CN106939291A - 一种青枯雷尔氏菌菌株 - Google Patents

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陈德局
朱育菁
郑雪芳
车建美
陈倩倩
王阶平
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity

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Abstract

本发明提供了一种青枯雷尔氏菌菌株，所述菌株为青枯雷尔氏菌菌株FJAT‑15199(Ralstonia solanacearum)，于2016年01月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11995。本发明提供了一种无致病力的青枯雷尔氏菌菌株，为防治因青枯雷尔氏菌的致病性而造成的植株萎蔫或死亡的生物防治提供可能植物疫苗。

Description

一种青枯雷尔氏菌菌株
技术领域
本发明具体涉及一种青枯雷尔氏菌菌株。
背景技术
青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)是一种具有破坏性的土传性植物病原菌，地理分布广泛，寄主范围广，从单子叶植物到双子叶植物，从乔木到灌木，可侵染50多个科的200多种植物，包括重要的经济作物如番茄，马铃薯等。该病原菌从寄主植物的根部，入侵木质部导管，通过维管束系统迅速扩张到植物的地上部分，大量定殖引起导管功能丧失，引发植物萎蔫，导致植物死亡。青枯雷尔氏菌是造成农作物经济损失第二严重的细菌性病害，常用的防治方法为农用链霉素，效果不好并给环境造成污染，病菌易产生耐药性而不能最终控制青枯病的发生，因此生防技术的研究和开发成为目前防治青枯病的重点和热点。
青枯雷尔氏菌的致病性机制较复杂，在寄主植物细胞存在的情况下，青枯雷尔氏菌激活细胞壁降解酶、过敏反应以及由Ⅲ型分泌系统组分编码的致病基因，其一旦进入植物组织中，高密度青枯雷尔氏菌大量表达毒力因子、胞外蛋白以及主要致病决定因子。为了避免经济作物因遭受青枯雷尔氏菌侵染而导致萎蔫或枯死的现象，从业人员一直在致力于对青枯雷尔氏菌的研究。
发明内容
本发明要解决的技术问题，在于提供一种青枯雷尔氏菌菌株。
本发明是这样实现的：一种青枯雷尔氏菌菌株，所述菌株为青枯雷尔氏菌菌株FJAT-15199(Ralstonia solanacearum)，于2016年01月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11995。
进一步地，所述青枯雷尔氏菌菌株FJAT-15199(Ralstonia solanacearum)的phcA基因含有一个插入序列，所述插入序列如SEQ ID NO：5所示。
本发明的优点在于：提供了一种无致病力的青枯雷尔氏菌菌株，为防治因青枯雷尔氏菌的致病性而造成的植株萎蔫或死亡的生物防治提供可能植物疫苗。
具体实施方式
一种无致病力的青枯雷尔氏菌菌株FJAT-15199是从福建省南平市建瓯市番茄病株植株茎部分离并筛选得到的菌株。
1、菌株FJAT-15199的分离：
(1)称取发病初期番茄的茎部5g并用清水冲洗干净，且将冲洗后的茎部剪成小块组织；接着在无菌操作条件下，将小块组织依次采用70％酒精处理30s，10％次氯酸钠消毒10min，无菌水漂洗3遍；之后采用榨汁机将小块组织打碎以获得组织液，然后吸取1mL组织液进行梯度稀释，稀释度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7；
(2)取上述各稀释液100μL涂布于TTC培养基平板上，然后将TTC培养基平板置于28℃下培养3d；
(3)将步骤(2)培养获得的菌株重新划线接种于TTC培养基上，并将TTC培养基置于28℃条件下培养72h，获得青枯雷尔氏菌菌株FJAT-15199。
2.青枯雷尔氏菌菌株FJAT-15199的鉴定：
初步鉴定：
将上述所获得的菌株的菌落置于Leica M165FC高级电动荧光体视显微镜下进行镜检观察，观察结果显示，菌落形态为表面较干燥，无流动性，中间为暗红色，且白边较窄的菌株，因此，可初步认定为青枯雷尔氏菌。
进一步鉴定：
(1)菌株活化：用接种环将所获得青枯雷尔氏菌菌株FJAT-15199划线于TTC培养基上，并将TTC培养基置于恒温培养箱中培养48-72h，培养温度为30℃；
(2)制备种子液：将步骤(1)所获得的单菌落接种于20mL的种子培养基中，并将其置于恒温振荡摇床中培养24h，恒温振荡摇床的温度为30℃，转速为170rpm/min；
(3)基因组DNA的提取：取步骤(2)所获得的种子液1mL于已灭菌的1.5mL离心管中，并按照Promega试剂盒说明书操作以提取青枯雷尔氏菌菌株FJAT-15199的基因组DNA；
(4)青枯雷尔氏菌菌株FJAT-15199的16s鉴定：用原核生物通用引物27F：AGA GTTTGA TCM TGG CTC AG(如SEQ ID NO：1所示)和1492R：TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T(如SEQ ID NO：2所示)扩增后，将PCR产物测序，通过Blast分析，确认菌株FJAT-15199为青枯雷尔氏菌。
PCR反应体系(25μL总体积)如下：
反应程序如下：
(5)PCR鉴定：采用青枯雷尔氏菌的特异性引物phcAF：GGT ACG ACA ACG AGT GGGG(如SEQ ID NO：3所示)和引物phcAR：GTA ATC GAG CGG AAT CAG C(如SEQ ID NO：4所示)为引物对，青枯雷尔氏菌菌株FJAT-15199的基因组DNA为模板进行PCR反应，并以现有公认的青枯雷尔氏菌标准菌株GMI1000为阳性对照；
PCR反应体系(25μL总体积)如下：
反应程序如下：
上述PCR反应结束后，采用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应的产物，上样量为6μL，电压为100V，电泳时间50min，并用UVP凝胶成像仪进行检测；检测结果表明，青枯雷尔氏菌菌株FJAT-15199的phcA基因比青枯雷尔氏菌标准菌株GMI1000大，通过测序分析，青枯雷尔氏菌菌株FJAT-15199的phcA基因插入了一个IS序列，序列如SEQ ID NO：5所示。
3.青枯雷尔氏菌菌株FJAT-15199的致病性鉴定：
(a)设置实验组、阴性对照组和阳性对照组，在实验组中，制备青枯雷尔氏菌菌株FJAT-15199的菌液，以107CFU/mL的接菌量，并采用剪叶的方式处理每株番茄苗(番茄苗的生长状态为5-6叶期)，共接种番茄苗20株，每株苗分别处理3个刀口；而阴性对照组以清水代替青枯雷尔氏菌菌株FJAT-15199的菌液；阳性对照组以现有强致病性青枯雷尔氏菌FJAT-91的菌液代替青枯雷尔氏菌菌株FJAT-15199的菌液；然后将各组处理后的番茄苗放置于温度30℃、湿度保持在70％恒温培养箱中培养，并早晚进行浇水，每天统计各组番茄苗死亡率，共观察5d；
(b)分别取步骤(a)中存活番茄植株的根部、茎基部、茎部和叶片少许，其中根部取5mm，并在中部切断；茎基部以横切的方式，每段长度为3mm；茎部的处理同茎基部的一样；叶片剪至3mm2大小；将处理后的根部、茎基部、茎部和叶片分别先在75％乙醇处理30s后，放入10％次氯酸钠消毒8min，接着采用无菌水漂洗3次，从而完成根部、茎基部、茎部和叶片的表面消毒；然后将表面消毒后的根部、茎基部、茎部和叶片分别放入TTC培养基中培养；
(c)将步骤(b)培养的菌株转接到新鲜的TTC培养基进行划线培养，并观察菌落形态；
(d)将阴性对照组与阳性对照组同样进行步骤(b)、(c)处理。
(2)致病性鉴定结果
其中，步骤(a)的观察结果如表1所示，即强致病性青枯雷尔氏菌菌株FJAT-91在剪叶接种1-3d内不发病，接种5d后发病率达到75.40％，植株萎蔫，死亡；本发明青枯雷尔氏菌菌株FJAT-15199在剪叶接种1-5d内植株均不发病；阴性对照组即以清水进行剪叶处理的植株在1-5d内均不发病。
表1各组剪叶接种番茄发病情况
为了验证通过剪叶方式接种的菌株是否进入到番茄植株内，本申请人进行了步骤(b)、步骤(c)的操作，步骤(c)的观察结果显示，经过步骤(b)、步骤(c)处理后分离得到的菌株在TTC培养基上的形态与接菌前菌株的形态一致，表明通过剪叶方式接种的菌株确实进入到番茄植株内。
青枯雷尔氏菌菌株FJAT-15199的菌液接入番茄植株内并未导致番茄植株死亡，即本发明的青枯雷尔氏菌菌株FJAT-15199无致病性，为研究避免因青枯雷尔氏菌的致病性而造成的植株萎蔫或死亡的现象提供了可能。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建省农业科学院农业生物资源研究所
<120> 一种青枯雷尔氏菌菌株
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agagtttgat cmtggctcag 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tacggytacc ttgttacgac tt 22
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggtacgacaa cgagtgggg 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gtaatcgagc ggaatcagc 19
<210> 5
<211> 2032
<212> DNA
<213> 青枯雷尔氏菌菌株FJAT-15199的IS序列（Ralstonia solanacearum）
<400> 5
ggctctacgg aatatcgtgt gtaaatgtgc atattcgtct acaatcacaa aacggaataa 60
cgtgtggaaa ggcgattgcg catggctact gaagaacaac tgatgcttga ccttacgatt 120
ggtgggcgcc gagtccttga cccttgctgt ggcagcagga tgttctggtt cgacaggcag 180
aatccggacg tggtgtatgg cgataaacgg tcagagagcc atgtgctatg cgacggtcga 240
acactgcgaa tcgagcctga catgctgctg gacttcaccg atatgccatt cgacgatggc 300
agcttcaaac tggtggtttt tgacccgccg catttgcaca ctgccggtcc gagaagttgg 360
atgacgaaga agtacggcaa gctgtcggaa acttggcagg aagacatccg caaggggttc 420
agcgaatgct tccgggtgct ggccagcgat ggtgtcttgg tcttcaagtg gaatgaaacc 480
caggtgaaga ttcgggaagt tctcgctctt accgacgtgc agcctctgtt cggccatccg 540
actggacgta aagggctgac gcattggtac gttttcatga agccgtccga ggtagtttga 600
tgaccgacat ccttgacctg gatggctgga ccgtcatcaa caagcgcctt gacggcgacg 660
aatacgagat tgaggccgag tacaccatca gccccgactt ttgccagaag tgtggcgtcg 720
ttggcggcct gtaccgccat ggcccgaagc ccataaccat ccgcgacagc cctatccgag 780
gccggcacgt gcgcatcctg gccagggcaa aacggttcaa gtgccgggaa tgcgggggca 840
cgttcatcca gccgctgggc ggcatccacg gcgccatgcg gatgacagag cggtgcgtcg 900
agtacatcca gtctcaatgc ctgcgcgaca ccttcgtgcg cgtggctgag catattggct 960
gcgatgacaa gaccgtccgc accttggcgg gcgactacat cgagcagctc aacgccgaat 1020
acaagccttg gctgccagag tggctgggca ttgatgagac gcagattgac gggaagctca 1080
ggtgcatcgt cactgatgtc gccaaccggg tcccgattga catgctgccc gaccgcgaca 1140
agccgctggt cacggcctgg ctgcatcgat tcaaggaccg aagcgtcgtc aagggcttgg 1200
ccatcgacat gtggaggcca tacaaggatg ccgcccagtc tgtcttccct gggctgcccg 1260
tggttatcga caggttccac ctggtcagga tggcgaatca agccatggat gccgtccgaa 1320
tttcgcttgc caaggaccag gaaaaggctg ttggcagaga ctggatgcgg cgcaaatcct 1380
tgctccggat gcgttacaag aacctggacg agaaggggcg tttcaacctc cagatgtggc 1440
tggacaacga gccgcacgtg gcaaccgcct accgcctcaa ggagtcgttc tacgacatat 1500
acgatgctcc gaccagggcg gaagctgccg gccggcttga tgcctggcgc aagtccgtcc 1560
cagcggacat gaagaaggga aagaagagct tccagccgct gctgacggcc accaggaact 1620
ggcgtgagga gatgctggcc tacttcgacc acccgatttc gaatggttat acggaagccc 1680
tcaacggggt cgccaaggtc atcaatcgag ctggacgggg ctacagcttt gatgtcctgc 1740
gcgcccgcct tctgttcaag aaccgggaga gagcccagcc gccggcggtc gttgagcagt 1800
tgatgagccg ctccacgccg gcccatgaga cgctgatgga agcgctcggg aaccggtgcg 1860
aatcgtgcca gggtgtgttc gaaagctgga tgctggagtc ccaccacgtt cgcccagtcg 1920
ttcctggcga gcacacaaga aggctgtatc tctgcccgac ctgccatagg cgtttccaca 1980
cggacagtgc tagtcagcat gattcacttt ccacacagta atccgttgag cc 2032

Claims (2)

1.一种青枯雷尔氏菌菌株，其特征在于：所述菌株为青枯雷尔氏菌菌株FJAT-15199(Ralstonia solanacearum)，于2016年01月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11995。
2.如权利要求1所述的一种青枯雷尔氏菌菌株，其特征在于：所述青枯雷尔氏菌菌株FJAT-15199(Ralstonia solanacearum)的phcA基因含有一个插入序列，所述插入序列如SEQ ID NO：5所示。
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