CN117106659A - 球形赖氨酸芽孢杆菌、包含其的组合物、制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种球形赖氨酸芽孢杆菌、包含其的组合物、制备与应用，所述球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)MnO‑1属于氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2023年4月27日，保藏编号为CGMCCNo.27228。相比于现有技术，筛选得到的该菌对卡马西平降解效率更高，锰氧化能力强；且对十溴联苯醚、Cr(VI)均有较好的处理效果，能够耐受多种不利环境；其组合物制备方法简单、绿色无污染；该组合物可高效处理卡马西平、十溴联苯醚、Cr(VI)、Mn(Ⅱ)，有利于大规模应用。

Description

球形赖氨酸芽孢杆菌、包含其的组合物、制备与应用

技术领域

本发明涉及环境微生物技术领域，尤其涉及一种形赖氨酸芽孢杆菌、包含其的组合物、制备与应用。

背景技术

随着经济发展和技术开发，水体、土壤等生态环境破坏日益严重，同时伴随着严重的环境污染。近年来，废水中频繁检测出多种有机药物，因其含量高、性质稳定而长期停留在环境中引起广泛关注。研究总结世界各国有机药物污染发现，地表水中常检出卡马西平、三氯生、消炎药和磺胺甲恶唑等有机药物。饮用水中卡马西平浓度较高，达到600ng/L，其他药物仅为卡马西平的1/10，甚至更低。在污水厂中，卡马西平的进水浓度可达20μg/L，高于13.8μg/L的无影响浓度。由于城市污水处理厂并不配备处理复杂有机药物的设备，从而导致大量有机药物从污水厂排放至自然水体中。据不完全统计，全球年平均卡马西平消耗量为1014t，且分布广泛，在工业废水、农业废水中都曾检测到。

由于拆解电子垃圾形成的拆解聚集地，其土壤环境中溴代阻燃剂——重金属复合污染态势日趋严重。多溴联苯醚(PBDES)作为广泛使用的溴系阻燃剂，因其难降解、半衰期长等特点而长期停留在自然环境中，造成生态污染。常见商品多溴联苯醚阻燃剂有五溴联苯醚、八溴联苯醚、十溴联苯醚三种，其中十溴联苯醚在全球范围内使用量最大，在电子垃圾拆解地附近土壤中总PBDES含量中占比最高。据统计，我国每年使用约2000～4000万公斤商用十溴联苯醚。十溴联苯醚分布广泛，土壤中主要存在深度2～15cm，2018年其含量达到670μg/kg。沉积物中，十溴联苯醚占PBDES总浓度的36％～93.7％，明显高于其他PBDES同系物1～2个数量级。电子废物拆解地附近除有机污染之外，重金属污染也不容忽视。

卡马西平对环境的危害已被证实，即影响微生物和水生生物的正常生长，且由于其难降解性，随着时间推移，环境中浓度提高，未来可能会对生态环境和人类健康造成更大威胁。十溴联苯醚通过多种方式进入人体，生物积累性较强，具有内分泌干扰效应、神经毒性、肝脏毒性、生殖毒性、致癌性和基因毒性等。Cr通常以Cr(VI)、Cr(III)形态存在，Cr(VI)毒性远远高于Cr(III)，且流动性极强。十溴联苯醚与共存重金属离子相互影响后，对环境以及生物体毒理作用具有协同或累加作用。环境中有机物不易通过浓度水平产生急性毒性作用，但长期暴露于有机物污染环境中，影响生物代谢活动，产生的持久性伤害不可逆转。

目前有多种有机物去除方法被提出，主要分为生物法、物理法、化学法和多种方法联合处理等。其中，生物法普遍存在去除效率低，处理周期长等缺点；物理法也存在成本较高和二次污染等问题，化学处理对有机物降解效果较好，但可能会产生有毒副产物、而且运行成本较为高昂。

然而迄今为止，单一微生物作用对多种有机物的降解效果研究较少。因此筛选一株既能降解卡马西平又能高效降解十溴联苯醚，同时还能去除重金属Cr的锰氧化菌进行研究刻不容缓，能够弥补有机污染物及重金属污染微生物处理研究领域的不足。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种球形赖氨酸芽孢杆菌、组合物及其制备、与应用，旨在解决现有技术单一微生物作用无法对多种有机物进行降解，且不能去除重金属等问题。

为实现上述目的，本发明提供了一种球形赖氨酸芽孢杆菌，所述球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)MnO-1属于氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2023年4月27日，保藏编号为CGMCC No.27228。

本发明还提供了一种如上所述的球形赖氨酸芽孢杆菌对锰的氧化的应用。

本发明还提供了一种锰氧化物/球形赖氨酸芽孢杆菌组合物，包括无定型态锰氧化物和如上所述的球形赖氨酸芽孢杆菌；其中，所述无定型态锰氧化物以团聚的颗粒状与所述球形赖氨酸芽孢杆菌杂糅在一起。

本发明还提供了一种如上所述的组合物的制备方法，包括：每100mL锰氧化菌离子培养基以1～2％的接种量接种如上所述的球形赖氨酸芽孢杆菌，于25～35℃下振荡培养5～10d，得所述锰氧化物/球形赖氨酸芽孢杆菌组合物。

其中，所述锰氧化菌离子培养基中包括0.1～4mmol/L Mn²⁺。

进一步地，所述锰氧化菌离子培养基具体包括1g/L酵母提取物，1g/L酸水解酪蛋白，1g/L葡萄糖，0.222g/L CaCl₂，0.396g/L MgSO₄，0.0006g/L FeCl₃，1mL/L微量元素溶液以及0.1～4mmol/L MnSO₄·H₂O。

进一步地，所述微量元素溶液包括10mg/L CuSO₄·5H₂O、44mg/LZnSO₄·7H₂O、20mg/L CoCl₂·6H₂O、13mg/L Na₂MoO₄·2H₂O。

本发明还提供了一种如上所述的球形赖氨酸芽孢杆菌或如上所述的组合物在处理有机物废水中的应用；所述有机物废水中包括卡马西平、十溴联苯醚中的一种或两种。

本发明还提供了一种如上所述的球形赖氨酸芽孢杆菌如上所述的组合物在处理重金属废水中的应用；所述重金属废水中包括Cr(VI)、Mn(Ⅱ)中的一种或两种。

本发明达到的有益效果：

本发明筛选得到的球形赖氨酸芽孢杆菌对有机物卡马西平降解效率比普遍单一微生物降解效率高，对环境适应性较高，锰氧化能力强，具有较高的研究价值。且其对较高浓度的十溴联苯醚降解效率达到50％以上。还对Cr(VI)去除能力较强，能够耐受多种不利环境。

本发明所提供的锰氧化物/球形赖氨酸芽孢杆菌组合物制备方法具有成本低、操作简单、绿色无污染等优点。

本发明所提供的锰氧化物/球形赖氨酸芽孢杆菌组合物在降解卡马西平、十溴联苯醚，以及去除Cr(VI)、Mn(Ⅱ)的应用上，具有高效降解、去除效果，有利于在降解有机物、去除重金属领域大规模应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。

图1为本发明实施例2中制得的锰氧化菌的锰氧化物/球形赖氨酸芽孢杆菌组合物的SEM图；

图2为本发明实施例2中制得的锰氧化菌的锰氧化物/球形赖氨酸芽孢杆菌组合物的TEM图；其中，(a)为TEM图(比例尺，200nm)，(b)为TEM图(比例尺，500nm)；

图3为本发明实施例1中分离出来的球形赖氨酸芽孢杆菌的系统发育分析树；

图4为本发明实施例2中制得的锰氧化菌的锰氧化物/球形赖氨酸芽孢杆菌组合物的XRD图；

图5为本发明实施例2中制得的锰氧化菌的锰氧化物/球形赖氨酸芽孢杆菌组合物的HRTEM图；

图6为本发明实施例2中制得的锰氧化菌的锰氧化物/球形赖氨酸芽孢杆菌组合物的XPS图；

图7为本发明实施例3中球形赖氨酸芽孢杆菌的锰氧化能力图；

图8为本发明实施例3中球形赖氨酸芽孢杆菌的生长曲线图；

图9为本发明实施例3中球形赖氨酸芽孢杆菌的生长pH变化图；

图10为本发明实施例4中卡马西平降解率对比图；

图11为本发明实施例5中十溴联苯醚降解率对比图；

图12为本发明实施例6中Cr(VI)的去除效率对比图。

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施方式，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明的一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

需要说明，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。本领域技术人员应当知道的是，作为对本申请文件的一种说明，在不影响对本申请技术方案实际理解的情况下，“TEM”可以表示为透射电子显微镜，“XRD”可以表示为X射线衍射仪，“HRTEM”可以表示为高分辨透射电子显微镜，“XPS”可以表示为X射线光电子能谱仪，“2θ/degree”可以表示为衍射角，“Intensity(a.u.)”可以表示为强度，“Binding energy(ev)”可以表示为结合能，“satellite”可以表示为卫星峰。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。下列实施例中所需要的材料或试剂，如无特殊说明均为市场购得。

为了使解决现有技术单一微生物作用无法对多种有机物进行降解，且不能去除重金属等问题，本发明提供了一种球形赖氨酸芽孢杆菌，球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)MnO-1属于氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2023年4月27日，保藏编号为CGMCC No.27228。

具体地，可以取矿场土壤样本静置后的上清夜，加入到含MnSO₄·H₂O的LB液体培养基中。在LB液体培养基中恒温振荡培养一周后，接种到含MnSO₄·H₂O的固体培养基中，通过培养基上生长的菌落进行检验初筛。将生长良好的菌落接种于含MnSO₄·H₂O的LB液体培养基中，恒温培养后，在开始时和培养7d后取样，用电感耦合等离子体发射光谱(ICP-OES)测定Mn²⁺去除率。将去除率高的菌株培养液进一步通过LBB指示剂进行检验复筛，将对LBB指示剂显蓝色的进行分离和纯化。之后将能变色的菌株培养液继续稀释涂布到含MnSO₄·H₂O的固体培养基中，恒温培养后，将得到的菌株与50％甘油按1：1混匀后在-80℃下保藏。

最终，本发明通过筛选得到的球形赖氨酸芽孢杆菌于2023年4月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，编号为CGMCCNo.27228。

该筛选得到的球形赖氨酸芽孢杆菌对有机物卡马西平降解效率比普遍单一微生物降解效率高，对环境适应性较高，锰氧化能力强，具有较高的研究价值。且其对较高浓度的十溴联苯醚降解效率达到50％以上。还对Cr(VI)去除能力较强，能够耐受多种不利环境。

本发明还提供了一种如上的球形赖氨酸芽孢杆菌对锰的氧化的应用。

本发明还提供了一种锰氧化物/球形赖氨酸芽孢杆菌组合物，包括无定型态锰氧化物和如上的球形赖氨酸芽孢杆菌；其中，无定型态锰氧化物以团聚的颗粒状与球形赖氨酸芽孢杆菌杂糅在一起。

本发明还提供了一种如上的组合物的制备方法，包括：每100mL锰氧化菌离子培养基以1～2％的接种量接种如上的球形赖氨酸芽孢杆菌，于25～35℃下振荡培养5～10d，得锰氧化物/球形赖氨酸芽孢杆菌组合物。

其中，锰氧化菌离子培养基中包括0.1～4mmol/L Mn²⁺。当锰氧化菌离子培养基中Mn²⁺浓度为0.1～4mmol/L时可以生成较多的锰氧化物矿物；制备过程中发现当Mn²⁺>4mmol/L时会抑制球形赖氨酸芽孢杆菌的生长，阻止矿物的生成。

进一步地，锰氧化菌离子培养基具体包括1g/L酵母提取物，1g/L酸水解酪蛋白，1g/L葡萄糖，0.222g/L CaCl₂，0.396g/L MgSO₄，0.0006g/L FeCl₃，1mL/L微量元素溶液以及0.1～4mmol/L MnSO₄·H₂O。该锰氧化菌离子培养基可刚好满足锰氧化物的生成条件且适宜球形赖氨酸芽孢杆菌的生长。

本发明所提供的锰氧化物/球形赖氨酸芽孢杆菌组合物制备方法具有成本低、操作简单、绿色无污染等优点。

进一步地，微量元素溶液包括10mg/L CuSO₄·5H₂O、44mg/L ZnSO₄·7H₂O、20mg/LCoCl₂·6H₂O、13mg/L Na₂MoO₄·2H₂O。

本发明还提供了一种如上的球形赖氨酸芽孢杆菌或如上的组合物在处理有机物废水中的应用；有机物废水中包括卡马西平、十溴联苯醚中的一种或两种。本发明所提供的锰氧化物/球形赖氨酸芽孢杆菌组合物在降解卡马西平、十溴联苯醚的应用上，具有高效降解效果，有利于在降解有机物领域大规模应用。

本发明还提供了一种如上的球形赖氨酸芽孢杆菌如上的组合物在处理重金属废水中的应用；重金属废水中包括Cr(VI)、Mn(Ⅱ)中的一种或两种。本发明所提供的锰氧化物/球形赖氨酸芽孢杆菌组合物在去除Cr(VI)、Mn(Ⅱ)的应用上，具有高效去除效果，有利于在去除重金属领域大规模应用。

具体地，该球形赖氨酸芽孢杆菌和该锰氧化物/球形赖氨酸芽孢杆菌组合物均可单独高效去除卡马西平、十溴联苯醚、Cr(VI)、Mn(Ⅱ)等污染物；也可同步处理卡马西平、十溴联苯醚、Cr(VI)、Mn(Ⅱ)等污染物。

为对本发明作进一步的理解，现举例说明：

实施例1

球形赖氨酸芽孢杆菌的筛选、分离与纯化

1、LB液体培养基的配制：

称取酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g，加入蒸馏水1000mL，调节pH为7，分装于250mL锥形瓶中100mL，于高压灭菌锅121℃下灭菌20min，使用0.22μm无菌滤头过滤后加入3mL 100mmol/L的MnSO₄·H₂O母液，使得Mn²⁺最终浓度为3mmol/L。

2、固体培养基配制：

将酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g和琼脂15g溶于1000mL蒸馏水中，于高压灭菌锅下121℃灭菌20min，灭菌后调节pH为7，使用0.22μm无菌滤头过滤加入3mL100mmol/L的MnSO₄·H₂O母液，使得Mn²⁺最终浓度为3mmol/L。冷却至50℃后，于紫外灭菌操作台中倒平板，固体平板冷凝后备用。

3、筛选和分离：

从湖南省湘潭锰矿场中采集土壤，静置后取上清污泥液，按1％的接种量加入到步骤1、中的LB液体培养基中，在30℃、150rpm的恒温摇床上振荡培养7d后，在含有3mmol/LMnSO₄·H₂O的固体平板中涂布培养，通过平板上生长的菌落进行检验初筛。恒温培养后，挑选生长良好的菌落接种到MnSO₄·H₂O的LB液体培养基中继续培养以纯化菌种，在开始时和培养7d后取样，用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)测定Mn²⁺去除率。将去除率高的菌株培养液进一步通过LBB指示剂进行检验复筛，将对LBB指示剂显蓝色的进行分离。

其中，LBB指示剂的配制方法如下：称取0.04g LBB粉末，将其溶解于0.25mL的冰乙酸水溶液(45mmol/L)，加入去离子水并定容至100mL，4℃避光保存。

4、纯化：

将步骤3、中对LBB指示剂显蓝色的培养液稀释涂布分离于步骤2、中的固体培养基中，置于30℃生化培养箱中恒温培养，进行纯化，将纯化得到的菌株与50％甘油按1：1混匀后保藏在-80℃的冰箱中。

实施例2

锰氧化物/球形赖氨酸芽孢杆菌组合物的制备、表征和菌的分子鉴定

1、锰氧化物/球形赖氨酸芽孢杆菌组合物的制备

(1)锰氧化菌离子培养基配制：

参照淡水系统分离得到的锰氧化菌适配培养基—Leptothrix培养基，在此基础上作一定程度的修改，即:称取酵母提取物1g/L，酸水解酪蛋白1g/L，葡萄糖1g/L，CaCl₂0.222g/L，MgSO₄ 0.396g/L，FeCl₃ 0.0006g/L，微量元素溶液(10mg/LCuSO₄·5H₂O、44mg/LZnSO₄·7H₂O、20mg/L CoCl₂·6H₂O、13mg/L Na₂MoO₄·2H₂O)1mL/L以及3mmol/L MnSO₄·H₂O加入到1000mL去离子水中，于高压灭菌锅121℃灭菌20min。其中，MnSO₄·H₂O使用无菌滤头过滤加入100mL培养基中。

设置平行实验，共配制3份100mL锰氧化菌离子培养基备用。

(2)锰氧化物/球形赖氨酸芽孢杆菌组合物的生成

按1％的接种量加入实施例1中得到的球形赖氨酸芽孢杆菌至如步骤(1)中配制好的100mL锰氧化菌离子培养基中，将3个锥形瓶均放置于30℃、150rpm恒温摇床中振荡培养7d后，8000rpm离心3min后，弃去上清液，去离子水洗涤3次，所得沉淀即为锰氧化物/球形赖氨酸芽孢杆菌组合物。

2、表征分析：

上述步骤1、得到的锰氧化物/球形赖氨酸芽孢杆菌组合物的SEM图如图1所示；其TEM图(比例尺，200nm)如图2(a)所示，其TEM图(比例尺，500nm)如图2(b)所示。

据图1、图2观察可知，该球形赖氨酸芽孢杆菌的菌株形状整体呈球状，直径710nm左右。球形赖氨酸芽孢杆菌表面附着矿物颗粒，初步说明该菌通过表面成矿的方式形成锰氧化物。且该锰氧化物/球形赖氨酸芽孢杆菌组合物表面极不规则，呈现为团聚的颗粒状，锰氧化菌与生成的矿物杂糅在一起形成锰氧化物/球形赖氨酸芽孢杆菌组合物整体。

将该锰氧化物/球形赖氨酸芽孢杆菌组合物进行XRD、HRTEM以及XPS分析，其XRD图、HRTEM图、XPS图分别如图4、图5、图6所示。从图4和图5可知，锰氧化物/球形赖氨酸芽孢杆菌组合物中的锰氧化物呈无定型状态，衍射条纹混乱无序，与大多数对生物成因锰氧化物的报道一致。

从图6的XPS分析可得，该生物成因锰氧化物高价锰(Ⅲ、Ⅳ)含量为42.45％，说明该球形赖氨酸芽孢杆菌对Mn(Ⅱ)具有较强的氧化能力。

3、分子鉴定和系统发育进化树比对：

对实施例1中分离出来的球形赖氨酸芽孢杆菌进行DNA提取和测序，该过程全程由深圳微科盟科技集团有限公司完成。将测序得到的16S rRNA结果通过NCBI(美国国立生物技术信息中心)的Blast程序与已有16S rRNA核酸序列进行相似性对比。采用Mega11.0软件进行系统发育进化树的分析与绘制，其系统发育进化树见图3。

序列结果显示，该株锰氧化菌与Lysinibacillus sphaericus相似性最高，鉴定其属于赖氨酸芽孢杆菌属，并命名为MnO-1。

实施例3

球形赖氨酸芽孢杆菌的锰氧化能力测定

1、球形赖氨酸芽孢杆菌锰氧化能力

选取250ml锥形瓶，参照实施例2中步骤1、中的锰氧化菌离子培养基配制的方式配制3份100ml锰氧化菌离子培养基，Mn²⁺最终浓度为3mmol/L。按1％的接种量加入球形赖氨酸芽孢杆菌于锰氧化菌离子培养基，将各锥形瓶放置于30℃、150rpm恒温摇床中振荡培养；取样后，8000rpm离心3min，0.22μm滤头过滤，上清液使用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)测定剩余Mn²⁺浓度。

取3瓶锥形瓶取样结果的平均值，绘制锰氧化能力图像，结果如图7所示，分析图7结果可知，球形赖氨酸芽孢杆菌在8h内对Mn²⁺氧化去除的效率最高，达到37.8％，后逐渐趋于平稳，最终氧化去除率为96.6％，锰氧化能力较高。

2、球形赖氨酸芽孢杆菌生长活性

选取250ml锥形瓶，参照实施例2中步骤1、中的锰氧化菌离子培养基配制的方式，仅不加入MnSO₄·H₂O，配制100ml球形赖氨酸芽孢杆菌实验培养基，灭菌后，定时取样，在紫外分光光度计上于波长600nm处测定其吸光度。

如图8所示，为该球形赖氨酸芽孢杆菌的生长曲线图。球形赖氨酸芽孢杆菌在8h左右达到OD600值为1，在24h左右进入生长迟缓期，36h后OD600值开始下降，细菌进入衰亡期。

如图9所示，为该球形赖氨酸芽孢杆菌的生长pH变化图。球形赖氨酸芽孢杆菌生长期间pH变化不稳定，总体上随着时间增加，pH增加，培养3天pH达到8.3。

实施例4

球形赖氨酸芽孢杆菌、锰氧化物/球形赖氨酸芽孢杆菌组合物对有机物卡马西平的氧化降解实验

选取250ml锥形瓶，参照实施例2中步骤1、中的锰氧化菌离子培养基配制的方式配制100ml锰氧化菌离子培养基，灭菌后，调节pH值为8。其中，Mn²⁺的终浓度为3mmol/L。按5％的接种量加入实施例1中得到的球形赖氨酸芽孢杆菌至锰氧化菌离子培养基中。并加入终浓度为1mg/L的卡马西平，于30℃、150rpm恒温摇床中振荡培养，作为有Mn实验组(图10中有Mn)。

选取250ml锥形瓶，参照实施例2中步骤1、中的锰氧化菌离子培养基配制的方式，仅不加入MnSO₄·H₂O，配制100ml球形赖氨酸芽孢杆菌实验培养基，灭菌后，调节pH值为8。按5％的接种量加入实施例1中得到的球形赖氨酸芽孢杆菌至球形赖氨酸芽孢杆菌实验培养基中。并加入终浓度为1mg/L的卡马西平，于30℃、150rpm恒温摇床中振荡培养，作为无Mn实验组(图10中无Mn)。

选取250ml锥形瓶，参照实施例2中步骤1、中的锰氧化菌离子培养基配制的方式，不加入酵母提取物、酸水解酪蛋白、MnSO₄·H₂O，配制100ml空白实验培养基，灭菌后，调节pH值为8。按5％的接种量加入实施例1中得到的球形赖氨酸芽孢杆菌至空白实验培养基中。并加入终浓度为1mg/L的卡马西平，于30℃、150rpm恒温摇床中振荡培养作为空白对照组(图10中空白对照)。

定时取样，取样后对样品进行预处理，以满足卡马西平测定条件。使用超高效液相色谱(Acquity UPLC H-class)测定卡马西平，流动相为乙腈：水＝70：30，流速0.3mL/min，进样量10μL，检测波长285nm，保留时间5min。不同时间的取样结果如图10所示。

从图10可以看出，有Mn实验组(锰氧化物/球形赖氨酸芽孢杆菌组合物)的降解效率最高，但在三种处理下对卡马西平的降解效率差异不大。有Mn实验组在最初12h较快，降解效率达26％，在12～120h内，该组合物对卡马西平的降解效率处在波动期，但在其后随着时间的推移，卡马西平进一步被降解，最终达到59％。本发明的球形赖氨酸芽孢杆菌显示出了对卡马西平良好的降解效果，有利于在废水中有机物降解领域的应用。

实施例5

球形赖氨酸芽孢杆菌、锰氧化物/球形赖氨酸芽孢杆菌组合物对有机物十溴联苯醚的氧化降解实验

选取250ml锥形瓶，参照实施例2中步骤1、中的锰氧化菌离子培养基配制的方式配制100ml锰氧化菌离子培养基，灭菌。其中，Mn²⁺的终浓度为1mmol/L。并加入终浓度为5mg/L的十溴联苯醚，不接种球形赖氨酸芽孢杆菌，于30℃、150rpm恒温摇床中振荡，作为Mn空白对照组(图11中Mn)。

选取250ml锥形瓶，参照实施例2中步骤1、中的锰氧化菌离子培养基配制的方式，仅不加入MnSO₄·H₂O，配制100ml球形赖氨酸芽孢杆菌实验培养基，灭菌后，按5％的接种量加入实施例1中得到的球形赖氨酸芽孢杆菌至球形赖氨酸芽孢杆菌实验培养基中。并加入终浓度为5mg/L的十溴联苯醚，于30℃、150rpm恒温摇床中振荡培养，作为菌实验组(图11中菌)。

选取250ml锥形瓶，参照实施例2中步骤1、中的锰氧化菌离子培养基配制的方式配制100ml锰氧化菌离子培养基，灭菌后，按5％的接种量加入实施例1中得到的球形赖氨酸芽孢杆菌至锰氧化菌离子培养基中。其中，Mn²⁺的终浓度为1mmol/L。并加入终浓度为5mg/L的十溴联苯醚，不接种球形赖氨酸芽孢杆菌，于30℃、150rpm恒温摇床中振荡，作为Mn+菌实验组(图11中Mn+菌)。

实施例6

球形赖氨酸芽孢杆菌、锰氧化物/球形赖氨酸芽孢杆菌组合物对重金属Cr(VI)的去除实验

选取250ml锥形瓶，参照实施例2中步骤1、中的锰氧化菌离子培养基配制的方式配制100ml锰氧化菌离子培养基，灭菌后，按5％的接种量加入实施例1中得到的球形赖氨酸芽孢杆菌至锰氧化菌离子培养基中。其中，Mn²⁺的终浓度为3mmol/L。并加入终浓度为50mg/L的Cr(VI)，于30℃、150rpm恒温摇床中振荡培养，作为Mn+菌实验组(图12中Mn+菌)(即锰氧化物/球形赖氨酸芽孢杆菌组合物)。

选取250ml锥形瓶，参照实施例2中步骤1、中的锰氧化菌离子培养基配制的方式，仅不加入MnSO₄·H₂O，配制100ml球形赖氨酸芽孢杆菌实验培养基，灭菌后，按5％的接种量加入实施例1中得到的球形赖氨酸芽孢杆菌至球形赖氨酸芽孢杆菌实验培养基中。并加入终浓度为50mg/L的Cr(VI)，于30℃、150rpm恒温摇床中振荡培养，作为菌实验组(图12中菌)(即球形赖氨酸芽孢杆菌)。

取样后，对样品进行预处理，溶液中Cr(VI)含量测定采用二苯碳酰二肼分光光度法进行检测。即：样品均以8000rpm离心3min后，取一定量上清液于50ml比色管中，加水稀释至刻度线，摇匀；分别加入0.5ml 50％硫酸溶液和50％磷酸溶液，再加入2ml显色剂，摇匀。静置5～10min后在540nm处测定吸光度，球形赖氨酸芽孢杆菌、锰氧化物/球形赖氨酸芽孢杆菌组合物对重金属Cr(VI)的去除效率如图12所示。

如图12可以看出，球形赖氨酸芽孢杆菌、锰氧化物/球形赖氨酸芽孢杆菌组合物两者对该锰氧化菌去除Cr(VI)效率相差不大，去除率都达到了95％以上。本发明的球形赖氨酸芽孢杆菌、锰氧化物/球形赖氨酸芽孢杆菌组合物均显示出了对重金属Cr(VI)优良的去除效果，有利于在有机物—重金属复合污染场地领域的应用

综上所述，本发明筛选出来一株新型锰氧化菌——球形赖氨酸芽孢杆菌，该菌对Mn²⁺氧化能力较强，潜在应用研究价值巨大；该菌通过氧化Mn²⁺形成的锰氧化物/球形赖氨酸芽孢杆菌组合物可提高对卡马西平的降解效率，该菌单独降解卡马西平也能达到56％的降解效率。同时，制备得到的锰氧化物/球形赖氨酸芽孢杆菌组合物对十溴联苯醚的降解效率达到了60％以上。MnO-1(球形赖氨酸芽孢杆菌)本身对重金属Cr(VI)的去除率也达到了95％以上。说明该菌对环境适应性良好，能去除降解多种污染物，可在有机物—重金属复合污染领域方面广泛应用。

综上所述，本发明的上述技术方案中，以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的技术构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围。

Claims (8)

1.一种球形赖氨酸芽孢杆菌，其特征在于，所述球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillussphaericus)MnO-1属于氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2023年4月27日，保藏编号为CGMCCNo.27228。

2.一种如权利要求1所述的球形赖氨酸芽孢杆菌对锰的氧化的应用。

3.一种锰氧化物/球形赖氨酸芽孢杆菌组合物，其特征在于，包括无定型态锰氧化物和如权利要求1所述的球形赖氨酸芽孢杆菌；其中，所述无定型态锰氧化物以团聚的颗粒状与所述球形赖氨酸芽孢杆菌杂糅在一起。

4.一种如权利要求3所述的组合物的制备方法，其特征在于，包括：

每100mL锰氧化菌离子培养基以1～2％的接种量接种如权利要求1所述的球形赖氨酸芽孢杆菌，于25～35℃下振荡培养5～10d，得所述锰氧化物/球形赖氨酸芽孢杆菌组合物；

其中，所述锰氧化菌离子培养基中包括0.1～4mmol/L Mn²⁺。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述锰氧化菌离子培养基具体包括1g/L酵母提取物，1g/L酸水解酪蛋白，1g/L葡萄糖，0.222g/LCaCl₂，0.396g/L MgSO₄，0.0006g/L FeCl₃，1mL/L微量元素溶液以及0.1～4mmol/LMnSO₄·H₂O。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述微量元素溶液包括10mg/LCuSO₄·5H₂O、44mg/L ZnSO₄·7H₂O、20mg/L CoCl₂·6H₂O、13mg/LNa₂MoO₄·2H₂O。

7.一种如权利要求1所述的球形赖氨酸芽孢杆菌或如权利要求3所述的组合物在处理有机物废水中的应用；

所述有机物废水中包括卡马西平、十溴联苯醚中的一种或两种。

8.一种如权利要求1所述的球形赖氨酸芽孢杆菌如权利要求3所述的组合物在处理重金属废水中的应用；

所述重金属废水中包括Cr(VI)、Mn(Ⅱ)中的一种或两种。