CN114644992A - 一株科萨克氏菌属菌株及其用于高浓度重金属铅、铀污染土壤的原位修复的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一株科萨克氏菌属菌株及其用于高浓度重金属铅、铀污染土壤的原位修复的方法。该菌株名称：Kosakonia sp.GRINML13，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏日期：2019年11月20日，保藏编号：CCTCC NO：M 2019961。该菌具有高效解磷解钾作用及强的重金属耐受性，可以将难溶性磷酸盐转化为可溶性磷酸盐，同时钝化重金属，具有成本低、无二次污染、节省能源等优点，可用于农业生产及重金属污染修复。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，涉及一株科萨克氏菌株(Kosakonia sp.GRINML13)及其用于高浓度重金属铅、铀污染土壤的原位修复的方法。
背景技术
磷元素和钾元素是植物生长必不可少的两种元素。据统计，我国有74％的农田土壤缺磷，60％的农田土壤缺钾。与此同时，磷元素和钾元素常以难于被植物利用的形式存在。例如，磷元素一般存在于磷酸盐中，钾元素则存在于钾长石、云母等硅酸盐中。因此，提高农田的磷和钾含量是提高农作物产量和品质的重要手段。然而，农业生产上过量的使用，导致土壤中磷肥和钾肥大量囤积。过剩的磷和钾将会通过径流、渗漏等向地表及地下的水体转移，使得农田地下水富营养化风险增大。所以通过微生物的解磷能力，将土壤中不溶态的磷肥和钾肥等转化为植物可以利用的可溶态，一方面可以降低磷肥和钾肥的投入降低环境污染风险。同时提高土壤肥力，促进植物生长。
微生物在解磷的同时还具有钝化重金属的特性，主要通过解磷微生物将土壤中不溶性磷酸盐分解，之后磷酸根通过离子交换、表面吸附、共沉淀等方式改变重金属的物理化学性质，降低其移动性，从而降低其危害。我国面临着严重的土壤污染问题。调查显示，全国土壤污染超标率为16.1％，农田超标率为19.4％。微生物修复的广泛应用，可以大大缩减修复的成分，提高修复效率，同时避免二次污染等。
因此，亟待找到一种可以解磷，提高土壤肥力并同时固化重金属污染的微生物。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一株科萨克氏菌属菌株，该菌株可高效地将磷酸钙中的磷释放出来，形成磷酸根，磷酸根可以和重金属铅离子形成难溶性氯磷酸铅，与铀形成磷酸铀酰沉淀。
本发明的第二个目的是提供一种可以富集、分离、培养该细菌的培养基。
本发明的第三个目的是提供一种利用该菌用于高浓度铅及铀污染土壤原位修复的方法。
为了实现上述目的，本发明提供一株科萨克氏菌属菌株，菌株分类命名为：Kosakonia sp.GRINML13，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏日期：2019年11月20日，保藏编号：CCTCC NO：M 2019961。
本发明还提供用于分离培养如上所述科萨克氏菌属菌株的培养基(简称：分离培养基)，所述培养基包括解无机磷固体培养基和解钾固体培养基；
其中，配方为：解无机磷固体培养基：葡萄糖5～10g/L，KCl 0.1～0.5g/L，MgCl2·6H2O 0.1～0.5g/L，(NH4)2SO4 0.5～1.0g/L，Ca3(PO4)2 5～10g/L，酵母浸提物2.0～4.0g/L，0.4％溴酚蓝2.0～3.0ml/L，琼脂15.0～20.0g/L，溶于蒸馏水中，调整pH为6.0～7.0。
解钾固体培养基：蔗糖5～10g/L，Na2HPO4 0.5～1.0g/L，MgSO4·7H2O 0.01～0.05g/L，(NH4)2SO40.5～1g/L，CaCO3 0.5～0.5g/L，钾长石粉1.0～2.0g/L，琼脂15.0～20.0g/L，调整pH为6.0～7.0。
配制解无机磷固体培养基或解钾固体培养基时，将琼脂以外的成分混合均匀后加入琼脂，调pH7.0，121℃下灭菌30分钟后倒平板。
本发明还提供用于富集培养如上所述科萨克氏菌属菌株的培养基(简称：富集培养基)，配方为：葡萄糖10g，MgCl·6H2O 5.0g，MgSO4·7H2O 0.3g，KCl 0.2g，(NH4)2SO40.1g，NH4Cl 0.1g，Ca3(PO4)2 5.0g，1L蒸馏水，调整pH为7.0。
配置时将各成分混合均匀，调pH7.0，121℃下灭菌30分钟。
如上所述科萨克氏菌属菌株的富集培养方法，将所述科萨克氏菌属菌株菌种接种入富集培养基中，在30℃的培养温度下，170rpm摇床培养培养至菌液浓度为108个/mL。
本发明还提供一种利用上述科萨克氏菌属菌株用于高浓度重金属铅和铀污染原位修复的方法，将所述科萨克氏菌属菌株的菌种，采用如上所述的方法进行富集培养后，接种至高浓度重金属铅、铀污染土壤中。
优选地，接种量为每m3体积2-4L。
本发明的有益效果在于：
1)本发明提供了一株科萨克氏菌属菌株Kosakonia sp.GRINML13，该菌可高效将磷酸钙中的磷释放出来，转化为可溶性的磷酸根；将钾长石中的钾释放出来，形成钾离子，磷酸根可以和重金属铅或铀离子形成难溶性金属-磷酸盐矿物。
2)本发明方法对重金属污染治理过程中不添加任何有毒的化学试剂，不会对环境造成二次污染，该法不仅适用铅和铀治理，同时也适用于如镉、铜等重金属的治理。
3)本发明方法与目前工业上应用的方法相比，具有效率高，操作简单，对环境扰动性小等优点。
4)本发明微生物对人、畜安全，无环境污染问题。
附图说明
图1为本发明提供的科萨克氏菌属菌株的电镜照片。
图2为本发明提供的科萨克氏菌属菌株的解磷效果。
图3为本发明提供的科萨克氏菌属菌株的解钾效果。
图4为本发明提供的科萨克氏菌属菌株铀胁迫下OD600。
图5为本发明提供的科萨克氏菌属菌株的铀的去除效果。
具体实施方式
下面将对本发明的实施例进行详细、完善的描述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
本发明提供一株科萨克氏菌属菌株，菌株分类命名为：Kosakonia sp.GRINML13，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏日期：2019年11月20日，保藏编号：CCTCC NO：M 2019961。
该科萨克氏菌属菌株分离自江西某铀尾矿库周边的土壤。
用于分离培养上述科萨克氏菌属菌株的培养基(简称：分离培养基)，配方为：解无机磷固体培养基：葡萄糖5～10g/L，KCl 0.1～0.5g/L，MgCl2·6H2O 0.1～0.5g/L，(NH4)2SO40.5～1.0g/L，Ca3(PO4)2 5～10g/L，酵母浸提物2.0～4.0g/L，0.4％溴酚蓝2.0～3.0ml/L，琼脂15.0～20.0g/L，溶于蒸馏水中，调整pH为6.0～7.0。解钾固体培养基：蔗糖5～10g/L，Na2HPO4 0.5～1g/L，MgSO4·7H2O 0.01～0.02g/L，(NH4)2SO4 0.3～0.5g/L，CaCO3 0.3～0.5g/L，钾长石粉1.0～2.0gL，琼脂15.0～20.0g/L，溶于蒸馏水中，调整pH为7.0。
配制解无机磷固体培养基或解钾固体培养基时将琼脂以外的成分混合均匀后加入琼脂，调pH7.0，121℃下灭菌30分钟。按上述比例配置100mL培养基，每20mL倒一块平板。
用于富集培养上述科萨克氏菌属菌株的培养基(简称：富集培养基)，配方为：葡萄糖10g，MgCl·6H2O 5.0g，MgSO4·7H2O 0.3g，KCl 0.2g，(NH4)2SO40.1g，NH4Cl 0.1g，Ca3(PO4)2 5.0g，1L蒸馏水，调整pH为7.0。
配置时将各成分混合均匀，调pH7.0，121℃下灭菌30分钟。
实施例1科萨克氏菌属菌株的获取和鉴定
1)取10g土样放入到已灭菌的90mL去离子水中，在30℃，摇床170rpm轻轻震荡30分钟，静置分层，利用显微镜检测判断上清液细菌生长情况。
2)采用无菌膜过滤将上述上清液中的细菌过滤，并将细菌用20mL无菌水洗下。以5％的接种量分别接种于多个95mL富集培养基中，并设置不接种对照(CK)，30℃，170rpm摇床培养3天后观察细菌生长情况，菌液浓度达到108个/mL，取出摇瓶。
3)将富集培养基液梯度稀释1、2、3、4、5(分别对应10-1，10-2，10-3，10-4，10-5)，分别取100μL稀释液涂布在解无机磷分离培养基配制的平板上，30℃培养三天。挑菌落生长较大，溶磷圈明显的单菌落进行进一步平板划线，分离得到单菌落。挑取单菌落后，转入新的固体培养基平板中，利用平板划线分离法继续进行分离培养，直至获得具有解磷效果的单菌落。将获得的具有解磷效果的单菌落采用同样方法平板划线到解钾固体培养基中进行分离培养，直至得到具有解磷解钾效果的单菌落。
菌体电镜形态如图1所示，从图1可以看该菌为杆菌。
用16S rDNA克隆文库技术分析鉴定菌种。将1mL菌液离心得到菌泥，提取总DNA，利用PCR技术以原核生物通用引物27f和1492r扩增16S rDNA片段。PCR产物纯化后与Promega的T-easy载体连接，转化大肠杆菌DH5α。挑取的白色菌落通过菌落PCR确定阳性菌落，经酶切分型，对4个克隆测序。所得序列经Blast比较表明，该菌株为Kosakonia sp.属细菌，分类命名为Kosakonia sp.GRINML13。
实施例2科萨克氏菌属菌株高效解磷解钾
1)将科萨克氏菌属菌株Kosakonia sp.GRINML13用前述富集培养基培养7天，并且用无菌注射器连续7天取5mL液体，用0.45μm过滤器过滤后装入离心管中，取100μL过滤液采用紫外分光光度法测定可溶性磷含量。
2)经过7天的连续测量得到可溶性磷浓度分别为88.52mg/L、120.20mg/L、152.83mg/L、182.83mg/L、198.26mg/L、210.42mg/L、215.45mg/L，该菌具有高效溶解磷酸钙中磷的能力，如图2所示。
3)将科萨克氏菌属菌株Kosakonia sp.GRINML13用解钾液体培养基：蔗糖5g，Na2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.1g，(NH4)2SO4 0.5g，CaCO3 0.1g，钾长石粉5.0g，1L蒸馏水，培养7天，并且用无菌注射器连续7天取5mL液体，用0.45μm过滤器过滤后装入离心管中，取100μL过滤液采用原子吸收分光光度法测定可溶性钾含量。
4)经过7天的连续测量得到可溶性钾浓度分别为29.57mg/L、33.74mg/L、40.44mg/L、48.43mg/L、57.01mg/L、63.58mg/L、64.47mg/L、64.36mg/L，该菌具有溶解钾长石中钾的能力，如图3所示。
实施例3科萨克氏菌属菌株增肥固铅
将科萨克氏菌属菌株Kosakonia sp.GRINML13用前述富集培养基培养7天，将菌液接种至重金属铅(682.72mg/kg)污染农田土壤中，接种量为每立方米3L菌液，120天后可溶性磷含量由112.86mg/kg增加到124.46mg/kg，增加10.28％；可溶性钾含量由152.65mg/kg增加到161.02mg/kg，增加5.48％，有效态铅由38.64mg/kg下降到3.16mg/kg，铅固化率为91.83％，该菌具有增肥和固定农田土壤重金属铅的作用。
实施例4科萨克氏菌属菌株铀的最大耐受力及去除率验证
将在富集培养基中生长到对数期的Kosakonia sp.GRINML13按2％的接种量分别接种至高压蒸汽灭菌的富集培养基中，并用NaOH溶液调节其初始pH值为6。在30℃，150rpm培养24h后，向培养基溶液中加入用0.22μm滤膜过滤后的NaHCO3和1000mg/L的铀标准溶液至溶液中的U(VI)的含量为0mg/L、5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L，继续恒温震荡培养72h。
培养过程中的OD600与时间的关系如图4所示，从图4可以看出，在不同铀浓度下，科萨克氏菌属菌株均能较好的生长。
如图5所示，在不同铀浓度下，随着反应时间的延长，铀的去除率进一步的增加，最高去除率可达90％以上，具有较好的铀耐受能力(可耐受pH为3～8，铀浓度高达100mg/L的溶液)和铀去除能力。
从上述实施例可以看出，本发明提供的科萨克氏菌属菌株利用解无机磷的特性，可以沉淀难溶性重金属，如铅、铀等，解钾的特性可将钾长石中不溶性钾变为可溶性钾为土壤增加肥力，实现固定重金属污染物和增肥的双重作用。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施案例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
Claims (6)
1.一株科萨克氏菌属菌株，其特征在于，该菌株的分类命名为：Kosakoniasp.GRINML13，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏日期：2019年11月20日，保藏编号：CCTCC NO：M 2019961。
2.用于分离培养如权利要求1所述科萨克氏菌属菌株的培养基，其特征在于，所述培养基包括解无机磷固体培养基和解钾固体培养基；
其中，解无机磷固体培养基配方为：葡萄糖5～10g/L，KCl 0.1～0.5g/L，MgCl2·6H2O0.1～0.5g/L，(NH4)2SO4 0.5～1.0g/L，Ca3(PO4)2 5～10g/L，酵母浸提物2.0～4.0g/L，0.4％溴酚蓝2.0～3.0ml/L，琼脂15.0～20.0g/L，溶于蒸馏水中，调整pH为6.0～7.0；
解钾固体培养基配方为：蔗糖5～10g/L，Na2HPO4 0.5～1.0g/L，MgSO4·7H2O 0.01～0.05g/L，(NH4)2SO4 0.5～1g/L，CaCO3 0.5～0.5g/L，钾长石粉1.0～2.0g/L，琼脂15.0～20.0g/L，调整pH为6.0～7.0。
3.一种用于富集培养如权利要求1所述科萨克氏菌属菌株的富集培养基，其特征在于，富集培养基配方为：葡萄糖5～10g/L，MgCl2·6H2O 0.5～1.0g/L，MgSO4·7H2O 5～10g/L，KCl 0.2～0.5g/L，(NH4)2SO4 1.0～2.0g/L，Ca3(PO4)23.0～5.0g/L，溶于蒸馏水中，调整pH为6.0～7.0。
4.用于富集培养权利要求1所述科萨克氏菌属菌的培养方法，其特征在于，将如权利要求1所述科萨克氏菌接种入如权利要求3所述的富集培养基中，在30～33℃的培养温度下，170rpm摇床培养至菌浓度达到108cfu/mL。
5.一种用于高浓度重金属铅、铀污染土壤的原位修复的方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求1所述科萨克氏菌属菌株，采用如权利要求4所述的方法进行富集培养后，接种至高浓度重金属铅、铀污染土壤中。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，接种量为每m3体积2-4L。
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