CN112094760A

CN112094760A - 一株植物内生真菌土栖棘壳孢d2g24及其应用

Info

Publication number: CN112094760A
Application number: CN202011088441.3A
Authority: CN
Inventors: 李海燕; 汤雯婷; 高永涵; 李绍仕; 江悦娟; 毛文沁
Original assignee: Kunming University of Science and Technology
Current assignee: Kunming University of Science and Technology
Priority date: 2020-10-13
Filing date: 2020-10-13
Publication date: 2020-12-18
Anticipated expiration: 2040-10-13
Also published as: CN112094760B

Abstract

本发明公开了一株土栖棘壳孢(Setophoma terrestris)D2G24，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.20268；将该菌株运用于重金属铅、锌、镉的生物修复中；在重金属污染胁迫下，该菌株能够促进植物生长，促进植物对重金属的转移能力，对重金属镉和锌有较强的累积能力，适合大面积重金属镉、锌污染原位修复。

Description

一株植物内生真菌土栖棘壳孢D2G24及其应用

技术领域

本发明属于环境治理领域，具体涉及一株植物内生真菌土栖棘壳孢(Setophoma terrestris)D2G24及其在重金属铅、锌、镉污染的生物修复中的应用。

背景技术

随着经济的快速发展，越来越多的重金属例如生物毒性显著的重金属镉（Cd）、铅（Pb）、铬（Cr）、汞（Hg）及类金属砷（As）等被释放到环境中，致使国内环境质量发生严重恶化。土壤作为环境系统中最基本、最主要的组成部分，是人类生存不可或缺的重要资源，但由于自然因素及人类活动的双重作用，土壤重金属污染问题越来越严重。土壤中的重金属浓度过高还会阻碍植物根系的呼吸、难以从土壤中吸收水分和养分，从而影响植物的生长发育，使遭受重金属污染的区域无法进行农业应用，土壤和水中的重金属在植物生长发育过程中不断在植株中富集，会对植物产生显著的毒害作用，如植物生长量的降低、细胞膜损伤、产生氧化毒性等。

植物修复（phytoremediation）是由美国科学家Chaney首次提出，是指利用植物治理土壤重金属污染，它是将特定植物种植于重金属污染的土壤上，利用植物吸附、转移土壤中的重金属，再将植物进行处理后即可达到将重金属从土壤中去除进而净化土壤的目的。大多数植物修复中所选用的植物均为超累积植物（Hyperaccumulator），超累积植物因能超量吸收土壤中的重金属并能将其转移至植物中而在植物修复中占有极其重要的地位。例如，对含Zn量为444mg/kg的污染土壤进行修复，需要种植油菜八百多次、萝卜两千多次，而种植超累积植物Thlaspi caerulescens在理论上仅需14次。

植物内生菌（endophyte）指一类生活在健康植物组织内部而不引起植物组织明显症状改变的微生物。由于内生菌长期生活在植物组织内部，与宿主植物协同进化，植物为内生菌提供生长所需环境和营养物质，内生菌则通过代谢出众多的生物活性物质来促进宿主植物的生长发育，提高其对各种生物和非生物胁迫的抵抗能力，对于内生菌的研究主要集中于农业和医药业领域，而在修复污染环境方面的应用潜力则一直被忽视。随着根际细菌在环境污染修复领域展现出巨大的应用前景，越来越多研究者的目光开始向植物内生菌转移。

植物-内生菌联合修复技术可以通过内生菌来改善宿主植物的生理指标，促进植物生长发育，增加植物对污染环境的耐受性以及降解植物体内污染物，从而达到环境污染修复效果的一个非常具有前途的领域。如Rozpądek等从拟南芥（Arabidopsis arenosa）中分离得到一株内生毛霉属真菌，能显著增强宿主植物在重金属污染环境的生长，改变其对重金属Zn和Pb的累积能力。同样，Ren等研究发现，在重金属Cd胁迫条件下，接种内生菌后不仅可以增加宿主植物高羊茅（Lolium arundinaceum）的生物量，还能增强其对重金属Cd的耐受性，特别是促进植物对Cd从地下部分到地上部分的转运，从而提高了植物提取重金属的能力。

发明内容

本发明目的在于提供植物内生真菌土栖棘壳孢（Setophoma terrestris）D2G24，其于2020年9月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20268，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

本发明另一目的是提供上述植物内生真菌土栖棘壳孢D2G24的新用途，即将其应用在重金属铅、锌、镉污染的生物修复中，本发明提供的土栖棘壳孢D2G24有较强的重金属耐受性，且接种该内生真菌可以显著促进土荆芥在重金属胁迫条件下的生长，并增强植物对铅、锌、镉的积累；同时还发现混合接种D2G24与拟茎点霉（Phomopsis columnaris）FT2G7在重金属生物修复中效果更好。

为了实现以上目的，本发明采取以下技术措施：

A、采集重金属污染地矿渣区优势植物土荆芥的植物样品，于自来水下冲洗干净；

B、将植物样品分为根、茎、叶三部分分别进行表面消毒，首先用体积浓度75%的乙醇溶液浸泡3~5min，无菌水冲洗3~5次，再用有效氯浓度为5%的次氯酸钠溶液浸泡2~3min，无菌水冲洗3~5次，冲洗完后将其置于无菌滤纸上吸干水分；将根、茎、叶组织块剪成片段并贴于含有0.5g/L硫酸链霉素和0.5g/L青霉素的PDA培养基上培养，24~26℃培养40~50天，隔天观察，见组织块周围有菌落长出则挑取，分离纯化后获得内生真菌菌株，并将内生真菌菌株制成菌悬液；

C、将分离得到的内生菌株接种到PDA平板上，用无菌打孔器沿菌落边缘打下直径为4.4mm的菌块，再将该菌块接种到含Pb²⁺、Zn²⁺或Cd²⁺的PDA培养基上及不含重金属的PDA平板上，25℃培养，隔天测量菌落直径，每个样品3个重复；用菌株在重金属平板上的菌落直径除以该菌株在不含重金属平板上的菌落直径所得值来反应菌株对重金属的耐受性（耐受性指数，MTI），并将第6天的MTI值超过50%的菌株定义为重金属耐受菌株。

D、经过分离筛选后，将对重金属具有较强抗性的菌株保存于PDA斜面上备用，通过上述方法，将分离获得的丝状真菌命名为D2G24。

D、菌株D2G24的鉴定

D2G24形态学特征：初期菌落呈白色，近圆形，不透明，后期培养菌落呈紫色，菌落与培养基连接紧密；显微镜下观察产孢体为分生孢子盘，近圆形，由褐色的角胞组织构成，顶端不规则开列；孢细胞瓶形，无色透明，离生或在隔膜处合生，顶侧生于分生孢子梗；分生孢子单胞，圆柱形或椭圆形。

分子鉴定：采用试剂盒提取该菌株总DNA，经检测后送测序公司进行序列测定，将测序结果与NCBI上序列进行比对；

结合形态学特征和分子鉴定结果，最终将该菌株鉴定为土栖棘壳孢(Setophoma terrestris)；该菌株保存和活化所用培养基均为PDA培养基。

本发明从重金属污染地植物中分离得到的重金属耐受菌株内生真菌土栖棘壳孢D2G24，同时进行盆栽实验，探讨其对重金属铅、锌、镉污染土壤植物修复的影响，即进行了土栖棘壳孢D2G24单一接种及与另一株菌FT2G7混合接种对盆栽土荆芥生长及对重金属累积能力的影响研究，为环境重金属污染提供真菌菌种和理论研究依据，具有重要的理论和实际研究价值。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

（1）菌种土栖棘壳孢D2G24来源于重金属污染地区，对重金属铅、锌、镉有极强的耐受性，且通过简单液体发酵即可获得大量的菌丝体，菌体易获取，成本低廉，拥有商业化应用的潜能；

（2）菌株D2G24接种植物后，能够定植于植物体内，并且能对植物的生长产生影响，增强植物对重金属铅、锌、镉的累积量，尤其是对重金属镉的修复效果较为明显；

（3）菌种土栖棘壳孢D2G24与FT2G7混合使用对土荆芥的促生作用明显优于接种单一菌株的作用，能够提高植物的抗氧化能力、叶绿素含量等，接种混合菌株后，土荆芥更容易将重金属Zn从地上部分迁移至地上部分，更容易将Cd从土壤中转移至植株体内。

附图说明

图1为土栖棘壳孢D2G24（左）和拟茎点霉FT2G7（右）在PDA培养基上的菌落形态；

图2为接种土栖棘壳孢D2G24后对土荆芥谷胱甘肽含量的影响；图中T-GSH为总谷胱甘肽，GSH为谷胱甘肽，GSSH为氧化型谷胱甘肽。

图3为接种混合植物内生真菌后对土荆芥干重、地上干重、地下干重及株高、根长的影响结果；

图4为接种混合植物内生真菌后对土荆芥的MDA及叶绿素含量的影响结果；

图5为接种混合植物内生真菌后对土荆芥的谷胱甘肽含量的影响结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明的技术方案做进一步详细说明，但本发明并不局限于以下技术方案。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等加以实施。

实施例1：土栖棘壳孢D2G24的分离、筛选与鉴定

C、将分离得到的内生菌株接种到PDA平板上，用无菌打孔器沿菌落边缘打下直径为4.4mm的菌块，再将该菌块接种到含Pb²⁺（9.66mmol/L）、Zn²⁺（46.20mmol/L）或Cd²⁺（1mmol/L）的PDA培养基上（以Pb（NO₃）₂、ZnSO₄·7H₂O和CdSO₄·8H₂O分别配置得到）及不含重金属的PDA平板上，25℃培养，隔天测量菌落直径，每个样品3个重复；用菌株在重金属平板上的菌落直径除以该菌株在不含重金属平板上的菌落直径所得值来反应菌株对重金属的耐受性（耐受性指数，MTI），并将第6天的MTI值超过50%的菌株定义为重金属耐受菌株。

D、经过分离筛选后，将对重金属具有较强抗性的菌株保存于PDA斜面上备用；

通过上述方法，筛选得到一株耐铅、锌、镉的内生真菌，并将其命名为D2G24。

E、菌株D2G24的鉴定

D2G24形态学特征：初期菌落呈白色，近圆形，不透明，后期培养菌落呈紫色，菌落与培养基连接紧密；显微镜下观察产孢体为分生孢子盘，近圆形，由褐色的角胞组织构成，顶端不规则开列；孢细胞瓶形，无色透明，离生，或在隔膜处合生，顶侧生于分生孢子梗；分生孢子单胞，圆柱形或椭圆形（图1）。

分子鉴定：采用试剂盒提取该菌株总DNA，经检测后送测序公司进行序列测定，将测序结果与NCBI上序列进行Blast比对，其序列与土栖棘壳孢(Setophoma terrestris)同源性达99%，并结合该菌的形态学特征确定该菌株为土栖棘壳孢(Setophoma terrestris)。

实施例2：土栖棘壳孢D2G24对低浓度重金属累积的影响研究

本实施例旨证明本发明提供的丝状真菌D2G24在重金属污染中对植物生长及植物重金属污染修复中的促进作用；以土荆芥（Dysphania ambrosioides）为供试植物，实验过程如下：

A、土荆芥无菌苗的准备：土荆芥种子样品于2018年8月10日采于会泽县者海镇三多多村旁废弃矿渣堆（北纬26°28′17″，东经103°37′34″，海拔2273 m），4℃保存备用。随机挑选若干粒土荆芥种子，按下列程序进行表面消毒：首先在75%体积分数的乙醇溶液中浸泡3min、无菌水冲洗4次；然后在有效氯浓度为5%的NaClO溶液浸泡1min、用无菌水冲5次，将其置于无菌滤纸上吸干水分，备用。按加拿大水藓泥炭（Canadian sphagnum peat）: V珠岩（perlite）体积比为7:3的比例制备混合土壤，于121 ℃高压蒸汽灭菌15min，间歇灭菌三次，每次间隔24h，室温下冷却，均匀平铺于无菌平皿中（150× 20 mm）。将表面消毒后的种子均匀播撒于其中，置于光照培养箱中，25℃光照10h与18℃避光14h下交替培养。培养期间注意观察种子萌发情况，在萌发期间，每2天浇一次无菌水，以浇透土壤但无积水为准。待种子萌发后，每3天浇一次无菌水，每7天浇等量混合营养液，种子萌发45d后，选取长势一致的幼苗备用。

B、内生真菌接种剂和灭活剂的制备与接种：挑选之前保藏的纯净无污染的D2G24菌株接种到PDA培养基中活化，置于28℃隔水式恒温培养箱中培养7天，挑选长势良好且无污染的平板，挑取菌丝体接种到PDB培养基中，于28℃、130rpm 的恒温摇床中培养3-5 天，在无菌条件下，将等量菌丝体滤出，用无菌水冲洗2-3遍，避免菌丝体上沾有培养基，然后无菌剪刀剪碎，将剪碎后的菌丝转移至无菌水中制成菌悬液，加入无菌水定容至150mL，作为接种剂，对照组采用等量的无菌水。

C、盆栽实验：

①、制备重金属土壤

将加拿大泥炭藓（Canadian sphagnum peat）按照体积比7:3的比例与珍珠岩（perlite）混合并充分搅拌均匀，作为培养基质，以每盆100g分装，分别按600mg/kg Pb、800mg/kg Zn和10mg/kg Cd将PbCl₂、ZnCl₂、CdCl₂·2.5H₂O加入到其中两组的每盆混合土壤中，最终制成含691.96mg/kg Pb、1028.08mg/kg Zn和11.696mg/kg Cd混合重金属土壤，平衡15天后，用于复合重金属胁迫盆栽实验。所有土壤经121℃下高压蒸汽灭菌15min，间歇灭菌三次，每次间隔24h，而后放在室温下充分冷却，备用。选取若干长势一致的土荆芥幼苗，移栽至各组土壤中，每盆移栽一株，将移栽后的土荆芥幼苗，将移栽好的盆栽植物随机分成2组（Group 1和Group 2），每组20个重复。

②、将上述的菌悬液及无菌水分别接种到Group 1（实验组）和Group 2（对照组）茎、叶及根部，每株接种3mL，每个部位1mL，分别在移栽后的第10天、第17天、第27天、第37天进行接种处理，共接种4次，将苗放在室温下（18-25℃）自然光照培养，培养期间每3天浇一次无菌水或混合营养液（交替进行），每盆浇灌100mL（以水浇透土壤而又不溢出盆底部为宜），实验过程中密切观察各组土荆芥苗的生长状况，46d后收获，并测定植物和土壤中的总镉、总铅、总锌的含量，并计算

（1）生物累积系数（BAF）根据Wilkins所描述的公式进行计算：

；

（2）转运系数（TF）：根据Khan所描述的公式进行计算：

；

如表1、表2所示，在重金属累积方面，接种D2G24，实验组中土壤中Pb、Zn、Cd含量显著低于对照组（p<0.05, t检验），且实验证明了本发明所提供的菌株D2G24可促进植物对重金属镉的富集，达到对镉污染土壤进行修复的目的；实验组中重金属Pb和Cd的转运系数高于对照组，但Zn的转运系数却低于对照组，不同重金属的TF值表现为：Zn>Cd>Pb。此外，实验组中植物地上部分重金属Zn和Cd的生物累积系数高于对照组，但重金属Pb却低于对照组，具体的BAF表现为：Cd>Zn>Pb；实验组中植物地下部分重金属Pb和Cd的生物累积系数高于对照组，但重金属Zn却低于对照组，其具体的BAF值表现为：Cd>Zn>Pb，此现象与重金属累积现象一致。

表1 菌株D2G24对土荆芥在低浓度重金属胁迫下重金属富集的影响

表2不同浓度混合重金属胁迫下接种单一菌株的重金属转移系数和累积系数

。

实施例3：土栖棘壳孢D2G24对土荆芥生长的影响

实验过程和技术方法同实施例2，所不同的是在土荆芥生长期间，增加了土荆芥苗生物量的测定；于土荆芥苗移栽第46天收割土荆芥苗，测定株高、根长、干重、MDA、叶绿素、谷胱甘肽GSH等；GSH=T-GSH-2GSSG计算GSH含量；

盆栽实验结果如表3和图2所示，接种土栖棘壳孢D2G24对重金属胁迫下土荆芥生长有显著的促进作用；与对照组相比，接种D2G24的处理组分别提高了土荆芥的株高、根长和干重含量，株高、T-GSH（总谷胱甘肽）、GSH（谷胱甘肽）、GSSH（氧化型谷胱甘肽）和MDA（丙二醛）含量在实验组和对照组间产生了显著性差异（p<0.05，t检验）。

表3：土栖棘壳孢D2G24对重金属胁迫下土荆芥生长的影响

。

实施列4：混合接种土栖棘壳孢D2G24和拟茎点霉FT2G7对重金属累积的影响研究

实验过程和技术方法同实施例2，所不同的是菌悬液的接种即：将上述处理好的含重金属的土壤随机分为2组，每组各20盆，组一接种体积比为1:1的D2G24和FT2G7菌悬液，组二接种菌悬液的灭活物作为对照。

在重金属累积方面（表4），实验组土壤中重金属Pb和Cd的含量高于对照组，但重金属Zn的含量却低于对照组。此外，相比于对照组，实验组的转移系数在重金属Pb和Cd水平上呈增高状态，但在重金属Zn水平上却呈降低状态，不同重金属间TF值的呈现规律为：Zn>Cd>Pb；实验组地上部分的重金属累积系数在重金属Pb、Zn和Cd水平上均呈现增高状态，地下部分的重金属累积系数在重金属Pb水平均呈现降低状态，而在Zn和Cd水平上呈增高状态（表5），且不管是植物地上部分还是地下部分，不同重金属间BAF值的呈现规律为：Cd>Zn>Pb。

表4：混合重金属胁迫下接种混合菌株对土荆芥和土壤重金属富集情况的影响

表5：混合重金属胁迫下混合菌株的土荆芥重金属转移系数和累积系数

。

实施例5：混合接种土栖棘壳孢D2G24和拟茎点霉FT2G7对土荆芥生长的影响

实验过程和技术方法同实施例4，所不同的是在土荆芥生长期间，增加了土荆芥苗生物量的测定；即在土荆芥苗移栽第16、26、36、46天测定对照组和处理组植物的叶绿素含量；于土荆芥苗移栽第46天收割土荆芥苗，测定株高、根长、干重、MDA、GSH等生物量。

盆栽实验结果图3、4、5所示，两种内生菌混合接种促进了土荆芥的生长发育，相比于对照组，实验组的株高、干重、地上干重、地下干重、叶绿素、T-GSH、GSH分别均有提高；实验组MDA含量相比于对照组降低了50%；除了根长和地下干重外，其他指标在实验组和对照组中均产生了显著性差异(p<0.05，t检验)。

Claims

1.一株植物内生真菌土栖棘壳孢（Setophoma terrestris）D2G24，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.20268。

2.权利要求1所述的植物内生真菌土栖棘壳孢D2G24在重金属铅、锌、镉污染的生物修复中的应用。

3.权利要求1所述的植物内生真菌土栖棘壳孢D2G24与拟茎点霉（Phomopsis columnaris）FT2G7在重金属铅、锌、镉污染的生物修复中的应用。