CN102847705A

CN102847705A - 一种蚯蚓协同微生物降解土壤pcp残留的修复方法

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Publication number: CN102847705A
Application number: CN2012101730483A
Authority: CN
Inventors: 李永涛; 蔺中; 蔡燕飞; 李晓敏; 孙礼勇; 陈昊
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2012-05-30
Filing date: 2012-05-30
Publication date: 2013-01-02

Abstract

本发明公开了一种蚯蚓协同微生物降解土壤PCP残留的修复方法，属于土壤污染物修复技术领域。本发明的修复方法是将赤子爱胜蚓和/或壮伟环毛蚓投放到被污染土壤中，同时投放已经发酵的鸡粪和/或牛粪，并使鸡粪和/或牛粪与土壤充分混合均匀；每隔三个月再次投放已经发酵的鸡粪和/或牛粪。本发明的修复方法不仅能够加速土壤PCP的消除与解毒，还能通过蚯蚓的活动改良土壤各种理化性质，加速土壤有机质的分解，优化其它污染物脱毒的反应条件，生物催化土壤中含有的其它污染物的形态转化和降解反应。

Description

一种蚯蚓协同微生物降解土壤PCP残留的修复方法

技术领域

本发明涉及污染土壤修复技术领域，具体涉及一种蚯蚓协同微生物降解土壤PCP残留的修复方法。

背景技术

PCP（五氯酚，pentachlorophenol）被广泛地用作除草剂、杀菌剂和木材防腐剂，具有致畸、致癌、致突变的“三致”特点，已被美国国家环保局等机构列入环境优先控制污染物名单。尽管从 20 世纪 80 年代起，全球范围内已禁止生产和使用，但由于其化学性质稳定，不易降解，导致其在土壤、水体、食品和动物样品中仍被广泛检出。PCP污染问题已严重威胁农业产地环境和农产品质量安全，进而影响人体健康。

鉴于PCP对土壤污染的严重性和危害性，PCP污染土壤修复技术引起了全球普遍关注。目前，以人为接种外源微生物为主的微生物修复技术是一种公认的有效、安全、廉价和无二次污染的方法。但是，PCP污染土壤的微生物修复技术在实施中面临诸多限制因素。一是土壤环境中外源接种微生物适应性差，活性低，移动性小，对环境胁迫的抗性远低于土壤动物和植物。土壤复杂的水气热和酸碱条件严重抑制了功能微生物的活性。二是在土壤多相多界面的复杂体系中，具有疏水亲脂特性的氯代芳烃和酶蛋白易被有机团聚体等吸附和固定，降低溶解度、生物有效性和反应接触。近年来，一些研究致力于激发土著降解微生物的驱动因素研究，从而尝试解决上述限制因素。比如，人工添加营养物质或有机基质以提高微生物活性或共代谢底物；加入变价金属离子以补充电子供体或受体；使用表面活性剂以促进污染物解吸附；采用微生物或酶的固定化技术来提高稳定性和适应性。加入铜、锰等金属诱导剂以提高漆酶催化活性和基因转录能力等。但是，外源添加物成本高，可持续性差，易引起二次危害。因此，研究一种低成本、环境友好的生物驱动技术提高微生物的降解效率成为原位修复土壤有机氯污染的重要内容。

利用土壤动物（蚯蚓）修复被污染的土壤则能克服上述限制因素。蚯蚓广泛分布在世界各地，具有极强的环境适应能力和繁殖能力，对污染胁迫有较高的耐性、生物累积性和抗性。蚯蚓的作穴、搅动可改善土壤深层的缺氧条件，携带传播微生物，增加微生物与反应物间的表面接触和传播机会。蚯蚓消化粗有机物过程中分解产生大量的活性低分子量水溶性糖（酸）类物质，可以向PCP降解提供共代谢碳源。蚯蚓在新陈代谢过程中分泌的代谢产物如粘液，尿素等，能刺激微生物迅速生长。蚯蚓消化道内形成类似生物反应器的微域环境，还能促进土壤有机团聚体和铁锰氧化物的分解重构，提高污染物的解吸附和溶解性，增加表面接触机会。更重要的是，蚯蚓消化酶和同工酶系可能生物催化污染物的形态转化和降解反应。因此，蚯蚓被广泛用于废弃物的生物处理中。但蚯蚓在土壤持久性有机污染物，特别是有机氯PCP污染修复中的作用报道非常有限，需要进一步研究。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中还没有一种有效的降级土壤中PCP残留的问题，提供一种蚯蚓协同微生物降解土壤PCP残留的修复方法。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

一种蚯蚓协同微生物降解土壤PCP残留的修复方法，是将赤子爱胜蚓和/或壮伟环毛蚓投放到被污染土壤中，同时投放已经发酵的鸡粪和/或牛粪，并使鸡粪和/或牛粪与土壤充分混合均匀；每隔三个月再次投放已经发酵的鸡粪和/或牛粪。

运用Biolog和DGGE技术，研究蚯蚓对PCP污染土壤的微生物群落结构及多样性变化的影响，结果表明，将蚯蚓与有机肥混合加入到被污染的土壤后，蚯蚓可以联合土著微生物协同降解被污染土壤中的PCP，同时还能显著提高土著微生物对不同单一碳源利用能力（糖类、羧酸、氨基酸和胺类），提高常见种的优势度（Simpson指数）和均匀度（McIntosh指数）（P<0.05）。两种生态型蚯蚓均能够显著提高土壤微生物种群遗传多样性分布和差异（Shanon指数）（P<0.05）。结果表明，两种生态型蚯蚓均能够提高PCP污染土壤中的微生物代谢活性和群落结构多样性，内层种蚯蚓促进效果优于表层种蚯蚓。菌种降解效果实验表明， Klebsiella sp. T1对PCP的降解率达到64.44 %。

上述蚯蚓协同微生物降解土壤PCP残留的修复方法中，被污染土壤PCP残留量低于40mg/kg。

作为一种优选方案，上述蚯蚓协同微生物降解土壤PCP残留的修复方法中，被污染土壤中还加入微生物帮助降解土壤中的PCP，优选加入克雷伯氏菌属菌株，被污染土壤为旱地土时加入克雷伯氏菌属对于降解最有效，可以与蚯蚓协同加速降解PCP，比单独使用蚯蚓修复能够达到更好的效果。

上述蚯蚓协同微生物降解土壤PCP残留的修复方法，被污染土壤的含水量优选为60%。

上述蚯蚓协同微生物降解土壤PCP残留的修复方法，优选发酵的鸡粪和/或牛粪与被污染土壤的质量比为1:5。

上述蚯蚓协同微生物降解土壤PCP残留的修复方法，优选每kg被污染土壤中加入赤子爱胜蚓30条或壮伟环毛蚓15条。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

使用本发明的方法对PCP污染土壤进行修复简单有效，成本低廉，且对外界环境条件要求低，适宜目前多数被PCP污染的土壤大规模应用。通过蚯蚓在污染土壤中的自然生长、发育、繁殖，持续对被污染的土壤进行修复。该方法不仅能够加速土壤PCP的消除与解毒，还能通过蚯蚓的活动改良土壤各种理化性质，加速土壤有机质的分解，优化其它污染物脱毒的反应条件，生物催化土壤中含有的其它污染物的形态转化和降解反应。如：有机污染物DDT和重金属Cu、Pb 、Zn等。

附图说明

图1为赤子爱胜蚓和壮伟环毛蚓对土壤PCP耐受能力测试结果，其中（a）为赤子爱胜蚓，（b）为壮伟环毛蚓，五氯酚浓度0 mg∙kg^-1（A）、20 mg∙kg^-1（B）、40 mg∙kg^-1（C）、60 mg∙kg^-1（D）、80 mg∙kg^-1（E）、100 mg∙kg^-1（F）、150 mg∙kg^-1（G）、200 mg∙kg^-1（H），n=3。

图2为赤子爱胜蚓和壮伟环毛蚓饲养密度效果测试结果图，其中（a）：赤子爱胜蚓，（b）：壮伟环毛蚓，蚯蚓条数：5条（A）；10条（B）；15条（C）；20条（D）；25条（E）；30条（F）；35条（G）；40条（H）；45条（I）；50条（J）；n=3。

图3为有机基料和土壤比效果测试结果，其中（a）：赤子爱胜蚓，（b）：壮伟环毛蚓。有机基料比2%（A）；5%（B）；10%（C）；15%（D）；20%（E）；30%（F）；40%（G）；60%（H）；80%（I）；100%（J），n=3。

图4为各阶段不同蚯蚓处理中乙醇提取态PCP浓度，CK2-自然土壤，T11-自然土壤+自然堆肥，T12-自然土壤+自然堆肥+壮尾环毛蚓，T13-自然土壤+自然堆肥+赤子爱胜蚓；不同小写字母表示同一时间不同处理土壤乙醇提取态PCP差异显著（Duncan法，P =0.05）。

图5为培养42天时不同蚯蚓处理下土壤水提态PCP浓度，CK2-自然土壤，T11-自然土壤+自然堆肥，T12-自然土壤+自然堆肥+壮尾环毛蚓，T13-自然土壤+自然堆肥+赤子爱胜蚓；不同小写字母表示同一时间不同处理土壤水提态PCP差异显著（Duncan法，P =0.05）。

图6为培养42天时不同蚯蚓处理下土壤腐殖质固定态PCP浓度，CK2-自然土壤，T11-自然土壤+自然堆肥，T12-自然土壤+自然堆肥+壮尾环毛蚓，T13-自然土壤+自然堆肥+赤子爱胜蚓。不同小写字母表示同一时间不同处理土壤腐殖质固定态PCP差异显著（Duncan法，P =0.05）。

图7培养42天时两种生态型蚯蚓累积态PCP浓度和累积率，A-壮尾环毛蚓，E-赤子爱胜蚓。不同小写字母表示两种生态型蚯蚓累积态PCP浓度/累积率差异显著（Duncan法，P =0.05）。

图8为培养42天时不同蚯蚓处理下土壤中各形态PCP占初始量的质量百分比，CK2-自然土壤，T11-自然土壤+自然堆肥，T12-自然土壤+自然堆肥+壮尾环毛蚓，T13-自然土壤+自然堆肥+赤子爱胜蚓。

图9为各阶段不同蚯蚓处理下土壤微生物呼吸，CK2-自然土壤，T11-自然土壤+自然堆肥，T12-自然土壤+自然堆肥+壮尾环毛蚓，T13-自然土壤+自然堆肥+赤子爱胜蚓。不同小写字母表示同一时间不同处理土壤微生物呼吸值差异显著（Duncan法，P =0.05）。

图10为培养42天时不同蚯蚓处理下土壤微生物碳含量，CK2-自然土壤，T11-自然土壤+自然堆肥，T12-自然土壤+自然堆肥+壮尾环毛蚓，T13自然土壤+自然堆肥+赤子爱胜蚓。不同小写字母表示同一时间不同处理土壤微生物碳

差异显著（Duncan法，P =0.05）。

图11为培养42天时不同蚯蚓处理下土壤微生物氮含量，CK2-自然土壤，T11-自然土壤+自然堆肥，T12-自然土壤+自然堆肥+壮尾环毛蚓，T13-自然土壤+自然堆肥+赤子爱胜蚓。不同小写字母表示同一时间不同处理土壤微生物氮差异显著（Duncan法，P =0.05）。

图12为培养42天时不同蚯蚓处理下土壤pH值，CK2-自然土壤，T11-自然土壤+自然堆肥，T12-自然土壤+自然堆肥+壮尾环毛蚓，T13-自然土壤+自然堆肥+赤子爱胜蚓。不同小写字母表示同一时间不同处理土壤pH差异显著（Duncan法，P =0.05）。

图13为培养42天时土壤PCP降解菌种筛选，CK1-自然土壤，T12-自然土壤+自然堆肥+蚯蚓。

图14克雷伯氏菌属降解PCP能力鉴定结果，其中B为对照，T1为克雷伯氏菌属。

具体实施方式

实施例 1

1. 壮伟环毛蚓和赤子爱胜蚓对土壤PCP耐受能力测试

试验设计赤子爱胜蚓条数为15条，壮伟环毛蚓条数为7条分别进行实验。用不含PCP的土壤分别加入不同量的PCP，配制成PCP浓度分别为0 mg∙kg^-1（A）、20 mg∙kg^-1（B）、40 mg∙kg^-1（C）、60 mg∙kg^-1（D）、80 mg∙kg^-1（E）、100 mg∙kg^-1（F）、150 mg∙kg^-1（G）和200 mg∙kg^-1（H）的实验土壤，重复三次，共24个处理。实验土壤重量为0.5 kg。每个实验土壤水分始终维持在饱和含水量的60%。将实验土壤放入桶中，再放入蚯蚓，桶口用锡纸包住，并用别针扎多个小孔保持桶内空气流通。遮光的条件下培养。试验设计测定8 h、12 h、1 d、2 d、4 d、6 d、9 d、13 d、17 d、21 d、26 d等培养时间下，两种生态型蚯蚓的生物量，确定壮伟环毛蚓和赤子爱胜蚓对土壤PCP污染的耐受能力。

结果见图1，0-13 d，两种生态型蚯蚓（赤子爱胜蚓和壮伟环毛蚓）在A、B、C、D四个处理中生长较好，没有死亡现象。在E、F、G、H成活率较低，出现蚯蚓大量死亡现象，死亡率赤子爱胜蚓在26.67-100 %，壮伟环毛蚓在14.29 -100 %。13-26 d，两种生态型蚯蚓（赤子爱胜蚓和壮伟环毛蚓）在A、B、C的处理中生长较好，死亡率赤子爱胜蚓在0-6.67 %，壮伟环毛蚓在0-14.29%，D处理中蚯蚓开始少数死亡，E、F、G、H处理中蚯蚓大量死亡，且壮伟环毛蚓死亡率高于赤子爱胜蚓（赤子爱胜蚓在33.33-100%，壮伟环毛蚓在42.86 -100 %）。因此综合考虑土壤中PCP的污染国际标准、现有的相关研究及蚯蚓对土壤PCP的耐受程度，本实验土壤中PCP的添加浓度设为40 mg∙kg^-1。

2. 壮伟环毛蚓和赤子爱胜蚓饲养密度效果测试

供试土壤采自华南农业大学绿榕圆（23°09.190N、113°21.244E）附近的表层土（0-20cm），土壤类型为花岗岩母质上的赤红壤，土样在室温条件下充分风干后混匀粉碎，过2mm筛。蚯蚓品种选用赤子爱胜蚓(表层种)与壮伟环毛蚓(内层种)分别进行实验。实验设计两个品种蚯蚓各加入5条(A)、10条(B)、15条(C)、20条(D)、25条(E)、30条(F)、35条(G)、40条(H)、45条(I)、50条(L)共20个处理。每个处理土样重1kg，各加入已发酵牛粪500g，牛粪碾磨后与土壤充分混匀，含水量保持在60 %左右，每个处理设三个重复。试验设计测定30d、60d、90d三个阶段不同蚯蚓密度饲养的效果。

结果（图2）表明： 30d、60d、90 d三个阶段，赤子爱胜蚓条数在A、B、C、D、E、F处理中生长繁育较好，死亡率小于6.67 %，且上述处理均观测到新生蚯蚓，超过30条处理（G、H、I、J）蚯蚓由于密度过大，开始呈现死亡趋势，且死亡率随着蚯蚓密度增大而增大，死亡率在27.5-72.00 %。壮伟环毛蚓在A、B、C处理生长较好，死亡率小于13.33 %，超过15条处理中（D、E、F、 G、H、I、J）蚯蚓死亡率较高，在26.67-84.00 %。蚯蚓的密度直接关系到蚯蚓的生长、繁殖以及对有机物的处理效率。密度太大容易造成拥挤，影响蚯蚓的生长繁殖；密度太小又使得蚯蚓生物量低，从而降低了其对有机污染物的处理效率。因此，综合考虑蚯蚓成活率与蚯蚓生物量对污染物降解效果，每1 kg土壤中加30条赤子爱胜蚓或15条壮伟环毛蚓，既能保证蚯蚓正常的生长繁育，又能保证蚯蚓有足够的生物量，最大程度上加强其对有机污染物的生物强化效果效率。

3. 不同有机基料和土壤比效果测试

供试土壤采自华南农业大学绿榕圆（23°09.190N、113°21.244E）附近的表层土（0-20cm），土壤类型为花岗岩母质上的赤红壤，土样在室温条件下充分风干后混匀粉碎，过2mm筛。蚯蚓品种选用赤子爱胜蚓(表层种)与壮伟环毛蚓(内层种)分别进行实验。实验设计两种蚯蚓各加入有机基料比5%(A)、10%(B)、15%(C)、20%(D)、25%(E)、30%(F)、40%(G)、60%(H)、80%(I)、100%(L)共20个处理。每个处理土样重1kg，实验用蚓为赤子爱胜蚓的处理各加入30条，壮伟环毛蚓的处理各加入15条, 有机基料为已发酵牛粪，牛粪碾磨后与土壤充分混匀，含水量保持在60 %左右，每个处理设三个重复。试验设计测定30d、60d、90d三个阶段不同有机基料比的蚯蚓饲养效果, 测定结果见图3。

结果表明：第一阶段（0-30 d），两种生态型蚯蚓在不同有机质添加比例处理中均生长较好，蚯蚓平均重量增加在3.32-14.21 %之间。第二阶段（30-60 d）两种生态型蚯蚓在有机基料比在5%-100%处理（B、C、D、E、F、 G、H、I、J）中蚯蚓生长繁育较好，蚯蚓平均重量增加在5.42- 18.94 %之间，有机基料比为2 %的处理（A）中壮伟环毛蚓平均重量出现滞张或下降，蚯蚓平均重量减少在1.51-3.97 %之间，赤子爱胜蚓情况相对较好。第三阶段（60-90 d），处理A、B、C中，两种生态型蚯蚓开始呈现总体质量下降、活性不高的趋势，且蚯蚓质量随土壤中有机基料比的降低而降低，呈正相关关系。因此，综合考虑蚯蚓生物量与投资成本问题，土壤中有机基料比为20%时既能保证蚯蚓正常的生长繁育，保证有机污染物的降解效率，又能最大程度上节约有机基料的投资成本。

4. 蚯蚓强化降解土壤PCP效果研究

实验共计4个处理（CK2、T11、T12和T13），各重复三次。CK2：自然土壤；T11：自然土壤+自然堆肥；T12：自然土壤+自然堆肥+壮伟环毛蚓；T13：自然土壤+自然堆肥+赤子爱胜蚓。

每个处理土样重1 kg，五氯酚浓度为40 mg∙kg^-1，自然土壤+自然堆肥中的堆肥含量为4.5 %，壮伟环毛蚓15条，赤子爱胜蚓为30条。添加堆肥过程：称取0.45 kg堆肥和3 kg土壤于不锈钢盆中，充分搅拌混匀后加入剩余土壤，边加边搅拌，直至均匀为止，使堆肥含量为4.5%。染毒过程：称取0.48g五氯酚溶解于500 mL丙酮后，均匀喷洒至3 kg混入堆肥土壤中，加入9 kg混入堆肥的土壤，充分搅拌混匀后，放置24 h，使丙酮完全挥发。调节土壤湿度至最大持水量的60 %，并分装于各花盆中，上覆稻草，黑暗条件下平衡12 h后接种蚯蚓。挑选成熟活泼的壮伟环毛蚓（0.56 ± 0.17 g）和赤子爱胜蚓（0.24 ± 0.13 g）于培养箱中放置24 h，使其排出体内粪便，用无菌水洗三次后，接种于染毒土壤，放入温度为25 ℃的恒温生化培养箱中培养。

分别于0、7、14、28、42 d测定：乙醇提取态PCP浓度和土壤微生物呼吸强度。试验结束时（42 d）测定：pH值、微生物碳、微生物氮、水提取态PCP浓度、腐殖质固定态PCP浓度、蚯蚓累积态PCP浓度、土壤PCP降解菌种筛选和降解能力鉴定。

结果表明：

（1）蚯蚓和自然堆肥强化PCP降解效果：通过42 d的培养，添加蚯蚓和自然堆肥处理中土壤PCP降解率显著高于对照（P<0.05）。对照中乙醇提取态PCP浓度为28.66 mg∙kg^-1，降解率为25.00%，自然堆肥处理中乙醇提取态PCP浓度为11.93 mg∙kg^-1，降解率为67.11 %，内层种蚯蚓处理中乙醇提取态PCP浓度为5.60 mg∙kg^-1，降解率为84.17 %，表层种蚯蚓处理中乙醇提取态PCP浓度为10.06 mg∙kg^-1，降解率为72.80%（图4）。添加两种生态型蚯蚓和自然堆肥对土壤水提态PCP无显著影响（图5）。添加自然堆肥对土壤腐殖质固定态PCP无显著影响，但添加两种生态型蚯蚓均能降低土壤腐殖质固定态PCP含量。结果表明：添加两种生态型蚯蚓和自然堆肥均能够显著提高土壤PCP的降解，内层种蚯蚓强化效果优于表层种蚯蚓。

（2）蚯蚓处理下土壤微生物量：添加两种生态型蚯蚓处理中，特别是添加内层种蚯蚓处理，土著微生物的数量和活性（微生物呼吸、微生物碳和氮）显著高于对照（P < 0.05）。

（3）自然土壤中，添加自然堆肥可以显著提高土壤总有机碳含量，对水溶性有机碳含量无显著影响。添加堆肥的自然土壤中，加入两种生态型蚯蚓对土壤总有机碳含量无显著影响，但添加表层种蚯蚓可显著提高土壤水溶性有机碳含量。添加堆肥和两种生态型蚯蚓对土壤腐殖质含量无显著影响。添加两种生态型蚯蚓和自然堆肥均能显著提高土壤pH值，使其趋于中性。

（4）蚯蚓处理360d后土壤PCP的归宿：对照中消解态PCP占总量百分比为25.00%，仍有65.46%的结合态PCP残留于土壤。添加内层种和表层种蚯蚓处理中土壤PCP主要以消解态存在，消解态PCP占总量百分比分别为84.17 %和72.80%，结合态PCP仅占9.50%和16.21%，更进一步表明添加蚯蚓对土壤PCP的降解起到强化作用。蚯蚓体内累积态PCP占土壤PCP总量的百分比最低，分别为0.33%和0.20%，内层种蚯蚓累积态PCP含量高于表层种蚯蚓。

5. 土壤PCP降解菌种筛选及降解能力测试

土壤PCP降解菌种筛选：取对照和添加内层种蚯蚓处理土壤各10 g放入90 mL无菌水并装有玻璃珠的三角瓶中，振荡20 min，使样品与水充分混合，将细胞分散，形成均匀的菌悬液。用已经灭过菌的5 mL移液管吸取上清液10 mL加到100 mL富集液体培养基中，在30℃，150 r∙min^-1的摇床上振荡培养48 h。取上述富集培养液l0 mL加入到装有90 mL筛选培养液的三角瓶内，在温度为30℃，转速为150 r∙min^-1的条件下振荡培养48 h，在取振荡培养后的培养液l0 mL转接至装有90 mL新鲜的筛选培养液的三角瓶内，与上述相同的条件，继续振荡培养48 h。每个循环都有不加菌液的空白对照。取富集培养液1 mL依次制成10^-1，10^-2，10^-3，10^-4， 10^-5，10^-6稀释度的稀释液，通过预备实验确定水稻土分别取10^-4， 10^-5，10^-6各l mL，旱地土分别取10^-4，10^-5各l mL接到固体分离培养基平板上，涂布均匀后倒放置于30℃的恒温培养箱中培养3-7 d。然后对添加了溴百里酚蓝指示剂的固体分离培养基平板上生长的菌落进行筛选，根据若能降解PCP则将会有氯产生进而导致培养基颜色由蓝变黄的原则，参照菌落较大说明生长较好的原则，并根据菌落的形状、表面光泽、隆起程度、透明程度、扁圆形状、菌落颜色的差别，用接种环取下不同的黄色的较大菌落，采用平板划线法转接到固体培养基平板上，倒置于30℃的恒温培养箱中培养2-4d。重复此操作2-3次以得到单菌落，测序鉴定。

各培养基配方如下：

富集液体培养基：牛肉膏 5g∙L^-1，蛋白胨 10 g∙L^-1，NaCl 5 g∙L^-1，PCP 40m g∙L^-1，余量为蒸馏水，pH 7.4。

筛选培养液：K₂HPO₄ 1.73 g∙L^-1；KH₂PO₄ 0.68 g∙L^-1；NH₄NO₃ 1.0 g∙L^-1；MgSO₄∙7H₂O 0.1 g∙L^-1；CaCl₂∙2H₂O 0.02 g∙L^-1；MnSO₄∙H₂O 0.03 g∙L^-1；FeSO₄0.03 g∙L^-1；PCP 0.1 g∙L^-1；余量为蒸馏水，pH 7.4。

经过驯化培养的培养液：

固体分离培养基：K₂HPO₄ 1.73 g∙L^-1；KH₂PO₄ 0.68 g∙L^-1；NH₄NO₃ 1.0 g∙L^-1；MgSO₄∙7H₂O 0.1 g∙L^-1；CaCl₂∙2H₂O 0.02 g∙L^-1；MnSO₄∙H₂O 0.03 g∙L^-1；FeSO₄0.03 g∙L^-1；PCP 0.1 g∙L^-1；琼脂粉18 g∙L^-1；溴百里酚蓝0.02 g∙L^-1；余量为蒸馏水，pH 7.4。

结果表明：培养从添加蚯蚓处理和对照土壤中均筛选出1株PCP降解优势菌（Klebsiella sp. T1），菌落成球面性、乳白色、不透明，菌株为粗短杆状，革兰氏染色结果为阳性。降解优势菌只是较未添加蚯蚓的对照中生长数量明显增多，未发现新的可培养降解菌种。

因此断定，蚯蚓通过提高土著功能微生物数量与活性，提高污染物的解吸附和溶解性，增加表面接触机会，生物催化污染物的形态转化和降解，是一种有效的生态可持续修复自然土壤PCP的方法。

实施例 2 微生物菌株降解 PCP 能力鉴定

将克雷伯氏菌分别接种到富集液体培养基中富集生长（150 r∙min^-1好氧摇床培养，30℃）24 h，每个菌种设置重复三次。取菌株培养溶液10mL以6000 r∙min^-1超速离心10 min，上清液去掉，再用已灭菌的去离子水冲洗，然后再离心，如此重复三次；最后用已灭菌的去离子水重新悬浮已清净的菌体。菌悬液的浓度以λ = 600 nm时的吸光值来衡量。最后分别取10 mL菌液添加到90 mL无机盐培养液中，添加PCP浓度为100 mg∙ L^-1，于0、24、48、96、144 h测定不同处理中的PCP浓度；以不添加菌液的含PCP无机盐培养液为对照。

结果表明：T1菌悬液浓度在λ= 600 nm时的吸光值为0.31，各处理中PCP浓度一直呈下降趋势，添加克雷伯氏菌属处理中PCP浓度显著低于未添加菌液的对照，筛选的克雷伯氏菌属能够显著降解PCP，见图14。

Claims

1.一种蚯蚓协同微生物降解土壤PCP残留的修复方法，其特征在于将赤子爱胜蚓和/或壮伟环毛蚓投放到被污染土壤中，同时投放已经发酵的鸡粪和/或牛粪，并使鸡粪和/或牛粪与土壤充分混合均匀；每隔三个月再次投放已经发酵的鸡粪和/或牛粪。

2.根据权利要求1所述蚯蚓协同微生物降解土壤PCP残留的修复方法，其特征在于土壤PCP残留量低于40mg/kg。

3.根据权利要求1所述蚯蚓协同微生物降解土壤PCP残留的修复方法，其特征在于被污染土壤中还加入微生物菌株。

4.根据权利要求3所述蚯蚓协同微生物降解土壤PCP残留的修复方法，其特征在于所述加入的微生物菌株为克雷伯氏菌属。

5.根据权利要求4所述蚯蚓协同微生物降解土壤PCP残留的修复方法，其特征在于被污染土壤为旱地土。

6.根据权利要求3所述蚯蚓协同微生物降解土壤PCP残留的修复方法，其特征在于被污染土壤的含水量为60%。

7.根据权利要求3所述蚯蚓协同微生物降解土壤PCP残留的修复方法，其特征在于发酵的鸡粪和/或牛粪与被污染土壤的质量比为1:5。

8.根据权利要求3所述蚯蚓协同微生物降解土壤PCP残留的修复方法，其特征在于每kg被污染土壤中加入赤子爱胜蚓30条或壮伟环毛蚓15条。