CN110117545B - 一种具有Cr(VI)耐性及还原能力的外生菌根真菌及其应用 - Google Patents
一种具有Cr(VI)耐性及还原能力的外生菌根真菌及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种具有Cr(VI)耐性及还原能力的外生菌根真菌,分类命名为豆马勃属(Pisolithus sp.)，保藏编号为CCTCC No:M2018087，并提供了其在去除铬污染土壤中六价铬中的应用，以及在植物‑微生物联合修复铬污染土壤中的应用。本发明还提供了利用本真菌进行植物‑微生物联合修复铬污染土壤的方法。本发明分离、筛选得到的外生菌根真菌Pisolithus sp.具有耐Cr(VI)并对其有去除能力，对去除铬污染土壤中六价铬具有重要意义，在此基础上建立植物‑微生物联合修复的新型修复体系，可充分发挥两者的优势，大幅提高重金属Cr(VI)污染土壤的修复效率。
Description
技术领域
本发明涉及环境污染治理技术领域，涉及重金属污染土壤修复的生物材料。
背景技术
目前，重金属污染对环境及人类的健康危害备受关注。其中铬污染主要来自于诸如电镀、制革、石油、涂料、印染等行业的废水、废渣，也是自然界中常见的迁移性污染物之一。铬渣的填埋和堆放所引起的环境铬污染已经成为一个严重的问题。铬在天然水-土壤系统中通常以Cr(VI)和Cr(III)两种稳定的化合价态存在，Cr(VI)在热力学上是较稳定的价态，化学活性大，毒性强，主要以HCrO4 -和CrO4 2-两种形式存在，是造成环境污染的主要污染物之一， Cr(III)在动力学上是较稳定的价态，不易迁移和被植物吸收利用，毒性较低，这两种价态在天然条件下可以相互转化。Cr(VI)的毒性比Cr(III)高约100倍，环境中的铬不易分解，易在生物体内富集，是对人体危害最大的化学物质之一，也是国际上公认的金属致癌物之一。世界各国对土壤中铬的最大浓度及安全标准做了相应的规定(表1)，我国对土壤铬的环境质量检测标准分为三级(GB15618-1995)(表2)。
表1一些国家土壤Cr(III)和Cr(VI)最大允许浓度(mg/kg)
a：总铬；b：Cr(Ⅲ)；c：Cr(Ⅵ)
表2我国土壤环境质量标准中总铬的限制(GB15618-1995)(mg/kg)
目前，修复土壤铬污染的思路主要有以下两种：一是将毒性较高的Cr(VI)经过沉淀、还原和络合作用转化为Cr(III)，降低铬的生物可利用性和在土壤中的迁移能力；二是将铬从污染的土壤中清除后再做其它无害化处理(Bellie，2014)。根据这两种思路衍生了以下几种铬污染土壤的传统修复技术：(1)固定化和稳定化技术：成本高、处理效果不够显著，清除不彻底。(2)化学还原技术：造成二次污染，缺乏技术支撑。(3)化学淋洗技术：产生大量含有污染物的淋洗液，土壤中营养元素大量流失。(4)电动修复技术：条件苛刻，成本高。(5)植物修复技术：植物类型小，根系较浅，生长缓慢，影响修复效率。
微生物修复是指利用土著微生物或者经过驯化的微生物在一定的条件下将土壤中的污染物进行降解和转化，降低污染物的迁移能力和生物可利用性。其原理主要是：
一、吸附作用，重金属离子主要是表面带有正电荷的阳离子，而微生物细胞壁表面大多带负电荷，呈现阴离子性质，因此微生物细胞可以吸附金属离子，将其聚集在细胞表面，达到净化的目的。
二、转化作用，微生物对重金属具有很强的氧化还原作用、甲基化或者去甲基化作用，甚至能够溶解重金属或者发生络合作用，降低重金属毒性，达到有效治理重金属污染的目的。
三、代谢作用，是指通过加强微生物的代谢活动，加强微生物对重金属的降解作用。微生物修复技术分为原位修复技术和异位修复技术。其中，原位修复技术具有不破坏土壤结构，处理过程相对简单，处理费用相对较低，对周围环境影响小的优点。根据修复所用微生物的种类的不同，可分为细菌修复、真菌修复、藻类修复等三种修复模式。这三类微生物对重金属的耐性通常为真菌＞细菌＞放线菌。目前研究中所报道的具有重金属修复效果的微生物有白腐真菌，真菌球，根霉菌，链霉菌，枯草芽胞杆菌，热碱处理酵母，棕色海藻、海带、黑藻，栖热菌属，希瓦氏菌属，脱硫弧菌属，巨大芽胞杆菌，梭状芽胞杆菌，苏云金芽胞杆菌等。
微生物修复技术相对于传统修复技术来讲，操作比较简便，处理形式多样，甚至可以进行原位处理，不引入化学试剂，不会造成二次污染并且不破坏植物的生长环境，已经成为治理环境污染物的重要工具。
铬污染土壤的微生物修复是在优化的操作条件下，通过生物还原反应，利用土壤中的土著微生物或向污染环境补充经过驯化的高效微生物，将Cr(VI)还原为Cr(III)，达到修复铬的目的。目前已分离出对Cr(VI)有还原作用的菌种，如硫酸盐还原菌、芽孢杆菌属、埃希氏菌属、阴沟杆菌、大肠杆菌、假单胞菌属等。Valerie等将含铬泥土与链霉菌在培养基中混合培养发现，当泥土Cr(VI)浓度为1800mg/kg时，培养30天后去除率达到100％，而且发现少量Cu2+可促进Cr(VI)的还原。而将外生菌根真菌应用于铬污染土壤的修复尚未有研究报道。
发明内容
本发明的目的在于，针对现有技术的不足，提供一种具有Cr(VI)耐性及还原能力的外生菌根真菌Pisolithus sp.TCr-1(CCTCC NO:M2018087)。
本发明的另一个目的是提供该外生菌根真菌的应用。
本发明的再一个目的是提供一种去除铬污染土壤中六价铬的方法。
本发明的又一个目的是提供一种植物-微生物联合修复铬污染土壤的方法。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
一种具有Cr(VI)耐性及还原能力的外生菌根真菌，分类命名为豆马勃属TCr-1(Pisolithus sp.TCr-1)，于2018年2月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2018087，保藏地址：中国武汉武汉大学。
Pisolithus sp.TCr-1(CCTCC NO:M2018087)分离自江西三清山(28.54N 118.03E)采集的子实体，NCBI Genbank登录号：KY075875,外生菌根真菌，非产孢丝状真菌，菌丝土黄色，好氧，植物共生菌。
所述的保藏编号为CCTCC NO:M2018087的具有Cr(VI)耐性及还原能力的外生菌根真菌在去除铬污染土壤中六价铬中的应用。
所述的保藏编号为CCTCC NO:M2018087的具有Cr(VI)耐性及还原能力的外生菌根真菌在植物-微生物联合修复铬污染土壤中的应用。
一种植物-微生物联合修复铬污染土壤的方法，在铬污染土壤中植入接种了保藏编号为CCTCC NO:M2018087的外生菌根真菌的木本植物，所述方法包括以下步骤：
S1：将经消毒的植物种子置于25℃培养箱中催芽，种子开始露白时播种到经灭菌的培养基质中；
S2：S1所述种子培育至长成幼苗后，截掉主根根尖，保留1.5-2.5cm主根，置于经活化的外生菌根真菌Pisolithus sp.TCr-1菌块上，培养基质填满培养容器；
S3：S2所述幼苗培养至菌根化率高于70％的植株，植入铬污染土壤。
进一步的，所述木本植物为根系发达的木本植物，由于其根系发达，生物量大，容易与外生菌形成菌根，可以克服草本超积累植物生物量小，生长缓慢，根系不发达的缺点，对铬污染土壤具有更好的修复效果。
进一步的，所述木本植物为松树、杨树、栗树，更优选的为日本黑松(Pinusthunbergii)。
进一步的，S1所述培养基质为蛭石,所述灭菌条件为110～130℃高压灭菌90～150min。
进一步的，S2所述培养基质为体积比1:(0.5～1.5)的蛭石与火山灰。
进一步的，S3所述幼苗培养条件为温度20～25℃的阳光房内，培养时间为3～6个月。
有益效果
本发明分离、筛选得到的外生菌根真菌Pisolithus sp.TCr-1(CCTCC NO:M2018087)具有耐Cr(VI)并对其有去除能力，该菌株主要是通过还原作用使土壤中高毒态的Cr(VI)转化为低毒态的Cr(III)。实验结果表明，Cr(VI)对Pisolithus sp.TCr-1(CCTCCNO:M2018087)的半抑制浓度达到37.5mg/L，低于55mg/L Cr(VI)浓度范围内仍可存活；该菌株的Cr(VI)还原效率高，对Cr(VI)的去除能力高达99.45％。相对于硫酸盐还原菌、芽孢杆菌属、埃希氏菌属、阴沟杆菌、大肠杆菌、假单胞菌属等对六价铬同样具有较强还原能力的细菌，以及链霉菌等真菌，作为植物共生菌，Pisolithus sp.TCr-1(CCTCC NO:M2018087)可与宿主植物形成外生菌根共生体，在提高宿主植物对Cr(VI)耐性的同时，可辅助宿主植物完成对Cr(VI)的完全去除。本发明提供的外生菌根真菌Pisolithus sp.TCr-1(CCTCC NO:M2018087)所具有的耐Cr(VI)并去除Cr(VI)的特性，对去除铬污染土壤中六价铬具有重要意义，在此基础上建立植物-微生物联合修复的新型修复体系，可充分发挥两者的优势，大幅提高重金属Cr(VI)污染土壤的修复效率。
附图说明
图1：实施例2中Pisolithus sp.TCr-1(CCTCC NO:M2018087)耐Cr(VI)能力示意图
图2：实施例3中Pisolithus sp.TCr-1(CCTCC NO:M2018087)对Cr(VI)还原能力示意图
图3：实施例4铬污染土壤的修复能力中不同的外生菌根真菌提高宿主植株干重的对比图
其中NM为非菌根化苗对照处理、Cg为Cenococcum geophilum、Hv为Hebelomavinosophyllum。
图4：实施例4铬污染土壤的修复能力中不同的外生菌根真菌根化苗的地上部铬浓度的对比图
其中NM为非菌根化苗对照处理、Cg为Cenococcum geophilum、Hv为Hebelomavinosophyllum。
图5：实施例4铬污染土壤的修复能力中不同的外生菌根真菌根化植株单株铬积累能力的对比图
其中NM为非菌根化苗对照处理、Cg为Cenococcum geophilum、Hv为Hebelomavinosophyllum。
图6：对比例5中不同的外生菌根真菌对六价铬耐性的对比图
图7：对比例6中不同的外生菌根真菌去除六价铬菌株的效果对比图
生物材料保藏信息
分类命名：豆马勃属TCr-1(Pisolithus sp.TCr-1)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:M2018087，保藏日期：2018年2月5日，保藏地址：中国武汉武汉大学。
具体实施方式
实施例1菌落特征及生理生化特性
菌种分离：Pisolithus sp.TCr-1(CCTCC NO:M2018087)分离自江西三清山(28.54N118.03E) 采集的子实体，NCBI Genbank登录号：KY075875,ITS序列如SEQ ID No.1所示。菌体、菌落形态和生理生化特性：外生菌根真菌，非产孢丝状真菌，菌丝土黄色，好氧，植物共生菌。
实施例2 Pisolithus sp.TCr-1(CCTCC NO:M2018087)耐Cr(VI)能力检测
将25℃黑暗活化20天的Pisolithus sp.TCr-1(CCTCC NO:M2018087)用直径0.65cm的打孔器沿边沿打一块菌斑并接种在Cr(VI)终浓度为0,2,5,10,50,55,60ppm的固体培养基中央，用十字交叉法每3天测定一次菌斑直径，18天结束测定，并计算其对Cr(VI)的半抑制浓度。实验结果可以得出结论：低浓度(0-10mg/L)Cr(VI)处理抑制Pisolithus sp.TCr-1(CCTCC NO:M2018087)的生长但不显著；高浓度Cr(VI)处理(50mg/L)显著抑制Pisolithussp.TCr-1 (CCTCC NO:M2018087)的生长,但仍存活，55mg/L为Cr(VI)对Pisolithus sp.TCr-1(CCTCC NO:M2018087)的致死终浓度，经过计算，Cr(VI)对Pisolithus sp.TCr-1(CCTCCNO:M2018087) 的半抑制浓度达到37.5mg/L。
实施例3 Pisolithus sp.TCr-1(CCTCC NO:M2018087)去除六价铬的生理机制研究
采用实验室固体纯培养的外生菌根真菌Pisolithus sp.TCr-1(CCTCC NO:M2018087)进行去除六价铬的生理机制研究。将25℃黑暗活化20天的外生菌根真菌Pisolithus sp.TCr-1 (CCTCC NO:M2018087)用直径0.80cm的打孔器沿边沿打两块菌斑并接种在装有100ml Cr(VI) 终浓度为0,25,50ppm液体培养基的150ml三角瓶中，置于150rpm,25℃黑暗条件下摇12天，并于0,4,8,12天分别取样测定培养基中六价铬及总铬的含量。六价铬含量采用二苯碳酰分光光度法进行测定，并计算培养基中Cr(VI)的去除率，三价铬含量用做差法计算。12天后收集菌体测定干重及菌丝体总铬含量，另外一份样品进行亚细胞分离并测定各组分铬含量，总铬含量用原子吸收分光光度计测定。实验结果可以得出结论：接种量提高后，25mg/L Cr(VI)处理4天后，Pisolithus sp.TCr-1(CCTCC NO:M2018087)对Cr(VI)的去除能力高达99％，且主要为还原作用。
表3Pisolithus sp.TCr-1对Cr(VI)的去除机制对比
表3可以得出结论：25mg/L Cr(VI)处理12天后Pisolithus sp.TCr-1(CCTCC NO:M2018087)对Cr(VI)的去除能力达99.45％，依次为还原作用(74.99％)>吸附作用(24.14％)> 吸收作用(0.32％)，且去除能力随着Cr(VI)浓度的提高而降低。
实施例4植物-微生物联合修复铬污染土壤的研究
供试菌株：Cenococcum geophilum、Hebeloma vinosophyllum、Pisolithussp.TCr-1(CCTCC NO:M2018087)
供试植物：日本黑松(Pinus thunbergii)
试验方法：
菌种活化：用直径1.0cm的打孔器沿菌落边缘取一块菌斑接种于经过121℃高温高压灭菌2h且冷却的Kottke固体培养基中，置于25℃恒温培养箱中暗培养18天备用。
幼苗培育：选择颗粒均匀饱满的黑松种子用流水冲洗干净，然后用30％H2O2消毒15min，清水漂洗，置于25℃培养箱中催芽2周左右，种子开始露白时播种于小盆钵内。培养基质为蛭石(经过121℃高压灭菌120冷却)，培育期间保持基质湿润。
菌根合成苗容器的制备：将50ml尖底离心管的底部和侧面5ml标线处开直径8mm的孔，将灭过菌(121℃,120min,2h)的脱脂棉塞到管底部，高度过5ml标线，离心管外壁用即时贴包好避光。
菌根合成及培养：幼苗培育60天后，选择生长整齐均勾的幼苗，截掉主根根尖，保留2cm 左右，备用。将培养基质(蛭石：火山灰＝1:1v/v)分装到离心管内30ml标线处，取上述3种备用菌的菌块，置于培养介质上，再将准备好的黑松苗置于菌块上，最后用介质填满离心管，浇透水，对照组除不加菌块外其他条件一样，每个处理10个重复，培养条件为阳光房(早25℃晚20℃)，培养到4个月后体视显微镜下观察并计算植株菌根侵染率，从中选取菌根化率高于 70％且接近的植株用于后续实验。
铬污染土壤的修复：用蛭石与火山灰体积比1:1作为实验基质，以K2Cr2O7形式向基质中添加六价铬，使得基质中六价铬终浓度从低到高依次为0,100,200,400和800mg kg-1，每3 天喷加去离子水且翻匀基质，保持基质静置2个月以平衡基质中的铬。用直径9.6cm,高度7.9cm 的圆口盆每盆装0.13kg基质，每盆种两株非菌根化苗或同种类的菌根化苗，每个处理三个重复，设置三个没有植株的空白盆。植株在阳光房中培养5个月，调节温度早25℃，晚20℃。结果可以得出结论：接种外生菌根真菌可以显著提高宿主植物的生物量，且接种Pisolithus sp. TCr-1(CCTCC NO:M2018087)对宿主植物的促生效果最好，显著提高了宿主植物对铬的耐性。
另外在不同的外生菌根真菌根化苗的地上部铬浓度研究中，可以得出结论：高浓度的铬处理后，Pisolithus sp.TCr-1(CCTCC NO:M2018087)菌根化苗的地上部铬浓度最大，结合图3 的结果可以说明虽然接种Pisolithus sp.TCr-1(CCTCC NO:M2018087)显著提高的宿主植物的生物量，对植物体内的铬有一定的稀释作用，但高浓度铬处理使得Pisolithussp.TCr-1(CCTCC NO:M2018087)菌根化植株体内铬含量仍然显著性增大，说明Pisolithussp.TCr-1(CCTCC NO:M2018087)菌根化植株地上部具有较强的富集铬的能力。
不同的外生菌根真菌根化植株单株铬积累能力研究中，可以得出结论：Pisolithus sp. TCr-1(CCTCC NO:M2018087)菌根化植株单株铬积累能力最强，显著高于其他菌根化植株，可用于铬污染土壤的植物修复。
对比例5：菌株六价铬耐性的对比
采用实验室固体纯培养的6种外生菌根真菌进行耐铬菌株筛选。将25℃黑暗活化20天的 6种外生菌根真菌分别用直径0.8cm的打孔器沿边沿打一块菌斑并分别接种在Cr(VI)终浓度为 0,2,5,10,50ppm的固体培养基中央，用十字交叉法每3天测定一次菌斑直径，24天结束测定，并计算其对Cr(VI)的半抑制浓度。筛选结果可以得出结论：Pisolithussp.TCr-1(CCTCC NO:M2018087)对六价铬的半抑制浓度达到37.5mg/L，在6种外生菌根真菌中体现了最强的耐铬能力(图中Pisolithus.sp2为不同于本发明Pisolithus sp.TCr-1(CCTCC NO:M2018087) 的豆马勃属下另一菌株)。
对比例6菌株去除六价铬菌株的对比
采用实验室固体纯培养的6种外生菌根真菌进行去除六价铬菌株的筛选。将25℃黑暗活化20天的6种外生菌根真菌分别用直径0.65cm的打孔器沿边沿打两块菌斑并分别接种在装有 100ml Cr(VI)终浓度为0,25,50ppm液体培养基的150ml三角瓶中，置于150rpm,25℃黑暗条件下摇8天，并于0,4,8天分别取样测定各外生菌根真菌培养基中六价铬的含量。六价铬含量采用二苯碳酰分光光度法进行测定，并计算培养基中Cr(VI)的去除率。研究结果可以得出结论：25mg/L Cr(VI)处理8天后，培养基中接近45％的Cr(VI)被Pisolithussp.TCr-1(CCTCC NO:M2018087)去除，在6种外生菌根真菌中体现了最强的Cr(VI)去除能力(图中Pisolithus. sp2为不同于本发明Pisolithus sp.TCr-1(CCTCC NO:M2018087)的豆马勃属下另一菌株)。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 一种具有Cr(VI)耐性及还原能力的外生菌根真菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 570
<212> DNA
<213> 豆马勃属(Pisolithus sp.)
<400> 1
caaagttgga gaagcatggg acacgtccct tgcagctggc aagcccacga cgatcattat 60
gatgctggga gaggctggtg ccaagcaaga cttgcatgcc caccgmtaat gcatttcagg 120
agagctgacg acgtgcgtcg cccacagact cccaacaatc caaacccgag ccttcgaccg 180
aagtcaaaaa aaagaaggct tggtttgaga tttcgatgac actcaaacag gcatgctcct 240
cggaatatca aggagcacaa ggtgcattca aagattcaat gattcacgga aaatctgcaa 300
ttcacattac ttatcgcaat tcgctgcatt cttcattgat gcgagagcca agagatccgt 360
tgctgaaagt tgtattttta tatatatatc aaatgctatc gacattctgt agacatgcaa 420
gtcagagatg aaatgcacag gtcccgaagg gacccttgmg aatggggtgc acgcgggtgt 480
gtcaaagagt aaaaatgaag ggytttggag gaacggatct ctctgatccc ccttgcaccc 540
tcaggtttca ataatgatcc ttccgcaggt 570
Claims (10)
1.一种具有Cr(VI)耐性及还原能力的外生菌根真菌，分类命名为豆马勃属（Pisolithus sp.），于2018年2月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2018087，保藏地址：中国武汉武汉大学。
2.权利要求1中所述的保藏编号为CCTCC NO:M2018087的具有Cr(VI)耐性及还原能力的外生菌根真菌在去除铬污染土壤中六价铬中的应用。
3.权利要求1中所述的保藏编号为CCTCC NO:M2018087的具有Cr(VI)耐性及还原能力的外生菌根真菌在植物-微生物联合修复铬污染土壤中的应用。
4.一种植物-微生物联合修复铬污染土壤的方法，其特征在于，在铬污染土壤中植入接种了保藏编号为CCTCC NO:M2018087 的外生菌根真菌的木本植物，所述方法包括以下步骤：
S1：将经消毒的植物种子置于25℃培养箱中催芽，种子开始露白时播种到经灭菌的培养基质中；
S2：S1所述种子培育至长成幼苗后，截掉主根根尖，保留1.5~2.5cm主根，置于经活化的Pisolithus sp.菌块上，培养基质填满培养容器；
S3：S2所述幼苗培养至菌根化率高于70%的植株，植入铬污染土壤。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述木本植物为根系发达的木本植物。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述木本植物为松树、杨树或栗树。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述木本植物为日本黑松。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，S1所述培养基质为蛭石,所述灭菌条件为110~130℃高压灭菌90~150min。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，S2所述培养基质为体积比1:（0.5~1.5）的蛭石与火山灰。
10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，S3所述幼苗培养条件为温度20~25℃的阳光房内，培养时间为3~6个月。
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Families Citing this family (3)
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|---|---|---|---|---|
| CN110283736B (zh) * | 2019-03-22 | 2020-10-23 | 厦门大学 | 一株耐铬的石油烃降解菌Tph1-14及其应用 |
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Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1993000178A1 (en) * | 1991-06-21 | 1993-01-07 | Plant Research Laboratories | Use of metallic peroxides in bioremediation |
| CN1366060A (zh) * | 2001-12-07 | 2002-08-28 | 林忠平 | 利用工程微生物提高草坪草抗旱抗病性的方法 |
| JP2007045757A (ja) * | 2005-08-10 | 2007-02-22 | Takinou Filter Kk | 植栽資材 |
| CN103013850A (zh) * | 2012-09-21 | 2013-04-03 | 杭州高博环保科技有限公司 | 一株耐盐耐碱的Cr(VI)还原微生物及其筛选方法 |
| WO2014086753A2 (en) * | 2012-12-03 | 2014-06-12 | Bayer Cropscience Ag | Composition comprising biological control agents |
| CN104093829A (zh) * | 2011-12-16 | 2014-10-08 | 诺维信生物农业公司 | 慢生根瘤菌菌株 |
| CN106148239A (zh) * | 2016-08-25 | 2016-11-23 | 成都理工大学 | 对钒具有耐受性的深海微小杆菌及其用途 |
| CN107488674A (zh) * | 2017-08-17 | 2017-12-19 | 南京农业大学 | 一种可视化显示植物根系受Cd胁迫程度的生物传感器及传感方法 |
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Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1993000178A1 (en) * | 1991-06-21 | 1993-01-07 | Plant Research Laboratories | Use of metallic peroxides in bioremediation |
| CN1366060A (zh) * | 2001-12-07 | 2002-08-28 | 林忠平 | 利用工程微生物提高草坪草抗旱抗病性的方法 |
| JP2007045757A (ja) * | 2005-08-10 | 2007-02-22 | Takinou Filter Kk | 植栽資材 |
| CN104093829A (zh) * | 2011-12-16 | 2014-10-08 | 诺维信生物农业公司 | 慢生根瘤菌菌株 |
| CN103013850A (zh) * | 2012-09-21 | 2013-04-03 | 杭州高博环保科技有限公司 | 一株耐盐耐碱的Cr(VI)还原微生物及其筛选方法 |
| WO2014086753A2 (en) * | 2012-12-03 | 2014-06-12 | Bayer Cropscience Ag | Composition comprising biological control agents |
| CN106148239A (zh) * | 2016-08-25 | 2016-11-23 | 成都理工大学 | 对钒具有耐受性的深海微小杆菌及其用途 |
| CN107488674A (zh) * | 2017-08-17 | 2017-12-19 | 南京农业大学 | 一种可视化显示植物根系受Cd胁迫程度的生物传感器及传感方法 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| Detecting the heavy metal tolerance level in ectomycorrhizal fungi in vitro;Ray P等;《World journal of microbiology and biotechnology》;20050430;第21卷(第3期);第309-315页 * |
| Hydrogen ions and organic acids secreted by ectomycorrhizal fungi, pisolithus spl, are involved in the efficient removal of hexavalent chromium from waste water;Shi L等;《Ecotoxicology and environmental safety》;20181015(第161期);第430-436页 * |
| 外生菌根真菌Pisolithus spl对六价铬耐性、移除机制及联合日本黑松修复铬污染土壤的研究;史良;《中国博士学位论文全文数据库 基础科学辑》;20210215(第2期);A006-80 * |
| 我国蔬菜重金属污染现状与对策;李书幻等;《江苏农业科学》;20160913(第08期);第243-247页 * |
| 木本植物重金属毒害及抗性机理;陈岩松等;《福建林业科技》;20070325(第01期);第57-62页 * |
| 铬污染土壤的微生物修复技术研究进展;邓红艳等;《地球与环境》;20120915(第03期);第173-179页 * |
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| GR01 | Patent grant | ||
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Granted publication date: 20211221 |