CN102373170A - 一种青枯雷尔氏菌菌株 - Google Patents

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CN102373170A CN 201110336906 CN201110336906A CN102373170A CN 102373170 A CN102373170 A CN 102373170A CN 201110336906 CN201110336906 CN 201110336906 CN 201110336906 A CN201110336906 A CN 201110336906A CN 102373170 A CN102373170 A CN 102373170A
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车建美
刘波
林营志
郑雪芳
朱育菁
唐建阳
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Abstract

本发明一种青枯雷尔氏菌菌株，所述菌株为无致病力的青枯雷尔氏菌菌株FJAT-1458(Ralstonia solanacearum)，于2011年08月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5111。本发明的优点在于：提供了一种无致病力的青枯雷尔氏菌菌株FJAT-1458，为研究避免因青枯雷尔氏菌的致病性而造成的植株萎蔫或死亡的现象提供了可能。

Description

一种青枯雷尔氏菌菌株
【技术领域】
本发明涉及一种微生物，具体涉及一种无致病力的青枯雷尔氏菌菌株。
【背景技术】
现有的青枯雷尔氏菌(Ralsotonia solanacearum)具有致病性，是一种能引起作物青枯病的植物细菌病原菌，广泛分布在热带、亚热带和温带地区，其侵染寄主范围很广，包括花生、番茄、茄子和辣椒等经济作物，并且近年来青枯病在中国继续加重，新的寄主也在不断地被发现，目前研究发现青枯雷尔氏菌还能侵染美人蕉、姜花、黄穗和百日草4种花卉。
青枯雷尔氏菌的致病性机制较复杂，在寄主植物细胞存在的情况下，青枯雷尔氏菌激活细胞壁降解酶、过敏反应以及由III型分泌系统组分编码的致病基因，其一旦进入植物组织中，高密度青枯雷尔氏菌大量表达毒力因子、胞外蛋白以及主要致病决定因子。为了避免经济作物因遭受青枯雷尔氏菌侵染而导致萎蔫或枯死的现象，从业人员一直在致力于对青枯雷尔氏菌的研究。
【发明内容】
本发明所要解决的技术问题在于提供一种无致病力的青枯雷尔氏菌菌株FJAT-1458(Ralstonia solanacearum)，该青枯雷尔氏菌菌株FJAT-1458于2011年08月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.5111。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：本实验室从福建省南平市建瓯市番茄病株植株茎部分离并筛选得到的菌株，该菌株经青枯雷尔氏菌特异性引物鉴定确认为青枯雷尔氏菌菌属中的一个菌株；之后对该菌株进行致病性检测，得知其为无致病力的青枯雷尔氏菌菌株。
本发明的有益效果在于：提供了一种青枯雷尔氏菌菌株FJAT-1458，且该青枯雷尔氏菌菌株具有无致病力的特征，为研究避免因青枯雷尔氏菌的致病性而造成的植株萎蔫或死亡的现象提供了可能。
【具体实施方式】
本发明提供的一种无致病力的青枯雷尔氏菌菌株FJAT-1458是从福建省南平市建瓯市番茄病株植株茎部分离并筛选得到的菌株。
1.菌株FJAT-1458的分离：
(1)称取发病初期番茄的茎部5g并用清水冲洗干净，且将冲洗后的茎部剪成小块组织；接着在无菌操作条件下，将小块组织依次采用75％酒精处理30s、10％次氯酸钠消毒8min、无菌水漂洗3遍；之后采用榨汁机将小块组织打碎以获得组织液，之后吸取1mL组织液进行梯度稀释，选用稀释度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7；
(2)取步骤(1)获得的稀释液200μL涂布于TTC培养基平板上，然后将TTC培养基平板置于30℃下培养2d；
(3)将步骤(2)培养获得的菌株重新划线接种于TTC培养基上，并将TTC培养基置于30℃条件下培养48h，获得菌株FJAT-1458。
2.菌株FJAT-1458的鉴定：
初步鉴定：
将所获得菌株FJAT-1458的菌落置于Leica M165FC高级电动荧光体视显微镜下进行镜检观察，观察结果显示，菌株FJAT-1458的菌落形态为表面较干燥，无流动性，中间为暗红色，且白边较窄的菌株，因此，可初步认定菌株FJAT-1458为青枯雷尔氏菌。
进一步鉴定：
(1)菌株FJAT-1458的活化：用接种环将所获得菌株FJAT-1458划线于TTC培养基上，并将TTC培养基置于恒温培养箱中培养48-72h，培养温度为30℃；
(2)制备种子液：将步骤(1)所获得的菌株FJAT-1458的单菌落接种于20mL的种子培养基中，并将其置于恒温振荡摇床中培养24h，恒温振荡摇床的温度设定30℃、转速设定170rpm/min；
(3)基因组DNA的提取：取步骤(2)所获得的种子液1mL于已灭菌的1.5mL离心管中，并按照Promega试剂盒说明书操作以提取菌株FJAT-1458的基因组DNA；
(4)菌株FJAT-458的PCR鉴定：采用青枯雷尔氏菌的特异性引物pehA#6：5′-ATC GGA CTT GAT GCG CAG GCC GTT-3′和引物pehA#3：5′-CAG CAG AAC CCG CGC CTG ATC CAG-3′为引物对(该引物对委托上海生物博尚有限公司合成)，菌株FJAT-1458的基因组DNA为模板DNA进行PCR反应，并以现有公认的青枯雷尔氏菌标准菌株GMI1000为阳性对照；
该PCR反应体系(25μL体系)如下：
Figure BDA0000103282280000031
该PCR反应的反应条件如下：
Figure BDA0000103282280000032
上述PCR反应结束后，采用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应的产物，上样量为6μL，电压为100V，电泳时间50min，并用UVP凝胶成像仪进行检测；检测结果表明，菌株FJAT-1458同菌株GMI1000一样，均在504bp位置扩增出单一条带，即确认该菌株FJAT-1458为青枯雷尔氏菌。
3.菌株FJAT-1458的致病性鉴定：
(1)致病性鉴定操作：
(a)设置实验组、阴性对照组和阳性对照组，在实验组中，制备菌株FJAT-1458的菌液，以107CFU/mL的接菌量，并采用剪叶的方式处理每株番茄苗(番茄苗的生长状态为5-6叶期)，共接种番茄苗20株，每株苗分别处理3个刀口；而阴性对照组以清水代替菌株FJAT-1458的菌液；阳性对照组以现有强致病性青枯雷尔氏菌的菌液代替菌株FJAT-1458的菌液(为了方便表述，本申请人将所述的强致病性青枯雷尔氏菌标记为菌株FJAT-91)；之后将各组处理后的番茄苗放置于温度30℃、湿度保持在70％恒温培养箱中培养，并早晚进行浇水，每天统计各组番茄苗死亡率，共观察5d；
(b)分别取步骤(a)中3种处理(即实验组、阴性对照组和阳性对照组)番茄植株的根部、茎基部、茎部和叶片少许，其中根部取5mm，并在中部切断；茎基部以横切的方式，每段长度为3mm；茎部的处理同茎基部的一样；叶片剪至3mm2大小；将处理后的根部、茎基部、茎部和叶片分别先在75％乙醇处理30s后放入10％次氯酸钠消毒8min，接着采用无菌水漂洗3次，从而完成根部、茎基部、茎部和叶片的表面消毒；然后将表面消毒后的根部、茎基部、茎部和叶片分别放入TTC培养基中培养；
(c)将步骤(b)培养的菌株转接到新鲜的TTC培养基进行划线培养，并观察菌落形态
(2)致病性鉴定结果
其中，步骤(a)的观察结果如表1所示，即菌株FJAT-91在剪叶接种1-3d内不发病，接种5d后发病率达到75.40％，植株萎蔫，死亡；菌株FJAT-1458在剪叶接种1-5d内植株均不发病；以清水进行剪叶处理的植株在1-5d内均不发病。
表1  各组剪叶接种番茄发病情况
Figure BDA0000103282280000051
为了证明通过剪叶方式接种的菌株确实进入到番茄植株内，本申请人进行了步骤(b)、步骤(c)的操作，步骤(c)的观察结果显示，经过步骤(b)、步骤(c)处理后分离得到的菌株在TTC培养基上的形态与接菌前菌株的形态一致，即通过剪叶方式接种的菌株确实进入到番茄植株内。
综上可知，菌株FJAT-1458的菌液接入番茄植株内并未导致番茄植株死亡，即菌株FJAT-1458无致病性，为研究避免因青枯雷尔氏菌的致病性而造成的植株萎蔫或死亡的现象提供了可能。

Claims (1)

1.一种青枯雷尔氏菌菌株，其特征在于：所述菌株为无致病力的青枯雷尔氏菌菌株FJAT-1458(Ralstonia solanacearum)，于2011年08月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.5111。
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