CN110560469B - 一种利用耐铀镉真菌强化植物修复铀镉复合污染土壤的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用耐铀镉真菌强化植物修复铀镉复合污染土壤的方法。包括分离、筛选与鉴定耐铀镉真菌Fusariumsp.A‑2，以及采用耐铀镉真菌Fusariumsp.A‑2强化博落回修复铀镉复合污染土壤。耐铀镉真菌鉴定为镰刀菌属真菌，铀和镉对该菌的最小抑菌浓度为160 mg/L和160 mg/L。盆栽试验表明在修复铀镉复合污染的土壤中，接种耐铀镉真菌Fusariumsp.A‑2的博落回与未接种耐铀镉真菌的博落回相比，其生物量提高了181.17%，铀的富集量提高了100.00%，镉的富集量提高了109.09%。本发明为铀镉复合污染的土壤提供了一种成本低廉、操作简单、修复效果良好的方法。

Description

一种利用耐铀镉真菌强化植物修复铀镉复合污染土壤的方法

技术领域

本发明涉及铀镉复合污染土壤植物修复领域。具体是一种利用耐铀镉真菌强化植物修复铀镉复合污染土壤的方法。

背景技术

铀矿开采、铀水冶是导致土壤铀镉复合污染的重要途径。在某些铀矿开采区附近及某些铀污染场地，每千克土壤的铀含量高达几十至几百毫克，每千克土壤的镉含量也可达几十毫克。不仅如此，农业上磷肥施用是导致土壤铀镉复合污染的另一重要途径。铀镉污染土壤的修复既关系到核工业的可持续发展还关系到人类食品的安全，已经成为当前亟需解决的环境问题。

如何高效治理土壤铀镉复合污染，是人类面临的一大难题。与传统的物理化学修复技术相比，植物修复技术具有环境友好、不破坏土壤生态环境、成本低廉以及美观等优势。因此，治理土壤铀镉复合污染的植物修复技术受到了环境领域乃至农业领域众多研究者的青睐。放射性核素铀和重金属镉复合污染的环境效应比单一铀污染或单一镉污染的环境效应复杂，多数植物可能对单一金属具有较强耐受性，但当两种金属同时存在时植物就会受到重金属毒害，导致其生长受阻。所以如何增强植物对铀和镉的耐受性，保证植物的生长成为植物修复铀镉复合污染土壤的关键。耐铀镉真菌对铀镉复合污染的土壤具有更强的适应性，且耐铀镉真菌可通过络合土壤中的铀和镉降低它们对植物的毒害，还可通过分泌刺激植物生长的生长素(如赤霉素、吲哚乙酸等)促进植物生长。此外，耐铀镉真菌还可通过合成酶等活化土壤中的铀酰离子和镉离子，增强植物对其的富集，从而达到强化植物修复铀和镉的目的。

目前，国内外有从铀污染的水体和土壤中筛选出耐铀真菌如酵母菌、沙雷氏菌等，也有从镉污染土壤、废水和镉的超富集植物的组织中筛选出耐镉真菌如拟茎点霉菌、小丛壳菌、链霉菌等。然而，既耐铀又耐镉的真菌目前尚未见报道。因此，筛选出耐铀镉真菌不仅能够丰富微生物修复菌种库，同时将筛选出的耐铀镉真菌与植物修复共同运用到铀镉复合污染土壤的治理中，不仅能保证植物的正常生长，还能增强植物修复效果。此发明对铀镉复合污染土壤的治理具有重要的现实意义。

发明内容

针对上述问题，本发明旨在筛选与鉴定出耐铀镉的真菌，并提供一种利用耐铀镉真菌强化博落回修复铀镉复合污染土壤的方法，该方法具有成本低廉、修复效率高、处理步骤简便等优点。

为了达到上述目的，本发明的技术方案是：

(1)筛选与鉴定耐铀镉真菌Fusarium sp.A-2(保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国武汉，武汉大学；分类命名：镰刀菌A-2，Fusarium sp.A-2；保藏号CCTCCM 2019277，保藏日期2019-4-19)；

(2)采用耐铀镉真菌Fusarium sp.A-2强化博落回修复铀镉复合污染土壤。

筛选与鉴定耐铀镉真菌Fusarium sp.A-2，具体步骤如下：

步骤一，植物样品的采集，采集的植物为长期生长在我国南方某铀尾矿库区的博落回(Macleaya cordata(Willd.)R.Br)，其对铀镉均具一定耐受和富集能力。采集方式为随机连根带土挖起健康博落回植株，并抖落多余的土壤，将博落回根系装入黑色塑料袋后立刻带回实验室，用于真菌的分离；

步骤二，真菌的分离，将采集回的健康博落回植株的根系，用自来水和去离子水洗净表层土壤，晾干。将根切割成长5cm的根段，分别于体积分数为75％酒精和体积分数为0.2％升汞溶液中浸泡5min和2min，取出根段，用无菌水冲洗3次，随即用无菌纱布蘸干根段表面水分。挑取根段，切割成长为1cm的斜段，用镊子挑起接至孟加拉红培养基(RBM)上并将其置于生化培养箱28℃培养。取最后一次清洗根段的无菌水0.2mL涂布于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上，置于生化培养箱28℃培养，检测根段表面是否消毒彻底。每日观察，待组织切块面长出菌后及时采用尖端菌丝挑取法，将不同形态的菌落分别在RBM上连续转接2-3次，最后将分离纯化得到的真菌菌株转入装有RBM的三角瓶中，放入4℃冰箱中保存，备用；

步骤三，真菌铀镉耐受性测定，用天平称取1.792g六水硝酸铀酰(UO₂(NO₃)₂·6H₂O)和1.631g氯化镉(CdCl₂)，分别配置质量浓度为1g/L铀和1g/L镉母液，并用0.22μm滤膜对其过滤除菌。向灭菌的查氏培养基(CDA)中同时加入铀和镉母液，使CDA中铀的质量浓度为10、20、30、40、80和160mg/L，镉的质量浓度为5、10、20、40、80和160mg/L，以不添加铀和镉母液的CDA作为空白对照，共7个处理，每个处理2次重复。用打孔器(D＝4mm)从分离的真菌菌株的菌落边缘打取菌饼(用于打取菌饼的菌株均在不含铀和镉的CDA平板上培养了7d)，接种至上述不同处理的CDA平板上，并将CDA平板置于生化培养箱培养(28℃，15d)。每间隔2d，采用十字交叉法测量菌落直径，并采用最小抑菌浓度(MIC)来衡量菌株耐铀镉性能；

步骤四，耐铀镉真菌的鉴定，通过形态观察和分子鉴定来确定耐铀镉真菌的分类学地位。采用核糖体内转录间隔区序列ITS方法测序，并将所得ITS序列与已有的真菌序列进行相似性比对，绘制系统发育树。依据形态学特征和分子生物学分析，筛选出的耐性最强的真菌，鉴定为镰刀菌属真菌，命名为Fusarium sp.A-2，GenBank登录号为MH978624。

采用耐铀镉真菌Fusarium sp.A-2强化博落回修复铀镉复合污染的土壤，具体步骤如下：

步骤一，博落回种子的萌芽和消毒，博落回种子用1％的次氯酸钠溶液消毒30min，然后用去无菌水冲洗3-5遍，再将种子在常温无菌水中浸泡12h以打破种子的休眠，最后将种子滤出晾至半干后播种在灭菌的营养土中并于光照培养箱中28℃发芽2周，选择长势一致幼苗，将其根部浸泡在1％的次氯酸钠溶液中10min，取出用灭菌水清洗；

步骤二，菌丝悬液的制备，(1)孢子悬液制备：将培养7d的真菌Fusarium sp.A-2，用灭菌的棉签轻轻蘸取，洗入灭菌的1％吐温20溶液中，摇匀；(2)接种：每100mL的液体查氏培养基(CDM)中接种孢子悬液1mL并于摇床中28℃，160rpm培养7d；(3)真菌菌丝的收集：采用真空抽滤泵抽滤收集真菌菌丝并将收集到的菌丝再悬浮于无菌水中，即可获得接种所用的菌丝悬液；

步骤三，土壤的制备与接种，土培基质由粗沙和无污染校园土壤组成，将粗沙和土壤按1:2的比例(质量比)充分混合后于121℃、101kPa高压灭菌锅中灭菌2h。100mg/L的UO₂(NO₃)₂·6H₂O和50mg/LCdCl₂溶液分2次均匀添加灭菌基质中，将其搅拌均匀，最终使土壤铀和镉浓度为30mg/kg和20mg/kg干土，采用顶宽20cm，底宽15cm，高18cm，带底拖的花盆，每盆盛装灭菌土壤2.5kg。每周向盆中浇100mL菌丝悬液，搅拌均匀后用保鲜膜密封盆口，置于温室大棚中。待土壤平衡1个月后，将接种后的幼苗移栽到接种的含铀镉的土壤中；

步骤四，盆栽试验，博落回根部消毒后，将其根部浸泡在菌丝悬液中1h，然后，移栽至接种并平衡1个月的含铀和镉的土壤中，以不接种真菌的博落回和不接种真菌的含铀镉土壤作为空白对照。植物在白天温度为20～35℃，夜间温度为18～25℃，相对湿度为55％～90％，16/8h的光照(150mol/m²·s)的温室大棚中生长，120d后收割，测其鲜重和体内铀和镉含量；

步骤五，植物的处理，博落回分地上部分(土壤1cm以上)和地下部分采收，洗净黏附在博落回地上和地下部分表面的灰尘和泥土，然后将博落回的地上部分部和地下部分置于20mmol/L的Na₂-EDTA溶液中浸泡30min去除吸附在其表面的铀和镉，用吸水纸吸干水分并测定鲜重；将植物地上和地下部分在烘箱中105℃杀青30min，70℃烘48h，取出粉碎后移至马弗炉升温550℃灰化6h，称取0.2g灰分经盐酸-硝酸-高氯酸(体积比为3:1:2)消解后，用3％HNO₃定容至50mL容量瓶中，经0.22μm滤头过滤后采用电感耦合等离子体质谱仪测定铀和镉含量。

本发明提供了一种治理铀镉复合污染土壤的方法，以铀镉的富集植物博落回和耐铀镉真菌为材料，相比现有的技术方法，具有以下优势：

(1)在博落回接种耐铀镉真菌后植物生物量、铀镉富集量以及耐受铀镉性都明显提升，对治理铀镉复合污染土壤具有较好的效果；

(2)采用接种耐铀镉真菌后博落回进行铀镉复合污染土壤的修复，可将铀和镉大量固定在植物根部，减少铀和镉的迁移和扩散，避免了铀和镉对地下水的污染；

(3)采用接种耐铀镉真菌后博落回进行铀镉复合污染土壤的修复，既保证植物修复的效果，又保证了植物能在铀镉共同胁迫的环境下生长，美化了污染地区周边的环境。

附图说明

图1从博落回根部分离得到8株菌株在RBM培养基上的平板示意图，

图2耐铀镉真菌A-2形态特征图,a.菌株A-2在CDA培养基上正面菌落；b.菌株A-2在CDA培养基上反面菌落；c.菌丝；d.小型分生孢子；e.厚壁垣孢子；f.单瓶梗产孢；

图3耐铀镉真菌A-2系统发育树。

具体实施方式

下面将结合具体实施例和附图1、2和3对本发明作进一步的说明。

实施例

一种利用耐铀镉真菌强化博落回修复铀镉复合污染土壤的方法，其关键是先筛选出能够同时耐受铀和镉真菌菌株，而耐铀镉真菌筛选主要是从对铀镉具有较强富集能力的博落回根系中分离出真菌菌株，然后通过铀镉耐受性试验，筛选出耐铀镉性能最强的菌株，进行形态学观察和分子鉴定，最终将耐铀镉性最强菌株运用于铀镉复合污染土壤的修复。

本发明的进一步技术方案是：所述的真菌的分离的方法是：将生长于南方某铀尾矿库区的博落回随机连根挖起，抖落根部的土壤后，将健康博落回植株的根系立刻带回实验室，用自来水和去离子水洗净表层土壤，晾干。将根切割成长5cm的根段，分别于体积分数为75％酒精和体积分数为0.2％升汞溶液中浸泡5min和2min，取出根段，用无菌水冲洗3次，随即用无菌纱布蘸干根段表面水分。挑取根段，切割成长为1cm的斜段，用镊子挑起接至孟加拉红培养基(RBM)上并将其置于生化培养箱28℃培养。取最后一次清洗根段的无菌水0.2mL涂布于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上，置于生化培养箱28℃培养，检测根段表面是否消毒彻底。每日观察，待组织切块面长出菌后及时采用尖端菌丝挑取法，将不同形态的菌落分别在RBM上连续转接2-3次，最后将分离纯化得到真菌菌落转入装有RBM三角瓶中，放入4℃冰箱中保存，备用。

本发明的进一步技术方案是：所述的真菌耐铀镉性能的测试的方法是：用天平称取1.792g六水硝酸铀酰(UO₂(NO₃)₂·6H₂O)和1.631g氯化镉(CdCl₂)，分别配置质量浓度为1g/L铀和1g/L镉母液，并用0.22μm滤膜对其过滤除菌。向灭菌的查氏培养基(CDA)中同时加入铀和镉母液，使CDA中铀的质量浓度为10、20、30、40、80和160mg/L，镉的质量浓度为5、10、20、40、80和160mg/L，以不添加铀和镉母液的CDA作为空白对照，共7个处理，每个处理2次重复。用打孔器(D＝4mm)从分离的真菌菌株的菌落边缘打取菌饼(用于打取菌饼的菌株均在不含铀和镉的CDA平板上培养了7d)，接种至上述不同处理的CDA平板上，并将CDA平板置于生化培养箱培养(28℃，15d)。每间隔2d，采用十字交叉法测量菌落直径，并采用最小抑菌浓度(MIC)来衡量菌株耐铀镉性能。

本发明的进一步技术方案是：所述的耐铀镉真菌的鉴定的方法是：①形态鉴定，真菌于CDA平板上生长7d后，观察其菌落正反面的颜色，可溶性色素有无，并用显微镜观察菌株的菌丝、孢子、分生包子梗等的形态；②分子鉴定，筛选的菌株采用核糖体内转录间隔区序列(ITS)方法鉴定。接入1mL孢子悬液(孢子悬液制备：用灭菌棉棒轻轻蘸取真菌孢子，洗入1％吐温-20溶液中，摇匀)于100mL CDM培养基中，置于摇床中28℃，160rpm培养7d，用于基因组提取。以提取的DNA为模板，PCR扩增采用通用引物ITS1/ITS4进行(ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC)。PCR采用50μL反应体系:金牌Mix 25μL，ITS1(10μmol/L)2.0μL，ITS4(10μmol/L)2.0μL，DNA template 1.0μL，补足ddH₂O至50μL。PCR扩增条件：98℃2min；98℃10s，54℃10s，72℃10s，共35个循环；72℃5min。PCR扩增产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测后由上海美吉生物科技有限公司测序，所得ITS序列在NCBI在线数据库与已有的真菌序列进行BLAST序列相似性比对，使用MEGA4.1绘制系统发育树。

本实验分别检测了从博落回根部分离出的8株真菌菌株(实验室编号依次为A-1至A-8)(见附图1)，根据菌落直径得到以上8株真菌对铀镉的最小抑菌浓度(MIC)。8株真菌耐铀镉能力依次为A-2>A-3、A-4、A-8>A-1、A-6、A-7>A-5。由此可知，与其他菌株相比，A-2的耐铀镉能力较其他7株菌株强。铀和镉对A-2最小抑菌浓度为160mg/L和160mg/L。因此，挑选出A-2用于进一步的试验研究。

经形态观察，菌株A-2在CDA培养基上正面菌落凸起呈絮状，菌落粉白色；菌落反面淡黄色，随着时间增加，菌落颜色逐渐加深呈现黄棕色；菌丝为气生型，质密(附图2a、b、c)。光学显微镜下观察该菌可见小型分生孢子，呈椭圆形；厚壁垣孢子，球形，表面光滑，单个顶生或多个菌丝中间串生；单瓶梗产孢(附图2d、e、f)。在CDA培养基上培养时会产生淡黄色可溶性色素。这些形态特征与镰刀菌属的形态特征吻合。经分子鉴定：扩增A-2菌株的核糖体ITS序列并测序，得到1条529bp的序列。根据系统发育树可知，菌株A-2和Fusarium sp.T19聚在同一分枝上，且序列相似性为100％，从分子生物学的角度上表明两者属于同属真菌(附图3)。依据形态学特征和分子生物学分析，菌株A-2初步鉴定为镰刀菌属真菌，命名为Fusarium sp.A-2，GenBank登录号为MH978624。

一种利用耐铀镉真菌强化博落回修复铀镉复合污染土壤的方法，其将发芽两周的长势一致的博落回幼苗根部先消毒，然后浸泡在制备的Fusarium sp.A-2的菌丝悬液中1h，将接种了A-2菌丝悬液的博落回幼苗移栽到接种了A-2菌丝悬液的铀镉复合污染的土壤中，120天后收割植物，测其植物的干重和植物体内铀和镉的富集量。

本发明的进一步技术方案是：所述的博落回种子的发芽和消毒处理的方法是：博落回种子用1％的次氯酸钠溶液溶液消毒30min，然后用无菌水冲洗3-5遍，再将种子在常温无菌水中浸泡12h以打破种子的休眠，最后将种子滤出晾至半干后播种在灭菌的营养土中并于光照培养箱中28℃发芽2周，然后挑取长势一致的幼苗，根部经1％的次氯酸钠溶液(NaClO)溶液消毒10min，用无菌水冲洗。

所述的耐铀镉真菌A-2菌丝悬液的制备方法是：(1)孢子悬液制备：将培养7d的真菌，用灭菌的棉签轻轻蘸取，洗入灭菌的1％吐温-20溶液中，摇匀；(2)接种：每100mL的CDM中接种孢子悬液1mL并于摇床中28℃，160rpm培养5天；(3)A-2真菌菌丝的收集：采用真空抽滤泵抽滤收集A-2菌丝并将收集到的菌丝再悬浮于无菌水中，即可获得接种所用的菌丝悬液。

所述的博落回和土壤接种与幼苗移栽的方法是：将消毒后的博落回幼苗在无菌水中冲洗后，在制备好的A-2的菌丝悬液中浸泡1h。土培基质由粗沙和无污染校园土壤组成，将粗沙和土壤按质量比1:2充分混合后于121℃、101kPa高压灭菌锅中灭菌2h。将过滤灭菌的100mg/L的UO₂(NO₃)₂·6H₂O和50mg/LCdCl₂溶液分2次均匀添加灭菌基质中，将其搅拌均匀，最终使土壤铀和镉浓度为30mg/kg和20mg/kg干土。将其分装到顶宽20cm，底宽15cm，高18cm，带底拖的花盆，每盆盛装2.5kg土壤。每周向盆中浇100mL菌丝悬液，搅拌均匀后用保鲜膜密封盆口，置于温室大棚中。待土壤平衡1个月后，将接种后的幼苗移栽到接种的含铀镉的土壤中。

所述的收割植物的生物量和植物体内铀镉富集量测定的方法是：博落回分地上部分(土壤1cm以上)和地下部分采收，洗净黏附在博落回地上和地下部分表面的灰尘和泥土，然后将博落回的地上部分部和地下部分置于20mmol/L的Na₂-EDTA溶液中浸泡30min去除吸附在其表面的铀和镉，用吸水纸吸干水分并测定鲜重；将植物地上和地下部分在烘箱中105℃杀青30min，70℃烘48h，取出粉碎后移至马弗炉升温550℃灰化6h，称取0.2g灰分经盐酸-硝酸-高氯酸(体积比为3:1:2)消解后，用3％HNO₃定容至50mL容量瓶中，经0.22μm滤头过滤后采用电感耦合等离子体质谱仪测定铀和镉含量。

经检测，接种耐铀镉真菌A-2的博落回平均每株根部鲜重为8.70g，根部铀含量541.21mg/kg，根部镉含量689.57mg/kg，地上鲜重20.69g，地上部分铀含量为47.97mg/kg，地上部分镉含量为24.43mg/kg，平均每株植物可从铀镉复合污染的土壤中清除0.20mg铀，0.23mg镉。

经检测，未接种耐铀镉真菌A-2的博落回平均每株根部鲜重为6.20g，根部铀含量386.84mg/kg，根部镉含量478.30mg/kg，地上鲜重18.67g，地上部分铀含量为37.15mg/kg，地上部分镉含量为17.68mg/kg，平均每株植物可从铀镉复合污染的土壤中清除0.10mg铀，0.11mg镉。

由此可见，在修复铀镉复合污染的土壤中，接种耐铀镉真菌A-2博落回与未接种耐铀镉真菌的博落回相比，其生物量提高了181.17％，铀的富集量提高了100.00％，镉的富集量提高了109.09％。

以上仅仅是本发明的较佳实施方式，根据本发明的上述构思，本领域的熟练人员还可对此作出各种修改和变换。例如，变换铀镉的浓度、收割时间、植物栽培方式、菌种分离方法等以及用来修复其他重金属复合污染土壤等等。然而，类似的这种变换和修改均属于本发明的实质。

Claims (3)

1.一种利用耐铀镉真菌强化植物修复铀镉复合污染土壤的方法，包括（1）筛选与鉴定耐铀镉真菌Fusariumsp.A-2；（2）采用耐铀镉真菌Fusariumsp.A-2强化博落回修复铀镉复合污染土壤；其特征在于：

从对铀镉具有富集能力的博落回根部分离筛选出耐铀镉的真菌菌株，经铀镉耐受性试验，筛选出耐性最强的真菌进行鉴定为Fusariumsp.A-2，保藏号CCTCC M 2019277，并将耐铀镉性最强的菌株，接种至博落回根部和含铀和镉土壤中进行盆栽实验，待植物生长120 d后，收割，测其生物量和体内铀和镉含量；

步骤一，植物样品的采集，采集的植物为长期生长在铀尾矿库区的博落回，采集方式为连根带土挖起，将根系装入黑色塑料袋，带回；

步骤二，真菌的分离，将采集回的博落回植株的根系，用自来水和去离子水洗净表层土壤，将根切割成长5 cm的根段，分别于体积分数为75%酒精和体积分数为0.2%升汞溶液中浸泡5 min和2 min，取出根段，用无菌水冲洗3次，随用无菌纱布蘸干根段表面水分，挑取根段，切割成长为1 cm的斜段，用镊子挑起接至孟加拉红培养基上并将其置于生化培养箱28℃培养；取最后一次清洗根段的无菌水0.2 mL涂布于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，置于生化培养箱28 ℃培养，观察，待组织切块面长出菌后采用尖端菌丝挑取法，将不同形态的菌落分别在孟加拉红培养基上连续转接2-3次，最后将分离纯化得到的真菌菌株转入装有孟加拉红培养基的三角瓶中，放入4 ℃冰箱中保存；

步骤三，真菌铀镉耐受性测定，用天平称取1.792 g六水硝酸铀酰UO₂(NO₃)₂·6 H₂O和1.631 g氯化镉CdCl₂，分别配制质量浓度为1 g/L铀和1 g/L镉母液，并用0.22 μm滤膜对其过滤除菌，向灭菌的查氏培养基中同时加入铀和镉母液，使查氏培养基中铀的质量浓度为10、20、30、40、80和160 mg/L，镉的质量浓度为5、10、20、40、80和160 mg/L，以不添加铀和镉母液的查氏培养基作为空白对照，共7个处理，每个处理2次重复；

将步骤二的真菌菌株均在不含铀和镉的查氏培养基平板上培养7 d，用打孔器从真菌菌株的菌落边缘打取菌饼，接种至上述不同处理的查氏培养基平板上，并将查氏培养基平板置于生化培养箱培养28 ℃，15 d，每间隔2 d，采用十字交叉法测量菌落直径，采用最小抑菌浓度来衡量菌株耐铀镉性能；

步骤四，耐铀镉真菌的鉴定，通过形态观察和分子鉴定来确定耐铀镉真菌的分类学地位，采用核糖体内转录间隔区序列方法测序，并将所得ITS序列与已有的真菌序列进行相似性比对，绘制系统发育树，经过筛选与鉴定，对铀镉耐受性能最好的真菌为镰刀菌属真菌，命名为Fusariumsp.A-2，保藏号CCTCC M 2019277。

2.根据权利要求1所述的一种利用耐铀镉真菌强化植物修复铀镉复合污染土壤的方法，其特征在于，-采用耐铀镉真菌Fusariumsp.A-2强化博落回修复铀镉复合污染土壤，具体步骤如下：

步骤1，博落回种子的萌芽和消毒，博落回种子用1%的次氯酸钠溶液消毒30 min，然后用无菌水冲洗3-5遍，再将种子在常温无菌水中浸泡12 h，最后将种子滤出播种在土中并于光照培养箱中28 ℃发芽2周，选择长势一致幼苗，将其根部浸泡在1%的次氯酸钠溶液中10min，取出用灭菌水清洗；

步骤2，菌丝悬液的制备，（1）孢子悬液制备：蘸取培养7 d的真菌，洗入灭菌的1%吐温20溶液中，摇匀；（2）接种：每100 mL的液体查氏培养基中接种孢子悬液1 mL，培养7 d；（3）真菌菌丝的收集：采用真空抽滤泵抽滤收集真菌菌丝并将收集到的菌丝再悬浮于无菌水中，即获得接种所用的菌丝悬液；

步骤3，土培基质的制备与接种，土培基质由粗沙和土壤组成，粗沙和土壤质量比为1:2，土培基质灭菌，100 mg/L的UO₂(NO₃)₂·6H₂O和50 mg/LCdCl₂溶液分2次均匀添加灭菌土培基质中，最终使土培基质铀和镉浓度为30 mg/kg和20 mg/kg，采用花盆盛装灭菌土培基质2.5 kg，每周向盆中浇100 mL菌丝悬液；

步骤4，盆栽试验，博落回根部消毒后，将其根部浸泡在菌丝悬液中1 h，然后，移栽至接种并平衡了1个月的含铀和镉的土培基质中，以不接种真菌的博落回和不接种真菌的含铀镉土培基质作为空白对照，植物在白天温度为20～35 ℃，夜间温度为18～25 ℃，相对湿度为55%～90%，16/8 h的光照的温室大棚中生长，120 d后收割，测其鲜重和体内铀和镉含量；

步骤5，植物的处理，博落回分地上部分和地下部分采收，洗净黏附在博落回地上和地下部分表面的灰尘和泥土，然后将博落回的地上部分和地下部分置于20 mmol/L的Na₂-EDTA溶液中浸泡30 min去除吸附在其表面的铀和镉，用吸水纸吸干水分并测定鲜重；将植物地上和地下部分在烘箱中105 ℃杀青30 min，70 ℃烘48 h，取出粉碎后移至马弗炉升温550 ℃灰化6 h，称取0.2 g灰分经盐酸-硝酸-高氯酸消解后，用3% HNO₃定容至50 mL的容量瓶中，经0.22μm滤头过滤后采用电感耦合等离子体质谱仪测定铀和镉含量。

3.根据权利要求2所述的一种利用耐铀镉真菌强化植物修复铀镉复合污染土壤的方法，其特征在于，所述盐酸-硝酸-高氯酸体积比为3:1:2。

Images