CN110551652A - 一种复合微生物菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种复合微生物菌剂及其制备方法和应用 Download PDF

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CN110551652A CN201910803228.7A CN201910803228A CN110551652A CN 110551652 A CN110551652 A CN 110551652A CN 201910803228 A CN201910803228 A CN 201910803228A CN 110551652 A CN110551652 A CN 110551652A
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吴尚华
白志辉
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Abstract

本发明公开了一种复合微生物菌剂及其制备方法和应用，所述复合微生物菌剂包括嗜根寡养单胞菌X1和假单胞菌L1。所述的复合微生物菌剂的制备方法，包括：(1)将嗜根寡养单胞菌X1和假单胞菌L1分别进行纯培养，分别得到两种菌的种子液；(2)将嗜根寡养单胞菌X1的种子液和假单胞菌L1的种子液分别进行离心，分别收集两种菌的菌体；(3)将嗜根寡养单胞菌X1菌体和假单胞菌L1菌体分别用缓冲液重悬，将重悬后的菌液混合均匀，即得。将该复合微生物菌剂应用于Cr(VI)及PAHs复合存在的土壤中，该复合微生物菌剂能够同时去除Cr(VI)及PAHs，Cr(VI)的去除率高达88％，PAHs的去除率高达55％。

Description

一种复合微生物菌剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及环境微生物修复技术领域，特别是指一种复合微生物菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
随全球经济的快速发展，重金属-有机复合污染问题越来越突出，已经成为越来越重要的环境议题之一。铬盐系列产品是化工-轻工-高级合金材料的重要基础原料，广泛应用于鞣革、电镀、合金、颜料、印染、胶印及农业上，我国每年的铬盐产量已经超过16万吨，而铬渣排放量却在35～42万吨，其含有的Cr(VI)约在3500吨。Cr(VI)可穿过原核和真核细胞膜，造成氧化性细胞损伤，引起致畸、致癌等病变具有很强的毒性。目前我国已有许多地方相继报道土壤及水体因Cr(VI)污染而导致人体健康受到危害的事件。多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs)是由两个及以上芳香环稠合而成的典型有机污染物，在环境中分布广泛，且具有致癌、致畸和致突变等特性。人类活动是PAHs产生的重要途径，比如工业生产中煤、焦油、石油等有机质的不完全燃烧均可产生大量的PAHs。目前Cr(VI)及PAHs复合存在的污染场地较多，且修复难度较大，急需绿色有效的修复技术。
发明内容
针对现有技术的不足之处，本发明的目的是提出一种复合微生物菌剂及其制备方法和应用，将该复合微生物菌剂应用于Cr(VI)及PAHs复合存在的土壤中，该复合微生物菌剂能够同时去除Cr(VI)及PAHs，Cr(VI)的去除率高达88％，PAHs的去除率高达55％。
基于上述目的，本发明提供的一种复合微生物菌剂，所述复合微生物菌剂包括嗜根寡养单胞菌X1和假单胞菌L1。
在本发明的一些实施例中，所述复合微生物菌剂由嗜根寡养单胞菌X1和假单胞菌L1菌体数以(0.5～2):1比例混合而成，复合微生物菌剂中嗜根寡养单胞菌X1和假单胞菌L1的含量为1.0×107～10.0×107CFU/g。
在本发明中，嗜根寡养单胞菌(Stenotrophomonas rhizophila X1)购置于美国典型微生物菌种保藏中心，保藏编号：ATCC BAA-473T；假单胞菌(Pseudomonas mendocinaL1)购置于中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：ACCC 02173。本发明的发明人研究发现，嗜根寡养单胞菌X1具有去除Cr(VI)的作用，能够将Cr(VI)快速高效还原为Cr(Ⅲ)，降低铬的毒性及迁移性；假单胞菌L1具有去除多环芳烃的作用。因此，本发明的发明人尝试将嗜根寡养单胞菌X1和假单胞菌L1制成复合微生物菌剂，并确定了复合微生物菌剂中嗜根寡养单胞菌X1和假单胞菌L1的复配比例，在该比例范围内，复合微生物菌剂能够高效地去除Cr(VI)和PAHs。
基于相同的发明构思，本发明还提供了上述复合微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将嗜根寡养单胞菌X1和假单胞菌L1分别进行纯培养，分别得到嗜根寡养单胞菌X1的种子液和假单胞菌L1的种子液；
(2)将嗜根寡养单胞菌X1的种子液和假单胞菌L1的种子液分别进行离心，分别收集嗜根寡养单胞菌X1菌体和假单胞菌L1菌体；
(3)将嗜根寡养单胞菌X1菌体和假单胞菌L1菌体分别用缓冲液重悬，将重悬后的菌液混合均匀，得到复合微生物菌剂。
在本发明的一些实施例中，在步骤(1)中，将嗜根寡养单胞菌X1和假单胞菌L1分别接种于LB培养基中，在28～32℃、120～180rpm条件下进行纯培养，分别得到嗜根寡养单胞菌X1的种子液和假单胞菌L1的种子液；
在步骤(2)中，离心为4000～6000r/min下离心2～5min；
在步骤(3)中，重悬后的菌液的OD600值为0.8～1.2；
在步骤(3)中，重悬后的嗜根寡养单胞菌X1菌液和重悬后的假单胞菌L1菌液按照体积比(0.5～2):1的比例混合均匀。
基于相同的发明构思，本发明还提供了上述复合微生物菌剂在铬和多环芳烃污染土壤修复中的应用。
在本发明的一些实施例中，所述铬为六价铬，所述多环芳烃包括芘。
在本发明的一些实施例中，将复合微生物菌剂以0.1～2％的接种量接种于铬和多环芳烃污染土壤中，在28～32℃、120～180rpm的条件下处理7d～20d。
将上述复合微生物菌剂应用在铬和PAHs污染土壤的修复中，该复合菌剂在纯培养和环境土壤中可以将Cr(VI)快速高效还原为Cr(Ⅲ)，降低铬的毒性及迁移性，同时降解PAHs，即本发明的复合微生物菌剂能够同时去除铬和PAHs；而且复合微生物菌剂Cr(VI)的去除率＞(嗜根寡养单胞菌X1+假单胞菌L1)Cr(VI)的去除率，复合微生物菌剂PAHs的去除率＞(嗜根寡养单胞菌X1+假单胞菌L1)PAHs的去除率。即复合微生物菌剂能够实现铬、多环芳烃污染土壤的协同修复，Cr(VI)的去除率高达88％，PAHs的去除率高达55％。
附图说明
图1为土壤中Cr(VI)的去除率随时间变化曲线图；
图2为土壤中芘的去除率随时间变化曲线图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。
以下实施例中所涉及到的菌株来源为：嗜根寡养单胞菌(Stenotrophomonasrhizophila X1)购置于美国典型微生物菌种保藏中心，保藏编号：ATCC BAA-473T；假单胞菌(Pseudomonas mendocina L1)购置于中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：ACCC 02173。
以下实施例中所涉及到的培养基和试剂为：
胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)：胰蛋白胨17g/L，大豆蛋白胨3g/L，葡萄糖2.5g/L，氯化钠5.0g/L，磷酸氢二钾2.5g/L，pH 7.3±0.2。
胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)：胰蛋白胨17g/L，大豆蛋白胨3g/L，葡萄糖2.5g/L，氯化钠5.0g/L，磷酸氢二钾2.5g/L，琼脂15g/L，pH 7.3±0.2。
牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏3.0g/L，蛋白胨10.0g/L，NaCl 5.0g/L，琼脂15.0g，pH7.0～7.2。
牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏3.0g/L，蛋白胨10.0g/L，NaCl 5.0g/L，pH7.0～7.2。
液体LB培养基：胰蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，氯化钠10.0g/L，pH 7.4±0.2。
PBS缓冲液配方：称取8g NaCl，1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4，溶于800mL蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1000mL。
实施例1复合微生物菌剂的制备
本实施例中复合微生物菌剂的制备方法包括以下步骤：
(1)嗜根寡养单胞菌X1菌液的制备
用接种环从解冻的甘油菌液管中挑取一环嗜根寡养单胞菌X1到TSA培养基进行划线分离培养。待48h平板长出合适大小的菌落以后，挑取一个菌落接种到LB培养液中，于150rpm/min，30℃摇床培养24h，作为种子液，将种子液在5000r/min下离心3min，收集菌体，将收集得到的菌体用PBS缓冲液重悬两次，调节菌液的OD600值到1.0。
(2)假单胞菌L1菌液的制备
用接种环从解冻的甘油菌液管中挑取一环假单胞菌L1到牛肉膏蛋白胨固体培养基进行划线分离培养。待48h平板长出合适大小的菌落以后，挑取一个菌落接种到LB培养液中，于150rpm/min，30℃摇床培养24h，作为种子液，将种子液在5000r/min下离心3min，收集菌体，将收集得到的菌体用PBS缓冲液重悬两次，调节菌液的OD600值到1.0。
(3)复合微生物菌剂的制备
将嗜根寡养单胞菌X1菌液和假单胞菌L1菌液按照体积比1:1的比例混合均匀，得到复合微生物菌剂。
实施例2复合微生物菌剂的制备
本实施例中复合微生物菌剂的制备方法包括以下步骤：
(1)嗜根寡养单胞菌X1菌液的制备
用接种环从解冻的甘油菌液管中挑取一环嗜根寡养单胞菌X1到TSA培养基进行划线分离培养。待48h平板长出合适大小的菌落以后，挑取一个菌落接种到LB培养液中，于180rpm/min，28℃摇床培养24h，作为种子液，将种子液在4000r/min下离心5min，收集菌体，将收集得到的菌体用PBS缓冲液重悬两次，调节菌液的OD600值到1.2。
(2)假单胞菌L1菌液的制备
用接种环从解冻的甘油菌液管中挑取一环假单胞菌L1到牛肉膏蛋白胨固体培养基进行划线分离培养。待48h平板长出合适大小的菌落以后，挑取一个菌落接种到LB培养液中，于180rpm/min，28℃摇床培养24h，作为种子液，将种子液在4000r/min下离心5min，收集菌体，将收集得到的菌体用PBS缓冲液重悬两次，调节菌液的OD600值到1.2。
(3)复合微生物菌剂的制备
将嗜根寡养单胞菌X1菌液和假单胞菌L1菌液按照体积比0.5:1的比例混合均匀，得到复合微生物菌剂。
实施例3复合微生物菌剂的制备
本实施例中复合微生物菌剂的制备方法包括以下步骤：
(1)嗜根寡养单胞菌X1菌液的制备
用接种环从解冻的甘油菌液管中挑取一环嗜根寡养单胞菌X1到TSA培养基进行划线分离培养。待48h平板长出合适大小的菌落以后，挑取一个菌落接种到LB培养液中，于120rpm/min，32℃摇床培养24h，作为种子液，将种子液在6000r/min下离心2min，收集菌体，将收集得到的菌体用PBS缓冲液重悬两次，调节菌液的OD600值到0.8。
(2)假单胞菌L1菌液的制备
用接种环从解冻的甘油菌液管中挑取一环假单胞菌L1到牛肉膏蛋白胨固体培养基进行划线分离培养。待48h平板长出合适大小的菌落以后，挑取一个菌落接种到LB培养液中，于120rpm/min，32℃摇床培养24h，作为种子液，将种子液在6000r/min下离心2min，收集菌体，将收集得到的菌体用PBS缓冲液重悬两次，调节菌液的OD600值到0.8。
(3)复合微生物菌剂的制备
将嗜根寡养单胞菌X1菌液和假单胞菌L1菌液按照体积比1.5:1的比例混合均匀，得到复合微生物菌剂。
实施例4复合微生物菌剂的制备
本实施例中复合微生物菌剂的制备方法包括以下步骤：
(1)嗜根寡养单胞菌X1菌液的制备
用接种环从解冻的甘油菌液管中挑取一环嗜根寡养单胞菌X1到TSA培养基进行划线分离培养。待48h平板长出合适大小的菌落以后，挑取一个菌落接种到LB培养液中，于170rpm/min，31℃摇床培养24h，作为种子液，将种子液在4500r/min下离心3min，收集菌体，将收集得到的菌体用PBS缓冲液重悬两次，调节菌液的OD600值到1.0。
(2)假单胞菌L1菌液的制备
用接种环从解冻的甘油菌液管中挑取一环假单胞菌L1到牛肉膏蛋白胨固体培养基进行划线分离培养。待48h平板长出合适大小的菌落以后，挑取一个菌落接种到LB培养液中，于170rpm/min，31℃摇床培养24h，作为种子液，将种子液在4500r/min下离心3min，收集菌体，将收集得到的菌体用PBS缓冲液重悬两次，调节菌液的OD600值到1.0。
(3)复合微生物菌剂的制备
将嗜根寡养单胞菌X1菌液和假单胞菌L1菌液按照体积比2:1的比例混合均匀，得到复合微生物菌剂。
对比例1嗜根寡养单胞菌X1菌液的制备
本对比例中嗜根寡养单胞菌X1菌液采用以下方法制备得到：
用接种环从解冻的甘油菌液管中挑取一环嗜根寡养单胞菌X1到TSA培养基进行划线分离培养。待48h平板长出合适大小的菌落以后，挑取一个菌落接种到LB培养液中，于150rpm/min，30℃摇床培养24h，作为种子液，将种子液在5000r/min下离心3min，收集菌体，将收集得到的菌体用PBS缓冲液重悬两次，调节菌液的OD600值到1.0。
对比例2假单胞菌L1菌液的制备
本对比例中假单胞菌L1菌液采用以下方法制备得到：
用接种环从解冻的甘油菌液管中挑取一环假单胞菌L1到牛肉膏蛋白胨固体培养基进行划线分离培养。待48h平板长出合适大小的菌落以后，挑取一个菌落接种到LB培养液中，于150rpm/min，30℃摇床培养24h，作为种子液，将种子液在5000r/min下离心3min，收集菌体，将收集得到的菌体用PBS缓冲液重悬两次，调节菌液的OD600值到1.0。
试验例1复合微生物菌剂用于去除土壤中Cr(VI)和芘
所述的六价铬Cr(VI)的存在形式均为重铬酸钾(K2CrO7)。
本试验例采用加入外源重铬酸钾、芘的丙酮母液的方法来模拟土壤中的Cr(VI)、PAHs(多环芳烃)污染，具体为：称取1kg土壤于无菌1000mL烧杯中，分别加入重铬酸钾溶液和芘母液(丙酮溶解)，使每kg土壤中Cr(VI)和芘的含量分别为100mg和60mg，得到同时含有Cr(VI)和芘的土壤样品。
本试验例通过设置空白对照组、嗜根寡养单胞菌X1菌液添加组、假单胞菌L1菌液添加组及复合微生物菌剂添加组4个不同处理来研究微生物的修复效果(每组3个重复)。试验过程中：分别取2mL实施例1制备的复合微生物菌剂、2mL对比例1制备的嗜根寡养单胞菌X1菌液和2mL对比例2制备的假单胞菌L1菌液接种到同时含有Cr(VI)和芘的土壤样品，使菌的最终浓度为107CFU/g，同时设置空白对照组(不加菌的空白对照只加入相应比例的PBS缓冲液)，即取2mL PBS缓冲液接种到同时含有Cr(VI)和芘的土壤样品。于150rpm/min，30℃摇床培养。于0d、3d、7d和15d进行破坏性取样，测定土壤中剩余的Cr(VI)和芘浓度。
土壤中Cr(VI)含量的测定先依照方法EPA3060A，通过碱法消解浸提出土壤中的Cr(VI)，然后再利用方法EPA7196A，利用比色法测定出Cr(VI)浓度。用碱消解法得到的样品中的六价铬，萃取液于二苯碳酰二肼反应，生成紫红色的溶液，然后再UV-VIS上测出其浓度，从而得到Cr(VI)含量。
涉及到的溶液如下：
5mol/L HNO3：取343ml浓HNO3，用去离子水稀释至1000mL。
消解溶液：将20.0±0.05g NaOH和30.0±0.05g Na2CO3溶解在容积为1L的容量瓶中，然后加入稀释至刻度线。将溶液在20-25℃下密封保存于聚乙烯瓶中，消解溶液的pH必须达到11.5或以上。
磷酸盐缓冲液：分别称取87.09g KH2PO4及68.04g K2HPO4，溶解后定量转入1L定量瓶中，用去离子水稀释至刻度。
1000mg/L的Cr(VI)：将2.829g干燥的(105℃)K2Cr2O7溶解于试剂水中，转移至1L的容量瓶中然后稀释至刻度线。
5mg/L的Cr(VI)：移取5mL Cr(VI)标准溶液，稀释至1L。
5％H2SO4：取50mL浓硫酸稀释至1L。
二苯碳酰二肼溶液：称取1g二苯碳酰二肼，溶于200mL丙酮，盛于棕色瓶中，加入2滴冰醋酸，存放于冰箱中。
具体步骤如下：
(1)准确称取2.5g土壤样品于锥形瓶中，准备平行样；
(2)锥形瓶中分别加入50±1mL的消解溶液，同时加入大约400mg的MgCl2和0.5mL1.0M的磷酸盐缓冲溶液。
(3)把样品放在振荡水槽中，于90～95℃振荡1小时；
(4)萃取完成后，让每个样品逐渐冷却至室温，过滤，滤液转移至250mL烧杯中；
(5)将上述烧杯放在搅拌器上，边搅拌边缓慢滴加5.0M HNO3至烧杯中，将pH值调节至7.5±0.5。
(6)把烧杯中溶液定量转入100mL容量瓶中，用去离子水定容在刻度线。重复步骤(2)～(6)制备一样品空白。
(7)显色：
移取20mL上述定容好的萃取液于50ml小烧杯中；
加入2mL二苯碳酰二肼溶液；
边搅拌边加入5％H2SO4溶液，调pH值为2.0±0.5。
溶液定量转入50mL容量瓶中，用去离子稀释至刻度。
放置5～10min后再UV-VIS上(1cm比色皿，540nm波长)测出其吸光值
(8)标准曲线的制备
分别移取5ml、10ml、20mL Cr(VI)工作溶液到50mL容量瓶中，重复显色步骤。
其中，C-样品在标准曲线上读得的浓度值(mg/L)，
B1-样品空白的浓度值(mg/L)，
B2-样品背景校正(mg/L，根据具体情况取舍)，
F-稀释因子，2.5，
V-萃取液(显色前)定容的体积，100mL，
m-样品质量，g。
根据上述步骤得到0d、3d、7d和15d土壤样品中的Cr(VI)含量，从而绘制出Cr(VI)的去除率曲线，结果见图1。
土壤中的芘先使用加速萃取仪进行提取，然后浓缩后的土壤提取液由气相色谱测定芘的浓度，具体步骤为：
称取土壤样品20.0g和适量硅藻土混匀，研磨成细小颗粒，转移至34mL不锈钢萃取池中，萃取条件为：萃取温度100℃，压力10342.1～13789.5kPa，静态萃取5min，二氯甲烷淋洗体积为20％池体积，氮气吹扫60s，静态萃取2次，收集萃取液，萃取液用无水硫酸钠干燥。使用平行浓缩仪进行浓缩至2mL，采用硅酸镁净化小柱进行净化(预先用4mL二氯甲烷淋洗，加5mL正己烷浸润)，继续加入2次5mL二氯甲烷-正己烷洗脱，收集洗脱液，浓缩后加入50.0μL内标使用液，定容至1mL，进行GC-MS检测。
色谱条件：进样口270℃，柱箱温度90℃(2min)→10℃/min→320℃(5min)，分流比5:1，柱流量1.0mL/min。
质谱条件：EI离子源温度230℃，传输线温度280℃，离子化能量70ev，扫描方式为全扫描，扫描范围45～450amu。
标准曲线的制作：配制成芘质量浓度分别为0、2.0、4.0、10.0、20.0、40.0μg/mL的混合标准系列，内标质量浓度20.0μg/mL，按照仪器条件，由低浓度到高浓度依次进行测定，通过浓度与对应峰面积建立标准曲线线性方程，并根据标准曲线线性方程计算出0d、3d、7d和15d土壤样品中的芘含量，从而绘制出芘的去除率曲线，结果见图2。
由图1可知，在0～3d内，随着时间的增加，嗜根寡养单胞菌X1菌液添加组、假单胞菌L1菌液添加组及复合微生物菌剂添加组，Cr(VI)的去除率增加，此时嗜根寡养单胞菌X1菌液添加组的Cr(VI)的去除率为13％，假单胞菌L1菌液添加组的Cr(VI)的去除率为5％，复合微生物菌剂添加组的Cr(VI)的去除率为20％，复合微生物菌剂添加组的Cr(VI)的去除率＞(嗜根寡养单胞菌X1菌液添加组+假单胞菌L1菌液添加组)的Cr(VI)的去除率；但在3d～7d内，随着时间的增加，假单胞菌L1菌液添加组Cr(VI)的去除率逐渐降为0，嗜根寡养单胞菌X1菌液添加组和复合微生物菌剂添加组，Cr(VI)的去除率继续增加，此时嗜根寡养单胞菌X1菌液添加组的Cr(VI)的去除率为63％，复合微生物菌剂添加组的Cr(VI)的去除率为75％，复合微生物菌剂添加组的Cr(VI)的去除率＞(嗜根寡养单胞菌X1菌液添加组+假单胞菌L1菌液添加组)的Cr(VI)的去除率；在7d～15d内，随着时间的增加，嗜根寡养单胞菌X1菌液添加组和复合微生物菌剂添加组，Cr(VI)的去除率继续增加，此时嗜根寡养单胞菌X1菌液添加组的Cr(VI)的去除率为77％，复合微生物菌剂添加组的Cr(VI)的去除率为88％，复合微生物菌剂添加组的Cr(VI)的去除率＞(嗜根寡养单胞菌X1菌液添加组+假单胞菌L1菌液添加组)的Cr(VI)的去除率。由此可知，复合微生物菌剂具有协同去除Cr(VI)的作用。
由图2可知，在0～3d内，随着时间的增加，嗜根寡养单胞菌X1菌液添加组、假单胞菌L1菌液添加组及复合微生物菌剂添加组，芘的去除率增加，此时嗜根寡养单胞菌X1菌液添加组的芘的去除率为4％，假单胞菌L1菌液添加组的芘的去除率为8％，复合微生物菌剂添加组的芘的去除率为13％，复合微生物菌剂添加组的芘的去除率＞(嗜根寡养单胞菌X1菌液添加组+假单胞菌L1菌液添加组)的芘的去除率；但在3d～7d内，随着时间的增加，假单孢L1菌液添加组、嗜根寡养单胞菌X1菌液添加组和复合微生物菌剂添加组，芘的去除率继续增加，此时嗜根寡养单胞菌X1菌液添加组的芘的去除率为5％，假单胞菌L1菌液添加组的芘的去除率为15％，复合微生物菌剂添加组的芘的去除率为42％，复合微生物菌剂添加组的芘的去除率＞(嗜根寡养单胞菌X1菌液添加组+假单胞菌L1菌液添加组)的芘的去除率；在7d～15d内，随着时间的增加，假单孢L1菌液添加组、嗜根寡养单胞菌X1菌液添加组和复合微生物菌剂添加组，芘的去除率继续增加，此时嗜根寡养单胞菌X1菌液添加组的芘的去除率为8％，假单胞菌L1菌液添加组的芘的去除率为15％，复合微生物菌剂添加组的芘的去除率为55％，复合微生物菌剂添加组的芘的去除率＞(嗜根寡养单胞菌X1菌液添加组+假单胞菌L1菌液添加组)的芘的去除率。由此可知，复合微生物菌剂具有协同去除芘的作用。
在三种不同的试验处理中，只有构建的复合微生物菌剂可以同时去除土壤中的Cr(VI)和芘，且效果明显。
本实施例的复合微生物菌剂也可用于去除土壤中的其他多环芳烃，例如萘、苊烯、芴、菲、蒽等，也具有较好的去除率。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
尽管已经结合了本发明的具体实施例对本发明进行了描述，但是根据前面的描述，这些实施例的很多替换、修改和变型对本领域普通技术人员来说将是显而易见的。本发明的实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种复合微生物菌剂，其特征在于，所述复合微生物菌剂包括嗜根寡养单胞菌X1和假单胞菌L1。
2.根据权利要求1所述的复合微生物菌剂，其特征在于，所述复合微生物菌剂由嗜根寡养单胞菌X1和假单胞菌L1菌体数以(0.5～2):1比例混合而成。
3.一种如权利要求1或2所述的复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将嗜根寡养单胞菌X1和假单胞菌L1分别进行纯培养，分别得到嗜根寡养单胞菌X1的种子液和假单胞菌L1的种子液；
(2)将嗜根寡养单胞菌X1的种子液和假单胞菌L1的种子液分别进行离心，分别收集嗜根寡养单胞菌X1菌体和假单胞菌L1菌体；
(3)将嗜根寡养单胞菌X1菌体和假单胞菌L1菌体分别用缓冲液重悬，将重悬后的菌液混合均匀，得到复合微生物菌剂。
4.根据权利要求3所述的复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，重悬后的菌液的OD600值为0.8～1.2。
5.根据权利要求3所述的复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，重悬后的嗜根寡养单胞菌X1菌液和重悬后的假单胞菌L1菌液按照体积比(0.5～2):1的比例混合均匀。
6.如权利要求1或2所述的复合微生物菌剂在铬和多环芳烃污染土壤修复中的应用。
7.根据权利要求6所述的复合微生物菌剂的应用，其特征在于，所述铬为六价铬，所述多环芳烃包括芘。
8.根据权利要求6所述的复合微生物菌剂的应用，其特征在于，将复合微生物菌剂以0.1～2％的接种量接种于铬和多环芳烃污染土壤中，在28～32℃、120～180rpm的条件下处理7d～20d。
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