CN105176871A - 一种高纯度无致病力的青枯雷尔氏菌菌株 - Google Patents
一种高纯度无致病力的青枯雷尔氏菌菌株 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105176871A CN105176871A CN201510589990.1A CN201510589990A CN105176871A CN 105176871 A CN105176871 A CN 105176871A CN 201510589990 A CN201510589990 A CN 201510589990A CN 105176871 A CN105176871 A CN 105176871A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- bacterial strain
- fjat
- ars01
- ralstonia solanacearum
- purity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000589771 Ralstonia solanacearum Species 0.000 title claims abstract description 44
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 103
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 6
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 abstract 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 39
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 33
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 24
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 21
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 20
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 19
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 12
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 206010025482 malaise Diseases 0.000 description 8
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 8
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 7
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 7
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 description 6
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 6
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 6
- 101150009166 pehA gene Proteins 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 239000002420 orchard Substances 0.000 description 4
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 4
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 3
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 3
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 239000002223 garnet Substances 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- MSQACBWWAIBWIC-UHFFFAOYSA-N hydron;piperazine;chloride Chemical compound Cl.C1CNCCN1 MSQACBWWAIBWIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQYVRQLZKVEZGA-UHFFFAOYSA-N hypochlorite Chemical compound Cl[O-] WQYVRQLZKVEZGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000012901 Milli-Q water Substances 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 230000000274 adsorptive effect Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 108010079058 casein hydrolysate Proteins 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 239000000645 desinfectant Substances 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
Abstract
本发明提供一种高纯度无致病力的青枯雷尔氏菌菌株FJAT-aRS01(Ralstonia？solanacearum)，于2015年04月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC？No.10693。该菌株FJAT-aRS01纯度高、且生物学性状稳定，能够有效防治作物青枯病，为有效地研发青枯病植物疫苗来预防作物青枯病害发生提供了可能。
Description
【技术领域】
本发明属于生物领域，具体涉及一种高纯度无致病力的青枯雷尔氏菌菌株。
【背景技术】
作物青枯病是由青枯雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)引起的毁灭性土传病害，防治困难。利用无致病力青枯雷尔氏菌研发青枯病植物疫苗来预防作物青枯病具有良好的应用前景。在植株苗期接种病原弱株系----无致病力青枯雷尔氏菌，经侵入、定殖，在植株体内与致病菌形成营养和位点竞争，构建植株体内微生态平衡，诱导植株产生抗病能力，从而阻止病原菌的漫延，抑制病害发生。
青枯雷尔氏菌在自然状态下菌株致病力分化严重，出现不同致病力菌株混杂现象，经继代培养和回接植株也经常会出现菌株致病力分化现象；青枯雷尔氏菌这种特性使得利用其病原弱株系作为植物疫苗在生产上应用存在很大风险。菌株纯度高、生物学性状稳定是其作为细菌类疫苗优良菌种应具备的重要条件；传统的细菌分离技术很难分离纯化青枯雷尔氏菌，获得高纯度的菌株。不同致病力青枯雷尔氏菌细胞表面组分不同，所带电荷也不同，其与离子交换树脂的吸附能力不同，而目前尚未见到如下的相关报道：利用细菌色谱系统可实现青枯雷尔氏菌菌株的纯化分离，以获得高纯度无致病力的青枯雷尔氏菌菌株。
【发明内容】
本发明所要解决的技术问题在于提供一种高纯度无致病力的青枯雷尔氏菌菌株FJAT-aRS01(Ralstoniasolanacearum)，于2015年04月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.10693。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：
本实验室在色谱柱饱和吸附范围内，将从番茄青枯病发病田块的健康植株中分离到的一株无致病力的青枯雷尔氏菌FJAT-1957进行细菌色谱纯化，得到3个不同的色谱峰，收集其中主峰(出峰时间为1.1min)的洗脱液，并将该洗脱液梯度稀释后涂布于TTC培养基，且于30℃培养2d，培养获得的菌株进行理化特性与分子学鉴定，最终确定其为青枯雷尔氏菌菌属的一个菌株。
本发明的有益效果在于：提供一种青枯雷尔氏菌菌株FJAT-aRS01(Ralstoniasolanacearum)，该菌株纯度高、且生物学性状稳定，能够有效防治作物青枯病，为有效地研发青枯病植物疫苗来预防作物青枯病害发生提供了可能。
【附图说明】
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。
图1是本发明实施例2与实施例5中PCR产物的1.5％琼脂糖凝胶电泳图。
图2是本发明实施例4中的细菌色谱图。
图3是本发明实施例7中的细菌色谱图。
【具体实施方式】
本发明中青枯雷尔氏菌菌株FJAT-aRS01(Ralstoniasolanacearum)是从番茄青枯病发病田块的健康植株中分离到的一株无致病力的青枯雷尔氏菌FJAT-1957(Ralstoniasolanacearum)经细菌色谱纯化收集到的主峰洗脱液进行梯度稀释后涂布培养得到的菌株；通过对该菌株进行致病性鉴定及继代培养与纯度检测则证明其为高纯度的无致病力菌株。
为了对本发明进行详细阐述说明，申请人给出了如下具体实施例。
实施例1菌株FJAT-1957的分离
(1)从福建省福鼎市蕉宕村绿禾成盛有限公司番茄种植大棚青枯病发病田块健康植株中称取番茄茎部5g并用清水冲洗干净，且将冲洗后的番茄茎部剪成小块组织；接着在无菌操作条件下，将小块组织依次采用75％酒精处理30s、10％次氯酸钠消毒8min、无菌水漂洗3遍；之后采用榨汁机将小块组织打碎以获得组织液，然后吸取1mL组织液进行梯度稀释，选用稀释度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7；
(2)取步骤(1)获得的稀释液200μL涂布于TTC平板上，然后将TTC平板置于30℃下培养2d；
(3)将步骤(2)培养获得的菌株重新划线接种于TTC培养基上，并将TTC培养基置于30℃条件下培养48h，将培养获得的菌株命名为菌株FJAT-1957。
实施例2菌株FJAT-1957的鉴定：
初步鉴定：
将所获得菌株FJAT-1957的菌落置于LeicaM165FC高级电动荧光体视显微镜下进行镜检观察，观察结果显示，菌株FJAT-1957的菌落形态为表面较干燥，无流动性，中间为暗红色，且白边较窄的菌株，因此，可初步认定菌株FJAT-1957属于青枯雷尔氏菌菌属。
进一步鉴定：
菌株FJAT-1957的活化：用接种环将所获得菌株FJAT-1957划线于TTC培养基上，并将TTC培养基置于恒温培养箱中培养48h，培养温度为30℃；得菌株FJAT-1957的单菌落；
制备种子液：将所获得的菌株FJAT-1957的单菌落接种于20mL的SPA液体培养基中，并将其置于恒温振荡摇床中培养24h，恒温振荡摇床的温度设定30℃、转速设定170rpm/min；得种子液；
基因组DNA的提取：取所得的种子液1mL于已灭菌的1.5mL离心管中，并按照Promega试剂盒说明书操作以提取菌株FJAT-1957的基因组DNA；
PCR鉴定：委托生物工程(上海)有限公司利用DNA合成仪合成正向引物pehA#6(如SEQIDNO：1所示)：5'-ATCGGACTTGATGCGCAGGCCGTT-3'；反向引物pehA#3(如SEQIDNO：2所示)：5'-CAGCAGAACCCGCGCCTGATCCAG-3'。
以提取所获得的菌株FJAT-1957的基因组DNA为模板，且以上述引物(pehA#6/pehA#3)为引物对进行PCR反应，并以现有公认的青枯雷尔氏菌标准菌株GMI1000为阳性对照：
PCR反应体系(25μL)：10×Buffer2.5μL，10mmol/LdNTPs0.5μL，dH2O18.7μL，10mmol/L正向引物1μL，10mmol/L反向引物1μL，2.5UTaq酶，25ngDNA模板；
PCR反应程序为：96℃预变性1min；接着96℃变性30s，70℃退火30s，72℃复性1min，重复2个循环；然后94℃变性30s、70℃退火30s、72℃复性1min，重复33个循环；最后72℃下延伸5min。
PCR产物的检测：将PCR产物点样于1.5％的琼脂糖凝胶，以100bpDNALadderMarker作为标准分子量，80V电压、1倍TAE缓冲液中电泳1h，EB染色，即进行凝胶电泳分离检验，电泳分离检验结果如图1(图1中，M为DNAladder；1为菌株FJAT-1957；CK+为阳性对照GMI1000；CK-为双蒸水空白对照)所示，由图1可知，菌株FJAT-1957同标准菌株GMI1000一样，均在504bp位置扩增出单一条带，即确认该菌株FJAT-1957与标准菌株GMI1000同属于同一菌属。
依据上述的鉴定，最终确认菌株FJAT-1957属于青枯雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)菌属的一个菌株。
上述青枯雷尔氏菌菌株FJAT-1957(Ralstoniasolanacearum)于2015年07月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.11058。
实施例3菌株FJAT-1957的致病性试验
设置实验组、阴性对照组和阳性对照组，在实验组中，菌株FJAT-1957经TTC平板活化后，接种于SPA液体培养基中，于170r/min、30℃下培养48h，将培养所得菌液稀释至108cfu/mL，接着将菌液稀释液伤根接种于5-6叶龄的番茄盆栽苗上(每盆种植1株番茄苗)，接种量为80mL/株，共接种番茄苗30株；而阴性对照组以清水代替菌株FJAT-aRS01的菌液稀释液；阳性对照组以现有公认的青枯雷尔氏菌标准菌株GMI1000的菌液稀释液代替菌株FJAT-1957的菌液稀释液；之后将各组处理后的番茄苗放置于光照培养箱中培养(每天光培养12h、暗培养12h，温度30±2℃，相对湿度95％)，每天统计各组中番茄苗的死亡率，共观察10d。
实验结果如下表1所示，阳性对照组在伤根接种第4d植株开始发病，接种7d后发病率达到100％，植株萎蔫，死亡；实验组伤根接种后，在观察期(10d)植株不发病；阴性对照组在观察期内植株均不发病；因此，通过试验表明，菌株FJAT-1957为无致病力的菌株。
表1各处理组番茄苗发病情况
实施例4菌株FJAT-1957的细菌色谱纯化及高纯度菌株FJAT-aRS01的获得
(1)将菌株FJAT-1957置于TTC平板上活化后，之后转接于SPA液体培养基中，并于30℃，200r/min下摇床培养24h；将摇床培养所得菌液于5000r/min、4℃下离心10min，去上清液，沉淀物用超纯水洗涤2次后，再经过2000r/min离心2min，获得菌体浓度比较均一的青枯雷尔氏菌色谱分析样品；
(2)将获得的青枯雷尔氏菌色谱分析样品进入色谱分离系统，进液量为20μL，ToyopearlTskgelSuperQ-650C填充色谱柱，流速1mL/min，泵压的范围为0.5-1.5MPa，温度范围为23-28℃；
(3)样品上样后，0-5min用A液(0.02mol/L盐酸哌嗪，pH8.0)平衡，使样品充分吸附到树脂上；5-35min线性梯度洗脱，洗脱梯度为0％-75％NaCl(1mol/L)，A液由100％转换为25％，B液(0.02mol/L哌嗪盐酸+1mol/LNaCl，pH8.0)由0％转换为75％；35-45minB液转换为100％，将树脂上的残余细菌全部洗出；
(4)样品经上述洗脱后，采用紫外检测器检测样品的出峰情况，检测波长为260nm。
(5)样品洗脱后经紫外检测所得色谱图如图2所示，由图2可知，出现了3个不同色谱峰，分别为主峰P1、次峰P2和次峰P3；将主峰P1的洗脱液进行回收，并进行系列梯度稀释后涂布于TTC平板，于30℃下培养2d，挑取平板上的单菌落进行纯化培养，为了方便描述，将纯化培养所得的菌株命名为菌株FJAT-aRS01，且于20％甘油、-80℃下保存。
实施例5该菌株FJAT-aRS01的鉴定
形态学的鉴定：
对菌株FJAT-aRS01的主要形态进行鉴定，得到该菌株FJAT-aRS01的主要形态如下：菌落为圆形，无流动性，中间为暗红色，白边窄，菌落表面干燥。
分子学的鉴定：
a、菌株活化：用接种环将菌株FJAT-aRS01划线于TTC培养基上，并将TTC培养基置于恒温培养箱中培养48-72h，培养温度为30℃；
b、制备种子液：将步骤a所获得的菌株FJAT-aRS01的单菌落接种于20mL的SPA培养基中，并将其置于恒温振荡摇床中培养24h，恒温振荡摇床的温度设定30℃、转速设定170rpm/min，得种子液；
c、基因组DNA的提取：取种子液1mL于已灭菌的1.5mL离心管中，并按照Promega试剂盒说明书操作以提取菌株FJAT-aRS01的基因组DNA；
d、PCR鉴定：以提取所获得的菌株FJAT-aRS01的基因组DNA为模板，且以上述实施例2中的引物(pehA#6/pehA#3)为引物对进行PCR反应，并以现有公认的青枯雷尔氏菌标准菌株GMI1000为阳性对照：
PCR反应体系(25μL)：10×Buffer2.5μL，10mmol/LdNTPs0.5μL，dH2O18.7μL，10mmol/L正向引物1μL，10mmol/L反向引物1μL，2.5UTaq酶，25ngDNA模板；
PCR反应程序为：96℃预变性1min；接着96℃变性30s，70℃退火30s，72℃复性1min，重复2个循环；然后94℃变性30s、70℃退火30s、72℃复性1min，重复33个循环；最后72℃下延伸5min。
PCR产物的检测：将PCR产物点样于1.5％的琼脂糖凝胶，以100bpDNALadderMarker作为标准分子量，80V电压、1倍TAE缓冲液中电泳1h，EB染色，即进行凝胶电泳分离检验，电泳分离检验结果与实施例2的一致，即如1所示，则确认该菌株FJAT-aRS01同样与标准菌株GMI1000同属于同一菌属。
依据上述的鉴定，最终确认菌株FJAT-aRS01属于青枯雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)菌属的一个菌株。
实施例6该菌株FJAT-aRS01的致病性试验
设置实验组、阴性对照组和阳性对照组，在实验组中，菌株FJAT-aRS01经TTC平板活化后，接种于SPA液体培养基中，于170r/min、30℃下培养48h，将培养所得菌液稀释至108cfu/mL，接着将菌液稀释液伤根接种于5-6叶龄的番茄盆栽苗上(每盆种植1株番茄苗)，接种量为80mL/株，共接种番茄苗30株；而阴性对照组以清水代替菌株FJAT-aRS01的菌液稀释液；阳性对照组以现有公认的青枯雷尔氏菌标准菌株GMI1000的菌液稀释液代替菌株FJAT-aRS01的菌液稀释液；之后将各组处理后的番茄苗放置于光照培养箱中培养(每天光培养12h、暗培养12h，温度30±2℃，相对湿度95％)，每天统计各组中番茄苗的死亡率，共观察10d。
实验结果与实施例3的一致，即如上表1所示，阳性对照组在伤根接种第4d植株开始发病，接种7d后发病率达到100％，植株萎蔫，死亡；实验组伤根接种后，在观察期(10d)植株不发病；阴性对照组在观察期内植株均不发病；因此，通过试验表明，本发明菌株FJAT-aRS01为无致病力的菌株。
实施例7该菌株FJAT-aRS01的继代培养和纯度检测
(1)菌株FJAT-aRS01的继代培养：将菌株FJAT-aRS01划线于TTC培养基上，置于30℃恒温培养箱中培养48-72h，挑取单菌落转接于另一TTC培养基上，共继代培养至30代；
(2)菌株FJAT-aRS01的纯度检测：利用细菌色谱分离菌株FJAT-aRS01继代培养至30代所得的纯培养物，具体操作参照“实施例4该菌株FJAT-aRS01的细菌色谱纯化”，其所得的色谱图如图3所示。
由图3可知，该菌株FJAT-aRS01继代培养30代后的纯培养物经细菌色谱分离出单一峰P1，从而说明该菌株FJAT-aRS01为纯的菌株；即结合实施例5与实施例6的检测结果，表明该菌株FJAT-aRS01为一株纯的无致病力菌株。
实施例8该菌株FJAT-aRS01的防效试验
将菌株FJAT-aRS01经TTC平板活化后，接种于SPA液体培养基中，于170r/min、30℃下培养48h，将培养所得菌液稀释至108cfu/mL，得菌株FJAT-aRS01的菌液稀释液，待用；将现有公认的青枯雷尔氏菌标准菌株GMI1000进行同样操作制备得菌株GMI1000的菌液稀释液，待用；
设置实验组和阳性对照组，在实验组中，将菌株FJAT-aRS01的菌液稀释液伤根接种于5-6叶龄的番茄盆栽苗上，3d后再接种菌株GMI1000的菌液稀释液，两次接种的接种量均为80mL/株，共接种30盆；阳性对照组以清水代替菌株FJAT-aRS01的菌液稀释液，即将清水伤根接种于5-6叶龄的番茄盆栽苗上，3d后再接种菌株GMI1000的菌液稀释液；将接种后的番茄苗放置于光照培养箱(每天光培养12h、暗培养12h，温度30±2℃，相对湿度95％)，每天观察番茄植株的发病情况，观察期为21天，统计处理番茄植株的发病率和防效。
发病率＝(发病株数/接种株数)×100％
防效＝[(对照组发病率-实验组发病率)/对照组发病率]×100％
试验结果如表2所示，阳性对照组在接种菌株GMI1000的菌液稀释液的第4d植株开始发病，番茄植株出现萎蔫症状，并随时间推移日益严重，至第7d发病率达100％；而先接种菌株FJAT-aRS01的菌液稀释液、3d后再接种菌株GMI1000的菌液稀释液处理的实验组番茄植株在接种菌株GMI1000的菌液稀释液后21天观察期内均未发病。统计对照组发病率达100％时，实验组的发病率为0，则防效为100％。
表2实验组和对照组番茄发病情况
需要说明的是，在本发明中，TTC平板与TTC培养基的组分均为：10g蛋白胨、1g水解酪蛋白、5g葡萄糖、18g琼脂和0.05g2,3,5-氯化三苯基四氮唑，用蒸馏水定容至1L；SPA液体培养基的组分为：20g蔗糖、5g蛋白胨、0.5gKH2PO4和0.025gMgSO4，用蒸馏水定容至1L。
综上，本发明提供一种青枯雷尔氏菌菌株FJAT-aRS01(Ralstoniasolanacearum)，该菌株纯度高、且生物学性状稳定，能够有效防治作物青枯病，为有效地研发青枯病植物疫苗来预防作物青枯病害发生提供了可能。
Claims (1)
1.一种高纯度无致病力的青枯雷尔氏菌菌株，其特征在于：所述菌株为青枯雷尔氏菌菌株FJAT-aRS01(Ralstoniasolanacearum)，于2015年04月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.10693。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510589990.1A CN105176871B (zh) | 2015-09-17 | 2015-09-17 | 一种高纯度无致病力的青枯雷尔氏菌菌株 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510589990.1A CN105176871B (zh) | 2015-09-17 | 2015-09-17 | 一种高纯度无致病力的青枯雷尔氏菌菌株 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105176871A true CN105176871A (zh) | 2015-12-23 |
| CN105176871B CN105176871B (zh) | 2019-01-18 |
Family
ID=54899305
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510589990.1A Active CN105176871B (zh) | 2015-09-17 | 2015-09-17 | 一种高纯度无致病力的青枯雷尔氏菌菌株 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105176871B (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106834173A (zh) * | 2017-01-23 | 2017-06-13 | 北京市农林科学院 | 一株生物发光的青枯雷尔氏菌 |
| CN106939291A (zh) * | 2017-03-21 | 2017-07-11 | 福建省农业科学院农业生物资源研究所 | 一种青枯雷尔氏菌菌株 |
| CN112300975A (zh) * | 2020-09-29 | 2021-02-02 | 广州中医药大学(广州中医药研究院) | 一株广藿香青枯病菌的低致病力突变株及其应用 |
| CN113502250A (zh) * | 2021-08-02 | 2021-10-15 | 云南省烟草农业科学研究院 | 一种雷尔氏菌菌株及应用、获取和防效评价方法 |
| CN117417844A (zh) * | 2023-05-11 | 2024-01-19 | 福建省农业科学院资源环境与土壤肥料研究所 | 一种用于土传青枯病微生态调控的复合益生菌剂及其应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102373170A (zh) * | 2011-10-28 | 2012-03-14 | 福建省农业科学院农业生物资源研究所 | 一种青枯雷尔氏菌菌株 |
-
2015
- 2015-09-17 CN CN201510589990.1A patent/CN105176871B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102373170A (zh) * | 2011-10-28 | 2012-03-14 | 福建省农业科学院农业生物资源研究所 | 一种青枯雷尔氏菌菌株 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| XUEFANG ZHENG等: "Rapid differentiation of Ralstonia solanacearum avirulent and virulent strains by cell fractioning of an isolate using high performance liquid chromatography", 《MICROBIAL PATHOGENESIS》 * |
| 林娟等: "应用高效离子交换色谱分析青枯菌的致病力分化", 《应用与环境生物学报》 * |
| 林娟等: "应用高效离子交换色谱快速分离定量不同致病力的青枯菌", 《色谱》 * |
| 林娟等: "青枯雷尔氏菌HPLC分析中色谱分离条件的研究", 《福州大学学报( 自然科学版)》 * |
| 郑雪芳等: "无致病力青枯雷尔氏菌突变菌株的构建及其防效评价", 《植物病理学研究进展——中国植物病理学会第十二届前年学术研讨会论文选编》 * |
| 郑雪芳等: "青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株的构建及其防效评价模型分析", 《植物病理学报》 * |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106834173A (zh) * | 2017-01-23 | 2017-06-13 | 北京市农林科学院 | 一株生物发光的青枯雷尔氏菌 |
| CN106939291A (zh) * | 2017-03-21 | 2017-07-11 | 福建省农业科学院农业生物资源研究所 | 一种青枯雷尔氏菌菌株 |
| CN112300975A (zh) * | 2020-09-29 | 2021-02-02 | 广州中医药大学(广州中医药研究院) | 一株广藿香青枯病菌的低致病力突变株及其应用 |
| CN112300975B (zh) * | 2020-09-29 | 2022-06-14 | 广州中医药大学(广州中医药研究院) | 一株广藿香青枯病菌的低致病力突变株及其应用 |
| CN113502250A (zh) * | 2021-08-02 | 2021-10-15 | 云南省烟草农业科学研究院 | 一种雷尔氏菌菌株及应用、获取和防效评价方法 |
| CN113502250B (zh) * | 2021-08-02 | 2022-08-23 | 云南省烟草农业科学研究院 | 一种雷尔氏菌菌株及应用、获取和防效评价方法 |
| CN117417844A (zh) * | 2023-05-11 | 2024-01-19 | 福建省农业科学院资源环境与土壤肥料研究所 | 一种用于土传青枯病微生态调控的复合益生菌剂及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105176871B (zh) | 2019-01-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104726383B (zh) | 解淀粉芽孢杆菌jk6及生物肥和应用 | |
| CN106434374B (zh) | 棘孢木霉及其在重金属污染修复中的应用 | |
| CN105176871A (zh) | 一种高纯度无致病力的青枯雷尔氏菌菌株 | |
| CN102676392B (zh) | 丹参内生真菌及其应用 | |
| CN105441366B (zh) | 甲基营养型芽孢杆菌zbl-1在防治棉花黄萎病中应用 | |
| CN106566777B (zh) | 拟康氏木霉t5-1菌株及其在促进三七生长和根腐病防控中的应用 | |
| CN112094760B (zh) | 一株植物内生真菌土栖棘壳孢d2g24及其应用 | |
| CN102703342B (zh) | 贝莱斯芽孢杆菌zj20菌株及其液体制剂 | |
| CN103555607B (zh) | 一种合欢叶片中的内生菌h6菌株分离方法及其应用 | |
| CN113801808B (zh) | 一株阿比科恩链霉菌及其应用 | |
| CN104263682B (zh) | 一株具有多环芳烃降解功能的植物促生内生细菌及其应用 | |
| CN111763643A (zh) | 一种防治花生根腐病的复合菌群及其应用 | |
| CN108117998A (zh) | 一种炭角菌科真菌及其应用 | |
| CN102796671A (zh) | 一种降解辛硫磷的淡紫拟青霉菌株及其应用 | |
| CN104450560B (zh) | 一株杀线虫鞘氨醇杆菌菌株及其应用 | |
| CN109082396A (zh) | 一种dsf群体感应信号分子淬灭菌及其在植物病害防治中的应用 | |
| CN107142229B (zh) | 一种防治辣椒疫病的生防放线菌菌株及其应用 | |
| CN107964516A (zh) | 一种不动杆菌及其在降解群体感应信号分子dsf中的应用 | |
| CN105349431B (zh) | 一种丹参内生真菌及其应用 | |
| CN109266574A (zh) | 一种微生物群体感应信号分子淬灭菌及其在病害生物防治中的应用 | |
| CN108739860A (zh) | 一种微生物群体感应信号淬灭菌及其作为生防菌的应用 | |
| CN103374536B (zh) | 一株枯草芽孢杆菌及其在黄瓜枯萎病防治中的应用 | |
| CN105969668A (zh) | 一株具有耐铅能力的棘孢木霉 | |
| CN108841748A (zh) | 中华根瘤固氮菌株系h6及其应用 | |
| CN107937315A (zh) | 一种dsf群体感应信号降解菌及其在植物病害防治中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20231214 Address after: 350000 pudang village, Fuzhou suburb, Fujian Province Patentee after: Institute of Resources, Environment, and Soil Fertilizers, Fujian Academy of Agricultural Sciences Address before: 350000 No. 54, 247, Fuzhou, Fujian Patentee before: AGRICULTURAL BIORESOURCES INSTITUTE OF FUJIAN ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES |