CN107338199B - 一种促进磷矿粉溶解的菠萝泛菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种促进磷矿粉溶解的菠萝泛菌及其应用。该菠萝泛菌(Pantoea ananatis)HCR2于2017年1月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No:60140。本发明的菠萝泛菌能够高效溶解磷矿粉，同时还可以促进磷矿粉对土壤或溶液中的铅的固定作用。

Description

一种促进磷矿粉溶解的菠萝泛菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种促进磷矿粉溶解的菠萝泛菌(Pantoeaananatis)及其应用。

背景技术

当前，我国土壤环境状况总体不容乐观，部分地区污染较为严重，耕地土壤环境质量堪忧，工矿业废弃地土壤环境问题突出，工矿业、农业等人为活动以及土壤环境背景值高是造成土壤污染或超标的主要原因。其中铅污染土壤较为严重。铅是一种毒性较大的重金属，一旦进入人体将很难排除，能直接伤害人的脑细胞，特别是胎儿的神经系统可造成先天智力低下,对老年人会造成痴呆等。另外，受铅污染的土壤经过一系列的自然作用和环境作用下进入大气和水体中，从而引起的大气污染、水污染和其他生态环境问题。因此，如何减少土壤铅含量或降低植物对铅的吸收，修复铅污染土壤是当今土壤环境科学研究的热点。

利用含磷材料对铅污染土壤进行修复引起了国内外学者的广泛兴趣，近年来已在土壤重金属污染修复领域开展了越来越多的研究。在铅污染土壤中添加不同的含磷材料，会通过吸附、沉淀、离子交换等作用与土壤铅形成稳定的氯磷铅矿类物质[Pb₅(PO₄)₃X；X＝F，Cl，Br或OH]，从而降低了铅的生物有效性。但是长期施用大量含磷的改良剂，会使溶解性磷过量，并可能向地表或地下迁移，有造成地表水体富营养化和地下水污染。而磷矿粉是属于难溶性磷肥，施入土壤以后，主要依靠土壤中的酸度、土壤微生物、作物根系分泌的弱酸等的作用进行转化，才能被作物吸收利用，其肥效很慢而且持久。很多研究也表明磷矿粉的成本低、取材方便，因此越来越多的学者选取磷矿粉作为重金属的钝化剂。施加磷矿粉来钝化污染环境中的铅是一种切实可行的方法。但是，在采用磷矿粉对农田土壤重金属进行钝化时，由于磷矿粉存在的品位低和难溶性问题，导致不能有效的释放磷，进而在污染治理的效果大大减弱。因此，如何有效的使磷矿粉中的磷元素释放出来成为农田土壤重金属钝化的关键所在。

发明内容

为解决现有技术的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种促进磷矿粉溶解的菠萝泛菌，是从东南景天根系组织分离的一株具有高效溶磷作用的菠萝泛菌HCR2。

本发明涉及一株溶磷菌，其为一株具有产生生长素(IAA)、铁载体和溶解磷矿粉作用的菠萝泛菌(Pantoea ananatis)，其具有较高的Zn、Pb、Cd抗性，还涉及该菌株在促进磷矿粉对铅污染土壤的改良和修复治理技术的应用。

本发明的另一目的在于提供上述菠萝泛菌的应用。该菠萝泛菌HCR2不仅能促进磷矿粉中的磷元素释放出来，而且能固定溶液和土壤中铅，从而达到修复铅污染土壤。因此可将其用于对铅污染土壤原位改良。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种菠萝泛菌(Pantoea ananatis)HCR2，简称HCR2菌。该菠萝泛菌(Pantoeaananatis)HCR2保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No：60140，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏日期为2017年1月16日。

该HCR2菌是在浙江衢州铅锌矿山的超累积生态型东南景天的根系组织中分离获得，属革兰氏阴性菌，杆状，菌体的平均长度为18-20μm，平均宽度为7-8μm。其在LB固体培养基中生长良好，28℃培养4-5天，菌落直径可达3-4mm，菌落呈圆形，边缘整齐，颜色呈乳黄色，表面湿润，菌落中心呈扁平圆形凸起，略高于菌落边缘。

经序列测定，该HCR2菌的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

HCR2菌的保藏方法，其保藏培养基的成分为氯化钠10.0g/L、蛋白胨10.0g/L、酵母粉5.0g/L、琼脂15.0g/L；pH 7.2～7.4。按照常规菌种保藏温度保藏。

本发明所述的菠萝泛菌HCR2在溶解磷矿粉中的应用。

本发明所述的菠萝泛菌HCR2联合磷矿粉能固定溶液和土壤中的铅。因此该菠萝泛菌HCR2可用于对铅污染土壤修复。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

发明人经过大量的实验研究，筛选出一株菠萝泛菌(Pantoea ananatis)HCR2。此菌株不仅能促进磷矿粉中的磷元素释放出来，而且能固定溶液和土壤中的铅，从而达到修复铅污染土壤。

附图说明

图1为本发明实施例提供的菠萝泛菌的溶磷效果特征图；分别在NBRIP的固体培养基中划线接种(左图)和点接10μL本发明实施例提供的菠萝泛菌菌液(右图)，培养5天后，固体平板中均出现透明光圈，表明了菠萝泛菌可以在含难溶性无机磷的培养基中生长，并且可以显著地溶解培养基中的难溶性无机磷。

图2为发明实施例提供的菠萝泛菌的菌落特征图；

图3为发明实施例提供的菌落的透射电镜特征图；

图4为培养液中的剩余水溶性磷浓度(a)和铅离子浓度降低百分率(b)的变化，注：接种菠萝泛菌HCR2的培养液与硝酸铅反应前，水溶性磷浓度分别为62.47；铅离子浓度降低百分率(％)＝(加入硝酸铅后溶磷的铅离子浓度-反应后的铅离子浓度)/加入硝酸铅后溶磷的铅离子浓度*100。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例中采用的原料来源如下：磷矿粉(云南易普生化肥有限公司，磷含量109.33mg P/g)。

供试土壤：来自广东韶关市大宝山上坝村(24°32′34.4″N,113°42′42.1″E)的0～20cm水稻土壤。土壤的基本理化性质如下：pH 4.32，有机质16.60g·kg^-1、总磷0.66g·kg^-1、总氮1.42g·kg^-1、总钾17.5g·kg^-1，重金属总量：Cd 1.45mg·kg^-1、Pb 1088.21mg·kg^-1、Cu 68.02mg·kg^-1、Zn 731.89mg·kg^-1，重金属有效态浓度：Cd 0.69mg·kg^-1、Pb33.21mg·kg^-1、Cu 8.8mg·kg^-1、Zn 22.93mg·kg^-1。

实施例1：溶磷菌的分离和纯化

首先对东南景天的根进行表面消毒(95％酒精(1min)→30％双氧水+3％次氯酸钠(20min)→95％酒精(1min)→无菌水冲洗三次)，把消毒后的根组织放在灭菌的研钵中，研磨成汁，加入适量的磷酸缓冲溶液，搅拌均匀，静置10分钟，再搅拌，用灭菌水对东南景天跟组织研磨液进行稀释。分别从原液、稀释液中吸取200μL到LB固体培养基中培养，平板培养一周后，计数，并记录其菌落的形态。同时根据菌落特征，挑选不同的菌落到新的培养，纯化1次，-80℃保存。

实施例2：溶磷菌的筛选

定性实验：将实施例1保存的菌株在LB液体培养基上活化后，取10μL菌液点接到NBRIP(National Botanical Research Institute′s phosphate growth medium)固体培养基中，置于30℃恒温恒湿培养箱中培养7天，如果菌落周围出现明显的亮圈，则说明该菌株为溶磷菌。

定量实验：将实施例1保存的菌株在LB液体培养基上活化后，接种对数生长期的菌株的菌液0.5mL到50mL NBRIP液体培养基中，每处理3次重复，同时以加入无菌的超纯水代替菌液做空白对照，(28℃，180r·min^-1)摇床培养7d，离心(5 000r·min^-1)10min，取适量的上清液，用0.45μm的滤膜过滤，分别测定滤液的有效磷含磷和pH值。同时以接种无菌水为空白对照，每个处理三个重复。

表1溶磷菌的溶磷能力

溶磷率＝(培养基中水溶性磷含量-对照培养基中的水溶性磷含量)/培养基中加入的总磷含量*100

实验结果见表1：菌株HCR2可以在NBRIP固体培养基中生长，培养7天后，出现了明显的透明亮圈；在NBRIP液体培养基中，培养7天后，在接种无菌水的对照培养基中，水溶性磷含量仅为9.27mg/L，而菌株HCR2可以溶解培养基中的无机磷，培养基中的水溶性磷含量达到500.17mg/L，溶磷率达到49.12％。

实施例3：溶磷菌的筛选鉴定

对筛选出的溶磷菌进行菌种鉴定、个体形态观察和生理生化特征，本研究的菌种鉴定和形态观察工作由广东省微生物分析检测中心完成，得到菌株的碱基序列通过因特网在GenBank等国际核酸序列数据库内进行同源序列搜索(blast search)，找到该菌株与数据库中同源性最高的模式菌株或保藏于ATCC或DSM等国际菌种保藏中心的菌株。

(1)菌体形态特征

革兰氏阴性菌。菌体为杆状，转性厌氧。菌体的透射电镜特征图见图3。

(2)菌落形态特征

HCR2菌在LB固体培养基中生长良好，28℃培养4-5天，菌落直径可达3-4mm，菌落呈圆形，边缘整齐，颜色呈乳黄色，表面湿润，菌落中心呈扁平圆形凸起，略高于菌落边缘。菌落的形态特征图见图2。

(3)生理生化特性

HCR2的各项生理生化鉴定项目包括：接触酶、氧化酶、吲哚试验、丙二酸盐、柠檬酸盐、脂酶(Tween 40、80)、精氨酸双水解酶、醇类和糖类发酵实验等(表2)。

表2菌株HCR2的生理生化指标

注：“+”为阳性，“－”为阴性。

(4)分子鉴定

将得到菌株的碱基序列通过因特网在GenBank等国际核酸序列数据库内进行同源序列搜索(blast search)，找到该菌株与数据库中同源性最高的模式菌株或保藏于ATCC或DSM等国际菌种保藏中心的菌株。根据形态特征观察及生理生化试验结果，查《伯杰细菌鉴定手册》及《常见细菌系统鉴定手册》和经过16S rDNA序列(见SEQ ID NO:1)测定及NCBI数据库在线比对，鉴定为菠萝泛菌(Pantoea ananatis)，菌株命名为HCR2。

实施例4：溶磷菌溶解磷矿粉的能力

将实施例1保存的HCR2菌在LB液体培养基上活化后，取0.5mL菌液接种到50mLNBRIP液体培养基中(每升培养液添加磷矿粉代替磷酸三钙，含磷量为360mg P/L)，28℃、180r/min培养7天，取出培养基，4℃下离心(5000r/min)10min，取适量的上清液，用0.45μm的滤膜过滤，用钒钼黄比色法测定滤液中的磷含量。

结果表明，接种HCR2菌可以溶解培养基中的磷矿粉，培养7天后，培养基中磷含量为117.31mg P/L，而接种无菌的超纯水的空白对照的培养中磷含量为3.33mg P/L。

实施例5：溶磷菌的代谢产物对水溶性铅的固定作用

将HCR2菌在LB液体培养基(氯化钠10g，蛋白胨10g，酵母粉5g，蒸馏水1000mL；pH7.2～7.4)上活化后，取0.5mL菌液接种到50mL以磷矿粉(0.9g磷矿粉，含磷量为360mg P·L^-1)作为唯一磷源NBRIP液体培养基的三角瓶中，28℃培养7天，然后取出培养基，离心(5000r/min)10min，取25mL上清液，分别加入5mL浓度为0(无菌水)、10、15、20、25、30mmol/L的Pb(NO₃)₂，(使反应体系中铅离子最终浓度分别为0.0、1.0、1.5、2.0、2.5和3mmol/L)，在摇床中恒温震荡(28℃、180r/min)，3h后取出，然后离心(5000r/min)10min，取适量的上清液，用0.45μm的滤膜过滤，用钼蓝比色法测定滤液中的磷含量和用原子吸收光度法测定滤液铅离子的含量。同时以加入无菌的超纯水代替菌液做空白对照，每处理3次重复。

结果表明：菠萝泛菌HCR2在以磷矿粉作为唯一磷源的NBRIP液体培养基中培养7天后，培养液中的水溶性磷含量为62.47mg/L。在25mL的离心后的培养液中，加入5mL不同浓度的硝酸铅溶液(使反应体系中铅离子最终浓度分别为0.0、1.0、1.5、2.0、2.5和3mmol/L)，反应3h后，随着铅浓度的增加，反应体系中的水溶性磷的剩余浓度均呈现递减趋势，铅离子浓度比对照培养基中的铅离子浓度降低的百分率均呈递增的趋势，这说明了水溶性的磷与铅发生反应，使反应体系中的水溶性磷含量降低(图4中的a)。由图4中的b可以看出，当培养基加入铅离子后铅离子浓度达到1.5mmol/L时，对照反应体系中铅离子浓度只降低了49.89％，而接种HCR2菌的反应体系中的铅浓度降低了98.13％。这表明菠萝泛菌HCR2溶解磷矿粉的代谢产物中的水溶性磷可以有效地固定水溶性铅离子。

实施例6：溶磷菌促进磷矿粉对土壤铅的固定作用

采用两因素完全随机区组试验设计：A因素为接种处理，2个处理水平，即不接种的对照(CK)和接种菌株HCR2。B因素为施加磷矿粉的水平，3个处理水平，PR 0mg P·kg^-1、800mg P·kg^-1、1200mg P·kg^-1，每个处理加入石灰2g/kg土，重复4次。

分别在组培瓶中加入100g风干且过筛20目的供试土壤，加入不同梯度的磷矿粉，于121℃下，灭菌1小时，连续性三天。然后取40mL溶磷菌细胞悬浊液，添加到土壤中使初始细菌浓度为10⁸CFU·g^-1，室温下，分别培养30天和60天。

测定项目和方法：

(1)土壤中溶磷菌的数量：称取10.0g土壤于50mL灭菌的烧杯中，然后用90mL的无菌水多次少量地转移到带玻璃珠的250mL三角瓶中，用锡箔纸封口，然后于180r·min^-1 25℃的摇床中震荡20min，稀释到10⁴和10⁵倍，然后吸取200μL的稀释液涂布到NBRIP固体培养基(每个浓度2个重复)，培养5天后，计算菌落数量。

(2)土壤含水率：将铝盒在105℃恒温箱中烘烤约2h，移入干燥器内冷却至室温，称重，准确到至0.0001g。用勺子将新鲜土样舀取约5g在铝盒中，盖好，称重，准确至0.0001g。将铝盒盖揭开，放在盒底下，置于已预热至105±2℃的烘箱中烘烤12h。取出，盖好，移入干燥器内冷却至室温(约需20min)，立即称重。

(3)土壤的pH值：土壤pH值测定采用玻璃电极法，土：水为1:2.5。

(4)土壤的有效磷含量：称取过20目的风干土样2.5g于150mL塑料瓶中，加入0.5mol·L^-1的NaHCO₃(pH＝8.5)溶液50mL，于摇床中在160r·min^-1室温下振荡30min，过滤，用钼蓝比色法测定滤液中磷的含量。

(5)NH₄NO₃提取态Pb含量的测定：称取10.00g风干土壤(20目)放入150mL三角瓶中，加25mL 1mol·L^-1NH₄NO₃浸提液，在160rpm恒温25℃振荡2h后，静置5min，取上层清液过滤。原子吸收光谱法测定滤液中铅含量。

表3溶磷菌在土壤中的生长情况和土壤的pH值、有效磷含量和有效态铅含量的变化

注：表格中数据为平均值±标准差，采用Duncan多重比较(n＝4)，对同一时间不同处理的土壤pH值、有效磷含量和有效态铅含量分别进行比较(即同一列数据进行多重比较)，具有相同字母的数据间无显著性差异。

表3的实验结果表明：

在污染土壤中加入不同磷矿粉后进行灭菌处理，培养30天和60天，测定土壤样品中可培养细菌的数量，均没有检测到细菌，这说明土壤灭菌彻底完全，且在培养过程没有被外源细菌的污染。在灭菌的土壤中接种菠萝泛菌HCR2培养，随着磷矿粉的增加和培养时间的延长，菠萝泛菌HCR2的数量显著增加，但远远低于培养前的加入量(10⁸CFU/g)，这说明菠萝泛菌HCR2在供试土壤中可以生长繁殖。在铅污染土壤中施加磷矿粉和接种溶磷菌培养30天和60天后，所有处理均可以显著提高土壤的pH值(P<0.05)。随着培养时间的增加，土壤的pH值略微有所降低。在不施加磷矿粉的处理中，单独接种菠萝泛菌HCR2(PR₀-HCR2)也可以显著提高土壤的pH值，且随着磷矿粉的施加量的增加，土壤的pH值也会显著增加(P<0.05)。在不施加磷矿粉的处理中，培养30天，PR₀-HCR2处理的土壤的pH比PR₀-CK增加了0.19个单位；在磷矿粉施加水平1200mg P/kg的处理中，PR₁₂₀₀-HCR2处理的土壤的pH比PR₀-CK(对照)增加了0.25个单位。

在不施加磷矿粉的处理中，接种菠萝泛菌HCR2(PR₀-HCR2)对土壤的有效磷含量基本上没有影响。在土壤中施加800mg P/kg或1200mg P/kg磷矿粉处理中，接种菠萝泛菌HCR2使土壤的有效磷含量有所增加，但是差异没有达到显著水平。

在不施加磷矿粉的处理中，接种菠萝泛菌HCR2(PR₀-HCR2)培养30天可以显著地降低土壤的有效铅含量19.00％，但是培养60天后，两个处理对土壤的有效态铅含量基本上没有影响。但是，在土壤中施加800mg P/kg或1200mg P/kg磷矿粉处理中，接种菠萝泛菌HCR2培养30天和60天，可以显著地降低土壤的有效态铅含量有所增加。在磷矿粉施加水平为1200mg P/kg，培养30天时，PR₁₂₀₀–CK处理的土壤的有效态铅含量比对照土壤(PR₀-CK)降低了34.00％，而PR₁₂₀₀-HCR2则降低了43.55％。而Park等研究发现(Park J H,Bolan N,Megharaj M,et al..Isolation of phosphate solubilizing bacteria and theirpotential for lead immobilization in soil[J].Journal of Hazardous Materials,2011,185(2-3):829-836.)，在铅污染土壤中，磷矿粉施加水平200和800mg P/kg的条件下，接种高效溶磷细菌Pantoea sp.处理的土壤的有效态铅含量比对照土壤仅降低8.25–13.7％，说明根据权利要求1或2所述的菠萝泛菌HCR2在联合磷矿粉对铅污染土壤修复方面的应用效果更为显著，应用前景更为深远。

综上所述，施加磷矿粉和接种菠萝泛菌HCR2均可以显著影响土壤的pH值、有效磷含量和有效态铅含量。土壤的pH值和有效磷含量随着磷矿粉的用量增加而增加，且在接种菠萝泛菌HCR2的情况下，土壤的pH值和有效磷含量增加的更为显著；土壤的有效态铅含量则随着磷矿粉的用量增加而降低，且在接种菠萝泛菌HCR2的情况下，土壤的有效态铅含量降低的更为显著。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 一种促进磷矿粉溶解的菠萝泛菌及其应用

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1494

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 菠萝泛菌（Pantoea ananatis）HCR2的16S rDNA核苷酸序列

<400> 1

gaatcaagtg gtagcgccct cccgaaggtt aagctaccta cttcttttgc aacccactcc 60

catggtgtga cgggcggtgt gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccgtgg cattctgatc 120

cacgattact agcgattccg acttcacgga gtcgagttgc agactccgat ccggactacg 180

acgcacttta tgaggtccgc ttgctctcgc gaggtcgctt ctctttctat gcgccattgt 240

agcacgtgtg tagccctact cgtaagggcc atgatgactt gacgtcatcc ccaccttcct 300

ccggtttatc accggcagtc tcctttgagt tcccgaccga atcgctggca acaaaggata 360

agggttgcgc tcgttgcggg acttaaccca acatttcaca acacgagctg acgacagcca 420

tgcagcacct gtctcacggt tcccgaaggc accaaagcat ctctgctaac gacagccatg 480

cagcacctgt ctcacggttc ccgaaggcac caaagcatct ctgctaagtt ctctggatgt 540

caagagtagg taaggttctt cgcgttgcat cgaattaaac cacatgctcc accgcttgtg 600

cgggcccccg tcaattcatt tgagttttaa ccttgcggcc gtactcccca ggcggtcgac 660

ttaacgcgtt agctccggaa gccactcctc aagggaacaa cctccaagtc gacatcgttt 720

acggcgtgga ctaccagggt atctaatcct gtttgctccc cacgctttcg cacctgagcg 780

tcagtcttcg tccagggggc cgccttcgcc accggtattc ctccagatct ctacgcattt 840

caccgctaca cctggaattc tacccccctc tacgagactc aagcctgcca gtttcaaatg 900

cagttcccag gttaagcccg gggatttcac atctcactta acagaccgcc tgcgtgcgct 960

ttacgcccag taattccgat taacgcttgc accctccgta ttaccgcggc tgctggcacg 1020

gagttagccg gtgcttcttc tgcgggtaac gtcaatcgac gcggttatta accacatcgc 1080

cttcctcccc gctgaaagta ctttacaacc cgaaggcctt cttcatacac gcggcatggc 1140

tgcatcaggc ttgcgcccat tgtgcaatat tccccactgc tgcctcccgt aggagtctgg 1200

accgtgtctc agttccagtg tggctggtca tcctctcaga ccagctaggg atcgtcgcct 1260

aggtgggccg ttaccccgcc tactagctaa tcccatctgg gttcatccga tagtgagagg 1320

cccgaaggtc cccctctttg gtcttgcgac gttatgcggt attagccacc gtttccagtg 1380

gttatccccc tctatcgggc agatcccgag acattactca cccgtccgcc actcgtcacc 1440

cgaggagcaa gctcctctgt gctaccgtcc gacttgcatg tgtagctccg cccc 1494

Claims (4)

1.一种菠萝泛菌，其特征在于，该菠萝泛菌的名称为菠萝泛菌(Pantoea ananatis)HCR2，于2017年1月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No：60140。

2.如权利要求1所述的菠萝泛菌在溶解磷矿粉中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的菠萝泛菌联合磷矿粉用于固定溶液或土壤中的铅。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的菠萝泛菌联合磷矿粉用于修复铅污染土壤。

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