CN112872002A - 硒联合铜绿假单胞菌在强化植物修复镉-壬基酚复合污染土壤中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了硒联合铜绿假单胞菌在强化植物修复镉‑壬基酚复合污染土壤中的应用，属于生态环保领域。在镉‑壬基酚复合污染土壤中种植黑麦草，并通过添加硒源与铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)强化植物修复效果。硒与铜绿假单胞菌联合黑麦草处理镉‑壬基酚复合污染土壤，硒、微生物与植物之间存在协同促进污染修复的效果，具有良好的生态效应，适用于镉‑壬基酚复合污染土壤的修复。本发明显著提高了黑麦草对镉‑壬基酚复合污染土壤的修复效率，是一种操作简单、成本低廉、修复效果良好的方法。

Description

硒联合铜绿假单胞菌在强化植物修复镉-壬基酚复合污染土 壤中的应用

技术领域

本发明涉及硒联合铜绿假单胞菌在强化植物修复镉-壬基酚复合污染土壤中的应用，属于生态环保领域，尤其是重金属-有机物复合污染土壤的绿色修复领域。

背景技术

壬基酚(NP)是工业生产中广泛使用的表面活性剂降解的中间产物之一，极易随地表径流扩散进入土壤环境，从而导致土壤壬基酚污染。工厂周边或长期废水灌溉的土壤壬基酚污染情况最严重。不合理地采矿、工农业生产等人类活动使土壤镉(Cd)污染日益严重，部分工业发达地区出现水体、污泥、土壤中镉与壬基酚污染严重的情况。环境镉与壬基酚污染导致农产品品质与产量降低，且可通过食物链或环境暴露威胁人体健康，已成为当前亟需解决的环境问题。

当前，土壤重金属与有机物污染修复的方法主要包括吸附剂、萃取剂、电化学、生物修复等，但上述多数方法因成本高、技术要求高和对环境扰动大等问题而难以推广。植物修复是一种成本低廉、环境友好、无二次污染、可持续性强的修复方法。单一的植物修复由于生物量、生长周期等因素的限制难以同时高效去除土壤中的镉与壬基酚，因此，如何在增加植物生物量的同时提高土壤中镉与壬基酚的去除率成为植物修复镉-壬基酚复合污染土壤的关键。

黑麦草对Cd、Cu、Pb等重金属元素具有较强的富集能力，且田间种植的黑麦草可通过刈割不断降低土壤中重金属的含量；同时，黑麦草对土壤多环芳烃(PAHs)等有机物污染也具有一定的修复能力，因此，适合作为镉-壬基酚复合污染土壤修复的植物。微生物是土壤-植物体系中代谢活动的主要参与者，其不仅可通过特定的酶途径降解有机物，还可转化重金属的赋存形态，或通过胞外络合、胞内积累等过程达到修复重金属污染的目的。此外，部分微生物在调节土壤养分循环及促进植物生长方面具有显著作用，即可提高部分植物对污染物的吸收积累量。除微生物外，硒也常被用于土壤污染修复。硒是植物的有益元素之一，可促进植物生长、增强植物抗逆能力，甚至可与重金属反应生成复合物(如Cd-Se复合物)。为进一步提高植物修复效率，可将微生物强化和微量元素强化与植物修复联合，提高植株生物量，同时促进植株吸收积累污染物和有机污染物降解。

发明内容

针对生产实践中的实际问题和需求，本发明旨在提供一种硒联合铜绿假单胞菌强化植物修复镉-壬基酚复合污染土壤的方法。通过种植黑麦草去除土壤中镉与壬基酚，实现对镉-壬基酚复合污染土壤的绿色生态修复。

本发明发现了单独接种铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、单独施用硒、铜绿假单胞菌与硒联合施用对镉-壬基酚复合污染土壤中黑麦草的生长均存在促进作用，同时可提高黑麦草对镉的吸收积累、去除土壤中的镉和壬基酚，且铜绿假单胞菌与硒联合施用的处理效果最佳。此外，本发明还发现在镉-壬基酚复合污染土壤中添加硒或同时施用铜绿假单胞菌与硒均可提高过氧化氢酶活性。综上，硒联合铜绿假单胞菌有助于强化植物对镉-壬基酚复合污染土壤的修复效果。

具体地，本发明提供如下技术方案：

硒联合铜绿假单胞菌在强化植物修复镉-壬基酚复合污染土壤中的应用。

硒联合铜绿假单胞菌在强化植物对镉-壬基酚复合污染土壤中镉与壬基酚的吸收中的应用。

硒联合铜绿假单胞菌在提高镉-壬基酚复合污染土壤过氧化氢酶活性中的应用。

一种修复镉-壬基酚复合污染土壤的方法，为在镉-壬基酚复合污染土壤中施用硒源与铜绿假单胞菌，并种植植物。

一种提高镉-壬基酚复合污染土壤过氧化氢酶活性的方法，为在土壤中施用硒源与铜绿假单胞菌。

优选的，所述的施加硒源与铜绿假单胞菌为施加硒溶液与铜绿假单胞菌菌液。

优选的，所述的植物为黑麦草。

一种修复镉-壬基酚复合污染土壤的组合物，包含硒源和铜绿假单胞菌。

一种去除镉-壬基酚复合污染土壤中的镉与壬基酚的组合物，包含硒源和铜绿假单胞菌。

一种促进黑麦草吸收镉-壬基酚复合污染土壤中的镉与壬基酚的组合物，包含硒源和铜绿假单胞菌。

一种提高镉-壬基酚复合污染土壤过氧化氢酶活性的组合物，包含硒源和铜绿假单胞菌。

上述硒源优选为硒酸钠。

本发明修复镉-壬基酚复合污染土壤的方法与现有研究相比有如下优点：

(1)硒联合铜绿假单胞菌强化植物对镉-壬基酚复合污染土壤的修复，可同时有效去除土壤中的镉与壬基酚，弥补了现阶段国内外关于重金属-有机物复合污染(尤其是镉-壬基酚复合污染)土壤绿色修复技术研究的不足；

(2)硒联合铜绿假单胞菌强化植物对镉-壬基酚复合污染土壤的修复，提高了植物对镉-壬基酚复合污染土壤的修复效率，微生物、微量元素与植物之间存在协同增强修复效果的现象；

(3)硒源与菌液的施用方法简单，且施加一次即可显著增加黑麦草生物量，提高土壤酶活性，提高植物对镉-壬基酚复合污染的抗耐能力，适用于镉-壬基酚复合污染土壤的原位修复。

附图说明

图1是黑麦草植株地下部镉含量结果图。

图2是黑麦草植株地上部镉含量结果图。

图3是镉-壬基酚复合污染土壤中镉含量结果图。

图4是镉-壬基酚复合污染土壤中壬基酚含量结果图。

图5是镉-壬基酚复合污染土壤中过氧化氢酶活性结果图。

图中a、b、c等不同字母表示不同处理的差异显著性。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1：硒联合铜绿假单胞菌强化植物修复镉-壬基酚复合污染土壤的应用

试验地点为华中农业大学微量元素中心盆栽场(30°28′26″N，114°02′15″E)，供试土壤为湖北省武汉市镉污染菜园土，其基础理化性质为:pH 5.99(土水比1:2.5)，有机质9.39g/kg，碱解氮41.07mg/kg，速效磷22.28mg/kg，速效钾160mg/kg，总镉含量1.48mg/kg，未检出壬基酚。土壤样品自然风干，磨细过筛后储存待用。

镉-壬基酚复合污染土壤：低浓度壬基酚(5mg/kg土壤)、高浓度壬基酚(50mg/kg土壤)分别与镉复合污染的土壤，即高、低复合污染土壤。分别取少量镉污染土壤，将5mg/mL壬基酚-乙醇储备液加入其中，搅拌均匀后静置48h，待乙醇挥发完全，将其混入其他无壬基酚的土壤，每盆土壤总重2.5kg，搅拌均匀，使得土壤中壬基酚浓度分别为5mg/kg与50mg/kg。

供试黑麦草为邦德四倍体。

供试菌种为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌株SH1，由苏州科技大学提供(史广宇等，2017，镉对铜绿假单胞菌降解水体中壬基酚的影响)。

营养液体培养基：5g葡萄糖，2g蛋白胨，1g酵母粉，溶于1000mL去离子水，调节pH7.2～7.5，高压灭菌。

固体培养基：5g NaCl，5g牛肉膏，10g蛋白胨，20g琼脂，溶于1000mL去离子水，调节pH 7.0～7.2，高压灭菌。

铜绿假单胞菌菌液制备：从固体培养基上挑取1环铜绿假单胞菌接种于100mL营养液体培养基中，30℃，150r·min^-1恒温震荡培养24h。采用无菌操作技术取菌液按1％体积比接种于新鲜营养培养液中，相同条件下恒温震荡培养24h。将菌悬液于6000r·min^-1离心10min，弃去上清液获取菌体，用磷酸缓冲液冲洗干净后，加入无菌水制备菌液，备用。

试验共设置八个处理，每处理四次重复，具体如表1所示。外源硒以硒酸钠形式施加，浓度为1.0mg/kg土壤。

表1.试验处理

盆栽试验以尿素、磷酸二氢钠、氯化钾(N：180mg/kg；P₂O₅：100mg/kg；K₂O：150mg/kg)等补足基肥，并按照处理施加50mL 0.12g/L Na₂SeO₄溶液，按10⁸菌株/g土接种铜绿假单胞菌菌液，两天后播种。挑选饱满的黑麦草种子于太阳下晒1h后，用10％NaClO浸泡30分钟，分别用自来水和去离子水冲洗三遍后，在去离子水中浸泡12h，每盆播种60粒种子，并在其表面覆盖一层薄土。在发芽后的7天内间苗，直至每盆30株黑麦草幼苗，黑麦草培养60天，期间用去离子水浇灌。黑麦草生长60天后，分地上、地下部分收获黑麦草植株样品。将部分新鲜土壤保存于-20℃冰箱中用于后续土壤酶活性测定，其他土壤混合均匀后用四分法取部分，风干过筛后用于污染物含量测定。黑麦草地上、地下部分分别用自来水与去离子水冲洗干净后称重，于105℃杀青30分钟，65℃烘干至恒重，粉碎过筛待测。

硒与铜绿假单胞菌联用对镉-壬基酚复合污染土壤中黑麦草生物量的影响见表2和表3。从表中数据可以看出：在低污染土壤或高污染土壤中单独接种铜绿假单胞菌、单独施用外源硒以及菌与硒联合施用均促进了黑麦草生长，提高了其生物量，且同时施用菌与硒的促进效果最佳。

表2.低浓度镉与壬基酚复合污染土壤黑麦草生物量

表3.高浓度镉与壬基酚复合污染土壤黑麦草生物量

表中a、b、c表示不同处理的差异显著性。

采用混酸(硝酸：高氯酸(v/v)＝9:1)消化-(石墨炉)原子吸收光谱仪测定黑麦草地下、地上部镉含量。硒与铜绿假单胞菌联用对镉-壬基酚复合污染土壤中黑麦草地下、地上部镉含量的影响见图1、图2。结果表明，三种修复措施均提高了植株地下部镉含量，单独施用外源硒或同时施用菌与硒可显著提高黑麦草地上部镉含量。在低污染条件下，同时施用菌与硒对植物修复镉的强化效果最佳。相对于未施用菌或硒的复合污染土壤中生长的黑麦草，硒与菌联合施用使得黑麦草地下、地上部镉含量分别提高了4.1％和49.1％。高污染条件下，单独接种铜绿假单胞菌后植株地下部镉含量与未施加菌或硒处理相比，其镉含量提高28.5％；而硒与菌联合施用对黑麦草地上部镉积累的促进作用最为显著，其镉含量比未施加菌或硒处理高出75.0％。

通过对比不同土壤样品中的镉含量，可直接反映各修复措施的效果强弱。土壤样品采用微波消解法进行消化，随后采用(石墨炉)原子吸收光谱仪测定土壤总镉含量，具体参考《HJ787-2016固体废物铅和镉的测定石墨炉原子吸收分光光度法》。外源硒与铜绿假单胞菌对复合污染土壤中镉含量的影响如图3所示。高、低污染条件下，培养60天后土壤镉含量分别为1.32mg/kg和1.26mg/kg，施加三种修复措施后，土壤镉含量均显著降低，且以同时施用菌与硒的效果最为显著，在高、低污染条件下，其土壤镉含量分别为0.87mg/kg和0.79mg/kg，相对于未施加菌或硒的土壤分别降低了34.1％和36.9％。表明硒与菌联合施用强化黑麦草修复镉-壬基酚复合污染土壤中镉的效果最显著。

土壤壬基酚含量是衡量修复效果最重要的指标之一，采用高效液相色谱法测定土壤壬基酚含量，2g土壤中添加一定量的无水硫酸钠，用5mL有机萃取剂(甲醇:甲苯(v/v)＝6:1)萃取壬基酚，超声处理40min，提取液收集到氮气吹管中。上述程序连续重复四次。最后将收集的溶剂用氮气冲洗至1mL，并用高效液相色谱法进行分析。使用高效液相色谱法，荧光(FLR)检测器，流动相为甲醇-水-乙腈(v/v/v＝70:20:10)，流速1mL/min，注射体积为20μL。FLR激发波长和发射波长分别为275nm和308nm。

如图4所示，未施加菌或硒的土壤在培养60天后，其土壤壬基酚含量依然较高，高、低污染水平土壤的壬基酚含量分别为44.27mg/kg和4.81mg/kg。三种修复措施都可使土壤中壬基酚的浓度降低，其中单独接种铜绿假单胞菌以及硒与菌联合施用效果显著，又以硒与菌联合施用处理效果最佳，使高、低污染水平土壤中壬基酚含量分别降至15.71mg/kg和1.02mg/kg，去除率高达78.8％和62.8％。表明铜绿假单胞菌是去除土壤中壬基酚的主要因素，而外源硒与菌联合施用时，二者存在协同效应，可进一步促进壬基酚的去除。

土壤中生物呼吸过程和生物化学氧化等反应过程产生过氧化氢，这些过氧化氢对植物和土壤生物具有毒害作用，而重金属与有机污染物的毒害作用加剧了过氧化氢的产生，严重威胁土壤-植物环境健康。与此同时，在生物体和土壤中存在过氧化氢酶，能促进过氧化氢分解，从而降低过氧化氢的毒害作用。故土壤过氧化氢酶活性可反映土壤体系的解毒能力。采用KMnO₄滴定法测定土壤过氧化氢酶活性，称取5g土样，置于150mL三角瓶中，注入40mL蒸馏水和5mL 0.3％过氧化氢溶液。置于120r/min摇床上震荡30min。随即注入5mL1.5mol/L H₂SO₄以终止反应，过滤。取滤液25mL，用0.002mol/L高锰酸钾溶液滴定至微红色，同时设置对照。以单位土重消耗的高锰酸钾体积反映过氧化氢酶活性。

测定结果(图5)表明，在低污染条件下，硒与菌联合施用显著提高了过氧化氢酶活性；在高污染条件下，单独施用硒以及硒与菌联合施用均可显著提高过氧化氢酶活性。硒与菌联合施用对土壤过氧化氢酶活性的影响最显著，使高、低污染水平土壤中过氧化氢酶活性分别提高了35.8％和38.1％。即硒与菌联合施用可提高黑麦草生长的镉-壬基酚复合污染土壤的解毒能力，有益于植物和土壤生物抗耐镉与壬基酚的毒害作用，强化植物修复效果。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，根据本发明的上述思路，本领域人员还可在未背离本发明的精神实质与原理的条件下对此进行一定程度的修改。例如，改变菌液制备方法、镉和壬基酚的浓度、黑麦草培养时间和方式等。而类似的修改均包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.硒联合铜绿假单胞菌在强化植物修复镉-壬基酚复合污染土壤中的应用，其特征在于：所述的植物为黑麦草。

2.硒联合铜绿假单胞菌在强化植物对镉-壬基酚复合污染土壤中镉与壬基酚的吸收中的应用，其特征在于：所述的植物为黑麦草。

3.硒联合铜绿假单胞菌在提高镉-壬基酚复合污染土壤过氧化氢酶活性中的应用。

4.一种修复镉-壬基酚复合污染土壤的方法，其特征在于：所述的方法为在镉-壬基酚复合污染土壤中施用硒源与铜绿假单胞菌，并种植黑麦草。

5.一种提高镉-壬基酚复合污染土壤过氧化氢酶活性的方法，其特征在于：所述的方法为在土壤中施加硒源与铜绿假单胞菌。

6.一种修复镉-壬基酚复合污染土壤的组合物，其特征在于：包含硒源和铜绿假单胞菌。

7.一种去除镉-壬基酚复合污染土壤中的镉与壬基酚的组合物，其特征在于：包含硒源和铜绿假单胞菌。

8.一种促进黑麦草吸收镉-壬基酚复合污染土壤中的镉与壬基酚的组合物，其特征在于：包含硒源和铜绿假单胞菌。

9.一种提高镉-壬基酚复合污染土壤过氧化氢酶活性的组合物，其特征在于：包含硒源和铜绿假单胞菌。

10.根据权利要求4或5所述的方法或权利要求6-9任一项所述的组合物，其特征在于：所述的硒源为硒酸钠。

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