锡2份以及碾碎后的石墨毡粉末2份(每次3片3×3cm)一起超声分散5～10s后搅拌均匀，再加入二苯基甲烷二异氰酸酯(MDI)50份，搅拌3～5s至发白，迅速转移进行自然发泡24h，制得第一聚氨酯泡沫载体。

按重量份计，将聚酯多元醇40份、三乙醇胺2份、水2份、甲基硅油2份和二月桂酸二丁基锡2份一起超声分散5～10s后搅拌均匀，再加入二苯基甲烷二异氰酸酯(MDI)50份，搅拌3～5s至发白，迅速转移进行自然发泡24h，制得第二聚氨酯泡沫载体。

将制作好的第一聚氨酯泡沫载体和第二聚氨酯泡沫载体切成1cm×1cm×0.5cm的长方体，对其孔径进行统计和测量，第一聚氨酯泡沫载体对应的第一孔径的尺寸为2.74±0.56mm，第二聚氨酯泡沫载体对应的第二孔径的尺寸为1.18±0.33mm。

(2)聚氨酯泡沫载体的改性

将第一聚氨酯泡沫载体依次浸泡于8wt.％的二甲基甲酰胺溶液中，再置于适量的丁二酰亚胺溶液中浸泡过夜，再置于10wt.％的加热的氢氧化钠溶液中搅拌反应2h，取出聚氨酯泡沫冷却，烘干备用，以制得改性后的第一聚氨酯泡沫载体。对第二聚氨酯泡沫载体采用同样的方式以制得改性后的第二聚氨酯泡沫载体。

(3)聚氨酯泡沫载体固定化Cr(VI)去除菌

将改性后的第一聚氨酯泡沫载体和第二聚氨酯泡沫载体用蒸馏水清洗数次，并使其完全干燥，然后置于LB固体培养基中，经过灭菌处理后加入实施例1所得的Cr(VI)去除复合菌剂，30℃，120rpm振荡培养3d，经固定化后得到固定化Cr(VI)去除菌。

实施例3(聚氨酯泡沫固定化Cr(VI)去除菌对Cr(VI)的去除)

制备九种含铬污泥以检测实施例2的聚氨酯泡沫固定化Cr(VI)去除菌对其中Cr(VI)的去除率，九种污泥的详细信息如下所示。

污泥一：将1％Cr(VI)投入含Cr(VI)的土壤中，Cr(VI)含量为1000mg/kg，搅拌均匀，并调节C/N/P为100:20:1，含水率为20％。

污泥二：于污泥一的基础上将Cr(VI)含量调为800mg/kg，搅拌均匀，并调节C/N/P为100:20:1，含水率为20％。

污泥三：于污泥一的基础上将Cr(VI)含量调为600mg/kg，搅拌均匀，并调节C/N/P为100:20:1，含水率为20％。

污泥四：于污泥一的基础上将Cr(VI)含量调为400mg/kg，搅拌均匀，并调节C/N/P为100:20:1，含水率为20％。

污泥五：于污泥一的基础上将Cr(VI)含量调为200mg/kg，搅拌均匀，并调节C/N/P为100:20:1，含水率为20％。

污泥六：于污泥一的基础上将Cr(VI)含量调为100mg/kg，搅拌均匀，并调节C/N/P为100:20:1，含水率为20％。

污泥七：于污泥一的基础上将Cr(VI)含量调为400mg/kg，搅拌均匀，并调节C/N/P为100:20:1，含水率为10％。

污泥八：于污泥一的基础上将Cr(VI)含量调为400mg/kg，搅拌均匀，并调节C/N/P为100:20:1，含水率为30％。

污泥九：于污泥一的基础上将Cr(VI)含量调为400mg/kg，搅拌均匀，并调节C/N/P为100:20:1，含水率为40％。

另外，为了说明本发明Cr(VI)去除复合菌剂的去除效果，特设计对比例1和对比例2进行对比。对比例1为采用实施例1的Cr(VI)去除复合菌但不采用实施例2的聚氨酯泡沫载体进行固化。对比例2为采用实施例1的Cr(VI)去除复合菌且采用聚氨酯泡沫载体进行固化，但不对聚氨酯泡沫载体进行改性。对比例1和对比例2中具体处理条件与实施例一致。

采用实施例2的聚氨酯泡沫固定化Cr(VI)去除菌、对比例1的Cr(VI)去除复合菌和对比例2的聚氨酯泡沫固定化Cr(VI)去除菌分别对九种污泥进行Cr(VI)去除检测，其检测方法参照《GBT 15555.4-1995；固体废物六价铬的测定》和《HJ557-2010固体废物浸出毒性浸出方法水平振荡法》，结果如表1所示。

表1各实验的Cr(VI)去除检测结果

由表1的结果可知，采用本发明的聚氨酯泡沫固定化Cr(VI)去除菌对Cr(VI)有较高的去除能力，在不同的Cr(VI)含量下，其去除率皆达到了98％以上。且比较污泥一和其他污泥中的结果可知，Cr(VI)的含量增加至1000mg/kg后会对微生物有一定抑制作用。比较污泥四和污泥七至九可知，Cr(VI)土壤中含水率会对微生物有一定影响，含水率过低会降低微生物活性，过高将降低Cr(VI)污泥中氧含量最终导致去除率的降低。说明聚氨酯泡沫固定化Cr(VI)去除菌对Cr(VI)的去除效果均好于对比例1和对比例2。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，但是也并不仅限于实施例中所列，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110> 广东中微环保生物科技有限公司

<120> 一种Cr(VI)去除复合菌剂及其制备方法

<141> 2021-12-30

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1098

<212> DNA

<213> 节杆菌属Arthrobacter sp.

<400> 1

gataagcctg ggaaactggg tctaataccg gatatgacct tccatcgcat ggtggttggt 60

ggaaagcttt tgtggttttg gatggactcg cggcctatca gcttgttggt ggggtaatgg 120

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<211> 1712

<212> DNA

<213> 假单胞菌属Pseudomonas sp.

<400> 2

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cactccccga tgagcaggtc gtagaccgaa tgctcgagct cgtgcttgtc cacaccgctg 1380

cccatggtgg cgttgccctg cggatcgagg tcgatcagca ggacacgacg cttggtcgca 1440

gccagcgagg cggcgagatt gatacaggtg gttgtcttgc ccacaccacc tttctggttc 1500

gcgattgcga ataccttagc cattgttgcg agtgttccca gtcatgcctt gcggcgcagt 1560

atcagcagat ggcgctggcc ctggcaaccc ggaacggtca gggcctgttc gctttccact 1620

gtgaagtctg cgggcaatgc taccagttca tcggcaggat gcagcccctt cattgcaagc 1680

cattgcgtcc cggtgtcgcc caagtggcgg gt 1712

<210> 3

<211> 1785

<212> DNA

<213> 蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus

<400> 3

tataacatgt ggacagtttt aatcacatgt gggtaaatga ttatccacat ttgctttttt 60

tgtcgaaaac cctatctcat atacaaacga cgtttttagg ttttaaaata cgtttcgtat 120

aaatatacat tttatattta tttaggttgt acatttgttg cgcaacctta ttcttttacc 180

atcttagtaa aggagggaca cctttggaaa acatctctga tttatggaac agcgccttaa 240

aagaactaga aaaaaaggtc agtaaaccaa gttatgaaac atggttaaaa tcaacgaccg 300

cacataattt aaaaaaagat gtattaacaa ttacggctcc aaatgaattc gcccgcgatt 360

ggctagaatc tcattattca gagctaattt cagaaacact ttatgattta acaggggcaa 420

aattagctat tcgctttatt attccccaaa gtcaagctga agaggagatt gatcttcctc 480

cttctaaacc gaattcagca caagatgatt ctaatcattt accacagagt atgctaaatc 540

caaaatatac gtttgatacg tttgttattg gctctggtaa ccgttttgct cacgctgctt 600

cattggccgt agccgaagcg ccagctaaag catataatcc cctctttatt tatgggggag 660

ttggacttgg aaagacccat ttaatgcatg caattggtca ttatgtaatt gaacataacc 720

caaatgccaa agttgtatat ttatcatcag aaaaatttac aaatgaattc attaattcta 780

ttcgtgataa taaagctgtc gattttcgta ataaataccg caatgtggat gttttattga 840

tagatgatat tcaattttta gcgggaaaag aacaaactca agaagagttt ttccatacat 900

tcaatgcatt acacgaagaa agtaaacaaa ttgtaatttc cagtgatcgg ccaccaaaag 960

aaattccaac tttagaagat cgtcttcgtt ctcgctttga atggggactc attacggata 1020

ttacgccacc agatttagaa acgcgtattg caattttgcg caaaaaggca aaggctgaag 1080

gacttgatat accaaatgag gtcatgcttt atattgcaaa tcaaatcgat tcaaatattc 1140

gtgaactaga aggtgcactc atccgagttg tagcttattc atctttaatt aacaaagata 1200

ttaatgctga tttagcagcc gaagcactta aagatattat tccaaattct aaaccaaaaa 1260

ttatctccat ttatgatatt caaaaagctg taggagatgt ttatcaagta aaattggaag 1320

atttcaaggc gaaaaagcga acgaaatcag ttgccttccc tcgccaaatt gcaatgtatt 1380

tatcacgtga actgacagac tcctccttac ctaaaatagg tgaagaattc ggtggacgtg 1440

atcatacaac agttatccat gctcatgaaa aaatttctaa gctacttaag acggatacgc 1500

aattacaaaa gcaagttgaa gaaattaacg atattttaaa gtagtagctg aatagtgtga 1560

ataactttcc ttgttttacg cacagtctat ccacatgtag atagactgtt tttacatcct 1620

ttaacagggt tatccacata tccacaagcc ctattactat tactactatt ttttatcttt 1680

attaattaaa taaaatctta tacttaccgg aggtttttct ttatgcgttt tacaatacaa 1740

aaagactatc ttgtaagaag tgtacaagat gtaatgaagg ctgtt 1785

<210> 4

<211> 657

<212> DNA

<213> 醋酸钙不动杆菌 Acenetobacter calcoaciticus

<400> 4

agcggcggac gggtgagtaa tgcttaggaa tctgcctatt agtgggggac aacattccga 60

aaggaatgct aataccgcat acgccctacg ggggaaagca ggggatcttc ggaccttgcg 120

ctaatagatg agcctaagtc ggattagcta gttggtgggg taaaggccta ccaaggcgac 180

gatctgtagc gggtctgaga ggatgatccg ccacactggg actgagacac ggcccagact 240

cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgg acaatgggcg gaagcctgat ccagccatgc 300

cgcgtgtgtg aagaaggcct tttggttgta aagcacttta agcgaggagg aggctccttt 360

agttaatacc taaagagagt ggacgttact cgcagaataa gcaccggcta actctgtgcc 420

agcagccgcg gtaatacaga gggtgcgagc gttaatcgga tttactgggc gtaaagcgtg 480

cgtaggcggc tttttaagtc ggatgtgaaa tccctgagct taacttagga attgcattcg 540

atactggaaa gctagagtat gggagaggat ggtagaattc caggtgtagc ggtgaaatgc 600

gtagagatct ggaggaatac cgatggcgaa ggcagccatc tggcctaata ctgacgc 657

<210> 5

<211> 506

<212> DNA

<213> 葡萄球菌 Staphylococcus arlettae

<400> 5

catcaacggt actgcttgac gttgcatgtt cgcacccatt aatgcacggt tagagtcatc 60

gttttctaag aaaggaatac atgccgttgc agctgaaact acttgcttag gtgatacgtc 120

catgtagtcc attttttctt tagccataac tgtgttatta ccgcggaaac gacaaacaac 180

ttcgtcatct aaaaacttac cattttcatc taagttagag ttggcttgtg ctaccacata 240

gctgtcctct tcatcagcag ttaggtaatc aatttgatct gtaattgagt ttgttgctaa 300

atctacttta cggtacggcg tttcgataaa gccaaattca tttacacgtg cataacttga 360

tagtgagtta attaaaccga tgtttggtcc ctctggtgtt tcgataggac acatacggcc 420

atagtgagaa tagtgtacgt cacgtacttc catttgagca cgttcacgtg ttaaaccacc 480

aggtcctaat gctgataaac gacgtt 506

<210> 6

<211> 884

<212> DNA

<213> 解淀粉芽孢杆菌 Bacillus amyloliquefaciens

<400> 6

agcgttatcg tatcccgggc gcttccggat gtgcgtgacg gtctgaagcc ggttcacaga 60

cggattttat acgcaatgaa tgatttaggc atgaccagtg acaagccata taaaaaatct 120

gcccgtatcg tcggtgaagt tatcggtaag taccacccgc acggtgattc agcggtttac 180

gaatcaatgg tcagaatggc gcaggatttt aactaccgct acatgcttgt tgacggacac 240

ggcaacttcg gttcggtaga cggcgactca gcggctgcga tgcgttatac agaagcgaga 300

atgtcaaaaa tcgcaatgga aattctgcgt gacattacga aagacacgat tgactatcaa 360

gacaactatg acggttcaga aagagaacca gccgtcatgc cttcaagatt tccgaatctg 420

ctcgtgaacg gggctgccgg tattgcggtc ggaatggcga caaacattcc tccgcatcag 480

cttggggaag tcattgacgg cgtgcttgcc gtaagtgaaa atccagagat tacaatccaa 540

gagctgatgg aatacatccc gggaccggat tttccgacgg ccggccagat tttaggccgg 600

agcggcatcc gtaaggcata tgaatccgga cggggatcca ttacgatccg ggctaaggct 660

gaaatcgaac agacatcatc aggaaaagaa agaattattg tcacggaact tccttatcag 720

gtgaacaagg cgagattaat tgaaaaaatc gcagatcttg tccgggacaa aaaaatcgaa 780

ggaattaccg atctgcgtga cgaatccgac cgtaacggaa tgagagtcgt cattgagctc 840

cgccgtgacg ccaatgctca cgtcattttg aataacctgt acaa 884

Claims

1.一种Cr(VI)去除复合菌剂，其特征在于，包括节杆菌属Arthrobacter sp.菌剂、假单胞菌属Pseudomonas sp.菌剂、蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus菌剂、醋酸钙不动杆菌Acenetobacter calcoaciticus菌剂、葡萄球菌Staphylococcus arlettae菌剂和解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens菌剂。

2.根据权利要求1所述的Cr(VI)去除复合菌剂，其特征在于，所述节杆菌属Arthrobacter sp.菌剂、所述蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus菌剂、所述蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus菌剂、所述醋酸钙不动杆菌Acenetobacter calcoaciticus菌剂、所述葡萄球菌Staphylococcus arlettae菌剂和所述解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens菌剂的基因序列分别如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6所示。

3.根据权利要求1所述的Cr(VI)去除复合菌剂，其特征在于，所述节杆菌属Arthrobacter sp.菌剂、所述假单胞菌属Pseudomonas sp.菌剂、所述蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus菌剂、所述醋酸钙不动杆菌Acenetobacter calcoaciticus菌剂、所述葡萄球菌Staphylococcus arlettae菌剂和所述解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens菌剂的复配生物量比例为6:3:3:1:1:1。

4.根据权利要求1所述的Cr(VI)去除复合菌剂，其特征在于，所述节杆菌属Arthrobacter sp.菌剂、所述假单胞菌属Pseudomonas sp.菌剂、所述蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus菌剂、所述醋酸钙不动杆菌Acenetobacter calcoaciticus菌剂、所述葡萄球菌Staphylococcus arlettae菌剂和所述解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens菌剂经皮革厂排水口污泥筛选、驯化及鉴定可得。

5.一种聚氨酯泡沫固定化Cr(VI)去除菌，其特征在于，包括聚氨酯泡沫载体和吸附固载于所述聚氨酯泡沫载体中的权利要求1～4任意一项所述的Cr(VI)去除复合菌剂。

6.根据权利要求5所述的聚氨酯泡沫固定化Cr(VI)去除菌，其特征在于，所述聚氨酯泡沫载体包括具有第一孔径的第一聚氨酯泡沫载体和具有第二孔径的第二聚氨酯泡沫载体，所述第一孔径的尺寸为2.74±0.56mm，所述第二孔径的尺寸为1.18±0.33mm。

7.根据权利要求6所述的聚氨酯泡沫固定化Cr(VI)去除菌，其特征在于，所述第一聚氨酯泡沫载体的制备原料包括按重量份数计的聚酯多元醇37～43份、三乙醇胺1.5～2.5份、水1.5～2.5份、甲基硅油1.5～2.5份、二月桂酸二丁基锡1.5～2.5份、石墨毡粉末1.6～2.4份和二苯基甲烷二异氰酸酯47～53份。

8.根据权利要求6所述的聚氨酯泡沫固定化Cr(VI)去除菌，其特征在于，所述第二聚氨酯泡沫载体的制备原料包括按重量份数计的聚酯多元醇37～43份、三乙醇胺1.5～2.5份、水1.5～2.5份、甲基硅油1.5～2.5份、二月桂酸二丁基锡1.5～2.5份和二苯基甲烷二异氰酸酯47～53份。

9.根据权利要求5～8任意一项所述的聚氨酯泡沫固定化Cr(VI)去除菌的制备方法，其特征在于，包括步骤：

(1)聚氨酯泡沫载体的制备

将制备原料的各组分搅拌均匀后进行自然发泡；

(2)聚氨酯泡沫载体的改性

(3)聚氨酯泡沫载体固定化Cr(VI)去除菌

10.根据权利要求5～8任意一项所述的聚氨酯泡沫固定化Cr(VI)去除菌或权利要求9所述的聚氨酯泡沫固定化Cr(VI)去除菌的制备方法所制备的聚氨酯泡沫固定化Cr(VI)去除菌在Cr(VI)污染土壤修复中的应用。