CN108220185B - 一种生物控制剂在脱除柑橘幼树黄龙病病原中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生物控制剂在脱除柑橘幼树黄龙病病原中的应用。所述生物控制剂包括芽孢杆菌GJ1，所述芽孢杆菌GJ1于2017年7月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2017456。该应用包括以下步骤：采用上述的芽孢杆菌GJ1菌液对黄龙病感染的苗木进行脱除处理。本发明说明芽孢杆菌GJ1菌剂对黄龙病有一定的脱毒效果，通过重复接种到第7次处理，可以达到将病原脱除的目的。

Description

一种生物控制剂在脱除柑橘幼树黄龙病病原中的应用

技术领域

本发明属于生物控制剂技术领域，具体地说，涉及一种生物控制剂在脱除柑橘幼树黄龙病病原中的应用。

背景技术

芽孢杆菌(Bacillus sp.)为芽孢杆菌属，在生长过程中可以产生一系列能够抑制真菌和细菌活性的代谢物，对植物病原菌具有强烈抑制作用。该菌在自然界分布广泛，易分离培养，对人畜无毒无害，不污染环境；其代谢产物较为丰富，具有广谱抗菌活性和较强的抗逆能力，生长快，稳定性好。

芽孢杆菌是一种具有广谱抑菌活性的细菌，具有较强的次生代谢产物产生能力，可产生多种抑菌物质。经研究发现，解淀粉芽孢杆菌的抑菌物质主要是抑菌蛋白、脂肽类物质和聚酮化合物等。芽孢杆菌是土壤和自然界的优势微生物种群，芽胞杆菌大多为内生芽胞，繁殖速度快，抗逆能力强，易定殖在植物根际表面。

柑橘黄龙病(Citrus huanglongbing)是柑橘产业中最具威胁性的病害，对主栽的柑橘品种都有不同程度的影响。柑橘黄龙病主要通过柑橘木虱、带病苗木的运输、嫁接进行传播。迄今为止，我国共有19个省份栽培柑橘，其中11个省份的柑橘产业都遭到了黄龙病的危害，受黄龙病病害影响的面积占柑橘种植总面积的80％。不仅在我国，在世界上其它柑橘主产区，黄龙病的传播速度也很快，2004年在巴西圣保罗州柑橘产区发现黄龙病， 2005年美国佛罗里达州的柑橘产业也遭到黄龙病的侵害，目前，亚洲、南北美洲以及非洲50多个国家和地区的柑橘种植产业都相继受到了柑橘黄龙病的危害。

感病的柑橘一般出现均匀黄化、斑驳黄化和缺素状黄化症状，第二年黄化枝扩大到全株，使树体衰退。病树果实小，形状不正，病果表皮无光泽，味酸，有的品种果蒂附近变为橙红色，被称为“红鼻果”。树体得病后的3-5年内即丧失结果能力。近年来，黄龙病疫情扩散速度不断提高，危害损失极其严重。

柑橘黄龙病病原(Candidatus Liberibacter asiaticus)是难培养的革兰氏阴性细菌，由原核生物薄壁菌门中韧皮部杆菌属引起，是一种细菌性病害。它是由柑橘木虱为主要传播媒介。目前针对柑橘黄龙病，还没有有效的防治措施，柑橘一旦感染了黄龙病病原，果园3-5年就基本毁灭。近些年来，病原微生物导致的传染病爆发，使得抗菌方法的研究变得更加迫切。

伴随着气候变化以及国内外柑橘品种引进和交流的增多，美国加州、佛罗里达州、巴西等柑橘主要产区的黄龙病迅速蔓延，我国柑橘黄龙病感染日趋严重，因此，研究新型的可控制柑橘黄龙病的技术对于柑橘感染黄龙病的幼树的治疗和恢复具有重要的实际应用价值。

由于柑橘黄龙病的迅速蔓延，研究人员在控制黄龙病方面做了大量的探索，采用一些措施控制柑橘黄龙病的发生，如：

第一、采用重修剪，使感病树恢复树势：对柑橘树进行重度修剪，短截后，保留三大主枝和主要侧枝，通过二年半的时间，加强肥水管理和病虫的管理，恢复树体，使其能正常开花结果；但这种方法并不能去除病原，后期会重新死灰复燃。

第二、充气压力注射系统：传统的注射方法仍然有地方在继续使用。如：Christopher L.Gardner利用充气压力注射系统将药剂迅速输入柑橘树的输导组织，依据树体的大小，输入量在1～2000ml，注射器直径为50mm，每株树注射3min，从而降低病原浓度，来控制或减轻感病树的病症；但这种方法仍不能根除病原。

第三、利用调控基因的表达，控制柑橘黄龙病：Pagliai et al.，(2015) 研究了柑橘黄龙病韧皮部杆菌一种普通的转录基因LdtR，通过抑制 LdtR基因，可导致细胞变短，增加了细胞对渗透胁迫的敏感性。利用抑制剂控制LdtR基因的表达，来抑制黄龙病的发生，这种方法仅在苗木中处于试验阶段。

第四、选用高忍耐或抗黄龙病的砧穗组合：Argueso et al.研究了不同砧穗组合苗木对韧皮部杆菌的反应，筛选出US-897(C.reticulate× Poncirus trifoliate)杂交组合和US-942(C.reticulate×Poncirus trifoliate) 杂交组合US-942，表现出对黄龙病具有较好的忍耐能力。由于各地使用的砧木和品种有特定的趋向性，这种对黄龙病有抗性的组合使用范围还存在着较大的局限性。

第五、利用RNAi干扰技术，控制木虱对病原的传播：佛罗里达州利用RNAi干扰技术，沉默亚州柑橘木虱基因，多年连续评估亚州柑橘木虱的生命周期状况，取得好效果。

第六、利用热处理的方法，杀控病原物：佛罗里达州的热处理的做法是利用塑料膜和热蒸气处理柑橘树，起吊机将闭封罩套在柑橘树上，对柑橘树体逐个进行125F(51.6℃)，30秒钟热蒸汽处理，从而降低病原含量水平。使用此方法处理后的树，新发出枝稍，枝叶茂盛，树势得到恢复。但根系带毒的问题仍不能从根本上解决，需要进一步配合根系的治疗加以改进。但根系带毒的问题仍不能从根本上解决，需要进一步配合根系的治疗加以改进。

发明内容

有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种生物控制剂在脱除柑橘幼树黄龙病病原中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种芽孢杆菌GJ1，该菌株于 2017年8月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2017456。

本发明还公开了一种生物控制剂在脱除柑橘幼树黄龙病病原中的应用，所述生物控制剂包括权利要求1所述的芽孢杆菌GJ1。

进一步地，该应用包括以下步骤：采用上述的芽孢杆菌GJ1菌液对黄龙病感染的苗木进行脱除处理。

进一步地，所述芽孢杆菌GJ1菌液通过以下方法制备得到：配制芽孢杆菌GJ1培养基，高压灭菌后，按1:100体积比接种活化的芽孢杆菌GJ1，在28℃条件下，培养48h，当OD₆₀₀达到0.8-1.3时，制备得到芽孢杆菌GJ1 菌液。

进一步地，所述芽孢杆菌GJ1培养基的成分如下：玉米面粉1％，豆粉 1％，(NH₄)₂SO₄0.5％，余量为水，以上质量百分含量为100％，pH7.5。

进一步地，当芽孢杆菌GJ1的OD₆₀₀达到0.8-1.3时对柑橘黄龙病感病树进行苗木灌根处理。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

本发明说明芽孢杆菌GJ1菌剂对黄龙病有一定的脱毒效果，但对不同来源的黄龙病病株的脱毒效果存在差异，，通过重复接种到第7次处理，可以达到将病原脱除的目的。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明芽孢杆菌GJ1处理柑橘黄龙病感病幼树的操作程序；

图2是本发明16srDNA测序结果和进化树比较；

图3是本发明recA基因测序分析和进化树分析，确定分类地位；

图4是本发明处理和对照柑橘树生长指数的比较，左为处理树，右为对照树.*:差异显著p<0.05,**:差异非常显著p<0.01，用T测验统计分析 t-test；

图5是本发明树体的生长指标比较；

图6是本发明光学显微镜观察结果以及革兰氏电镜扫描观察结果(目镜 10×，物镜40×)；其中，A：成功定植的菌在显微镜下的观察结果；B：用于接种的芽孢杆菌GJ1的透射电镜观察；C：芽孢杆菌GJ1菌落分裂前的形态和大小的观察结果；D：芽孢杆菌GJ1菌落分裂后的形态和大小的观察结果。

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

实施例1芽孢杆菌GJ1的分离与鉴定

一、菌的分离

本菌株为实验室首次从柑桔叶片中分离得到，这些叶片用常规的消毒 70％乙醇消毒10s，10％的NaClO处理10min和无菌水清洗5次，然后，按1：100的比例加PBS(pH 7)缓冲液，在LB培养基中进行接种，在37℃条件下培养24-36h，分离到的多个细菌菌株，将单菌株通过培养和苗木灌根处理对HLB进行生物控制试验，结果GJ1被证实对HLB控制是有效。

二、鉴定

以16S-23S rDNA间区序列(ITS)为基础，设计引物，进行序列扩增和测序，测得的序列如SEQ ID No.1所示，经过测序和结果比对分析，本研究发现，芽孢杆菌GJ 1的23SrDNA片段测序与29种芽孢杆菌菌株序列的同源性达到99.99％，1-2825属于23S RNA，2873-2899属于5S RNA，间隔区2825-2873没有差异，并且在这29个菌株中，出现差异的二个碱基是相同位点的相同碱基，初步判定该菌为芽孢杆菌属细菌(Bacillus sp.)。

本发明采用16srDNA测序结果和进化树比较。GJ1序列与芽孢杆菌序列100％一致(图2)。经过recA基因测序测定和和进化树分析，用GJ1 序列与LFB112(CP006952),B.amyloliquefaciens,FZB42(CP000560.1),B. cereus ATCC 14579(NC_004722.1),B.weihenstephanensis KBAB4(NC_010184.1),B.cereus ATCC 10987(NC_003909.8),B.thuringiensis str.Al Hakam(NC_008600.1),B.licheniformis ATCC 14580(NC_006270.3), Clostridium botulinum Ba4 str.657(NC_012658.1),B.pumilus(Fig.1H).SAFR-032(CP000813.4),B.halodurans C-125(BA000004.3),B.subtilis subsp.subtilis str.168(NC_000964.3)(Ongena,M.,Halimi,B.,Lara,Y.,Brans,A., Joris,B.and Ficker,P.(2009).Bacillus amyloliquefaciens GA1 as a source of potentantibiotics and other secondary metabolites for biocontrol of plant pathogensAnthony Arguelles-Arias,Microbial Cell Factories.8,63 doi:10.1186/1475-2859-8-63)用DNAman软件分析比较，确定GJ1为解淀粉芽孢杆菌(图3)。

基于以上特征，将芽孢杆菌GJ 1鉴定为解淀粉芽孢杆菌。建议的分类命名为Bacillus sp.GJ1；该菌株已于2017年8月28日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学第一附小对面)；保藏号为CCTCC M 2017456。

实施例2芽孢杆菌GJ1在脱除柑橘幼树黄龙病病原中的应用：

芽孢杆菌GJ1处理柑橘黄龙病感病幼树的工艺流程如图1：

一、芽孢杆菌GJ1摇瓶培养和接种：按照下列培养基成分准备培养基，高压灭菌后，按1:10体积比接种活化的芽孢杆菌GJ1，在28℃条件下，培养48h，当OD₆₀₀达到0.8-1.3时，制备得到芽孢杆菌GJ1菌液，将芽孢杆菌GJ1菌液用于苗木灌根处理。

表1芽孢杆菌GJ1培养基成分

编号	成分和含量
		1	玉米面粉1％
2	豆粉1％
		3	(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>0.5％
4	KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>0.01％
		5	余量为水
pH	7.5

二、柑橘黄龙病控制处理和检测方法：采用芽孢杆菌GJ1菌液对黄龙病感染的苗木(苗木事先用QPCR和PCR作分子检测，阳性苗木用于 GJ1菌剂处理试验)进行脱除处理:菌液OD₆₀₀达0.8－1.3，每株苗木灌根处理的用量为1L/株，隔20d再次灌根处理1次，每次1.5L/株，处理2 次，加强处理可以每7天灌根一次，共7次。处理后1周，采叶片样品用于QPCR进行黄龙病的检测。苗木的管理方法为常规的浇水和施肥。根据 HLB检测结果，对阳性苗继续进行加强GJ1灌根处理，再次进行黄龙病检测，重复接种以达到黄龙病病原脱除的效果。如图3所示，本菌剂对苗木生长有促进作用，生长状况好于对照植株。

处理后植物高度、冠径(南－北)、直径(东－西)、新梢数、干径和根冠直径分别增加了8.8％、15.9％、-1.3％、16.7％、12.4％和12.3％。t-测试表明：树干的高度和干径分别达到了显著的水平和的一个非常显著的水平 (图4和图5)。

三、菌落的分离和定植鉴定操作：在被芽孢杆菌GJ1菌液灌根的植株叶片中，分离内生菌GJ1，探究其在植株中的定殖情况：

(一)内生菌GJ1的分离

1、对被芽孢杆菌GJ1菌液灌根的植株叶片、枝条、根进行表面消毒，消除表面细菌的污染和干扰(刘杰凤，周天，王颖，韩寒冰.小白菜内生菌的分离及菌核菌拮抗菌的筛选.湖北农业科学，2011，50(13)：2676-2679)。打开超净工作台，将需要消毒的物品放在超净工作台进行紫外消毒1h；将叶子、枝条、根用流水冲洗干净，用吸水纸将其擦干。在超净工作台上进行无菌操作，用已灭菌的剪刀将材料剪为长宽均为1cm，用无菌水进行漂洗，再用75％酒精浸泡3min，10％的NaClO浸泡(枝条8min，根和叶片 5min)，无菌水浸泡3次，每次3min；最后用无菌水进行漂洗，以最后一次漂洗液为对照，涂布于已灭菌的培养基表面；每皿放3块实验材料，于28℃恒温培养箱内进行培养5-10d。

2、待植物组织长出菌斑，对其进行分离纯化(汪腾.香蕉内生菌的分离、纯化及其防控香蕉枯萎病的初步研究.[硕士学位论文].海口：海南大学图书馆，2011)。在无菌环境下，用无菌接种环挑取少量长有菌斑的培养基，在事先制作好的LB培养基上划线分离，并于28℃恒温培养箱中培养2-3d后观察结果。在恒温培养2-3d的分离平板上，无菌环境下用无菌的接种针挑取生长有差异的菌落于新制LB培养基上划线，并于28℃恒温培养箱中进行培养，2-3d后观察结果，重复此过程直至得到纯化的单菌落，命名为内生菌GJ1。

(二)内生菌GJ1的鉴定

1、将已知的内生菌进行显微镜的观察和革兰氏染色。在无菌环境下，滴一滴无菌蒸馏水于载玻片上，利用无菌接种环挑取少许菌落，然后涂布于干净载玻片上，通过自然风干对其进行固定；在显微镜40×物镜下进行初步观察，并拍照记录；在无菌环境下，滴一滴无菌蒸馏水于载玻片上，利用无菌环挑取少许菌落，然后涂布于干净载玻片上，通过自然风干对其进行固定，利用结晶紫染液初染1min，然后用无菌水清洗去浮液，用碘液媒染2min，然后用无菌水进行清洗，用吸水纸将水吸干；用95％乙醇进行脱色处理，釆用流滴的方式，直至洗脱液无色为止；用番红染液对其进行复染3-5min，用无菌水进行水洗并进行风干；在油镜下进行镜检观察，并记录结果。

2、将纯化好的内生菌，对其进行显微镜下观察形态，进行照相。

3、对其进行革兰氏染色法，两种进行对比，初步判定是否为同一种菌。在无菌条件下挑取单菌落置于液体培养基中(1.5ml)进行摇菌，吸取650 μl菌液和350μl 50％甘油于1.5ml离心管，置于-20℃进行保存。

鉴定结果如下：

芽孢杆菌GJ1定植后，菌落经过固定处理和透射电镜观察，结果表明：它具有典型的芽孢杆菌特征，定植于柑橘植株中的菌落经过叶片叶脉横切片的消毒、接种分离试验，经光学显微镜观察，分离的菌落具有芽孢杆菌的典型特征。

在光学显微镜下观察分离的菌株，染色呈紫色，这个菌株被推断为革兰氏阳性细菌。扫描电镜观察表明：GJ1显示的是短形的形态，开始分离的菌株(图6A)的形态特征与接种柑桔树后在叶片中分离菌株(图6B) 是类似的。结果表明，GJ1成功地定殖在柑桔叶片中。这些细胞的长度约为1-4.5μm，它们的宽度是0.5-0.7μm，由TEM图像(图6C和6D)显示。在细胞分裂过程中观察到GJ1结构。并在细胞分裂过程中观察到形态学变化。开始时，隔膜在细胞内形成，接着是一个完整的隔膜和壁，细胞分裂完成。

(三)柑橘黄龙病Real-time PCR检测依据

(1)DNA提取：提取DNA的方法参考文献田亚南(1996)的CTAB 法，张志忠等(2004)的方法进行。用紫外分光光度计检测DNA浓度。根据检测浓度来确定稀释倍数，将稀释后的DNA提取液作为PCR操作的贮备液。根据柑橘黄龙病16S rRNA特异性序列设计引物，并设计看家基因引物(引物：A04F/A04R和COX+/COX-)，见表2。

表2柑橘黄龙病Real-time PCR检测和序列比对所用的引物序列信息

引物编号	引物序列
		A04F：	5’-TGGAGGTGTAAAAGTTGCCAAA-3’
A04R：	5’-CCAACGAAAAGATCAGATATTCCTCTA-3’
		COX+	5’-GTATGCCACGTCGCATTCCAGA-3’
COX－	5’-GAATGCCCTTAGCAGTTTTGGC-3’
		recA(+):	5′-TGAGTGATCGTCAGGCAGCCTTAG-3
recA(-):	5′-TTCTTCATAAGAATACCACGAACCGC-3′

(2)QPCR扩增：利用亚洲韧皮杆菌核糖体蛋白基因的特异性靶序列设计引物(表2)。实时突光定量PCR试剂盒：2XSYBRGreen qPCR Mix，购自庄盟国际生物基因科技有限公司。PCR仪(美国Bio-Rad公司)、DYY-5 型稳压稳流电泳仪(北京六一仪器厂)、凝胶成像系统(Segrate公司)、核酸蛋白检测仪(Amersham公司)，突光定量PCR仪Light Cycler480。每种处理的检测重复3次。

对芽孢杆菌GJ1菌剂处理进行黄龙病检测，江西赣南纽荷尔脐橙芽变苗木的HLB的脱毒率为33.3％。结果见表3。采用芽孢杆菌GJ1菌剂对网室保存的柑桔带病材料进行处理和分析，第一批处理后GJ1的病原脱除率为33.3％(见表4)。第二批处理后新叶和老叶均没有检测出黄龙病病原(见表4)，达到较好的脱毒效果，病原脱除率为100％。不同来源的材料脱毒情况存在着差异，可以加强处理到第7次，较好地脱除相对表达量较高的病原。

表3芽孢杆菌GJ1对江西赣州黄龙病感病苗木的处理效果

表4芽孢杆菌GJ1对网室柑橘黄龙病阳性植株脱除效果的分析

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种生物控制剂在脱除柑橘幼树黄龙病病原中的应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3000

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌GJ1(Bacillus sp.GJ1)

<400> 1

aatatggacc aatgaattac gcaaagcttg catgcctgca ggtcgacgat tgtgacctct 60

tcgctatcgc caccaaacca ttgagagtgt tctctcaaaa ctagataaca gtaagcatac 120

attcaaattg gttaagtcct cgatcgatta gtatctgtca gctccatgtg tcgccacact 180

tccacctcag acctatcaac ctgatcatct ttcagggatc ttacttcctt gcggaatggg 240

aaatctcatc ttgagggggg cttcatgctt agatgctttc agcacttatc ccgtccgcac 300

atagctaccc agcgatgccc ttggcagaac aactggtaca ccagcggtgc gtccatcccg 360

gtcctctcgt actaaggaca gctcctctca aatttcctgc gcccgcgacg gatagggacc 420

gaactgtctc acgacgttct gaacccagct cgcgtaccgc tttaatgggc gaacagccca 480

acccttggga ccgactacag ccccaggatg cgatgagccg acatcgaggt gccaaacctc 540

cccgtcgatg tggactcttg ggggagataa gcctgttatc cccggggtag cttttatccg 600

ttgagcgatg gcccttccat gcggaaccac cggatcacta agcccgactt tcgtccctgc 660

tcgacttgta ggtctcgcag tcaagctccc ttgtgccttt acactctgcg aatgatttcc 720

aaccattctg agggaacctt tgggcgcctc cgttaccttt taggaggcga ccgccccagt 780

caaactgccc acctgacact gtctccccgc ccgataaggg cggcgggtta gaaggtcaat 840

acagccaggg tagtatccca ccgatgcctc caccgaagct ggcgctccgg tttccaaggc 900

tcctacctat cctgtacaag ctgtaccaac attcaatatc aggctgcagt aaagctccac 960

ggggtctttc cgtcctgtcg cgggtaacct gcatcttcac aggtactata atttcaccga 1020

gtctctcgtt gagacagtgc ccagatcgtt gcgcctttcg tgcgggtcgg aacttacccg 1080

acaaggaatt tcgctacctt aggaccgtta tagttacggc cgccgtttac tggggcttca 1140

attcgcacct tcgcttacgc taagcgctcc tcttaacctt ccagcaccgg gcaggcgtca 1200

gcccctatac ttcgccttac ggcttcgcag agacctgtgt ttttgctaaa cagtcgcctg 1260

ggcctattca ctgcggctct ctcgggcttg caccctaaca gagcacccct tctcccgaag 1320

ttacggggtc attttgccga gttccttaac gagagttctc tcgatcacct taggattctc 1380

tcctcgccta cctgtgtcgg tttgcggtac gggcacctct cacctcgcta gaggcttttc 1440

ttggcagtgt ggaatcagga acttcgctac tataattcgc tcgccatcac agctcagcct 1500

tcacgggaaa cggatttgcc tatttcccag cctaactgct tggacgcgga tatccaatac 1560

cgcgcttacc ctatcctcct gcgtcccccc attgctcaaa tggtaaggag gtggtacagg 1620

aatatcaacc tgttatccat cgcctacgcc tttcggcctc ggcttaggtc ccgactaacc 1680

ctgagcggac gagccttcct caggaaacct taggcattcg gtggagggga ttctcacccc 1740

tctttcgcta ctcataccgg cattctcact tctaagcgct ccacaagtcc ttccggtctt 1800

gcttcacagc ccttagaacg ctctcctacc actgttcgaa gaacagtccg cagcttcggt 1860

gatacgttta gccccggtac attttcggcg cagagtcact cgaccagtga gctattacgc 1920

actctttaaa tggtggctgc ttctaagcca acatcctggt tgtctaagca actccacatc 1980

cttttccact taacgtatac tttgggacct tagctggcgg tctgggctgt ttccctttcg 2040

actacggatc ttatcactcg cagtctgact cccaaggata agtcatcggc attcggagtt 2100

tgactgaatt cggtaacccg gtaggggccc ctagtccaat cagtgctcta cctccgagac 2160

tcttaccttg aggctagccc taaagctatt tcggagagaa ccagctatct ccaggttcga 2220

ttggcatttc acccctaccc acacctcatc cccgcacttt tcaacgtgcg tgggttcggg 2280

cctccattca gtgttacctg aacttcaccc tggacatggg tagatcacct ggtttcgggt 2340

ctacgaccac gtactcaatt cgccctattc agactcgctt tcgctgcggc tccgcatctt 2400

ctgcttaacc ttgcacggga tcgtaactcg ccggttcatt ctacaaaagg cacgccatca 2460

cccgttaacg ggctctgact acttgtaggc acacggtttc aggatctctt tcactcccct 2520

tccggggtgc ttttcacctt tccctcacgg tactggttca ctatcggtca ctagggagta 2580

tttagccttg ggagatggtc ctcccggatt ccgacggaat ttcacgtgtt ccgccgtact 2640

caggatccac tcaggagaga acgaagtttt gactacaggg ctgttacctc ctatggcggg 2700

cctttccaga cctctttatc tacctcgttc ctttgtaact ccgtacagag tgtcctacaa 2760

ccccaagagg caagcctctt ggtttgggct ggtcccgttt cgctcgccgc tactcaggga 2820

atcgcatttg ctttctcttc ctccgggtac ttagatgttt cagttccccg ggtctgcctt 2880

ctcatatcct atgtattcag atatggatac cactccatta cgagtggtgg gtttccccat 2940

tcggaaatcg caatctctag aggatccccg ggtaccgagc tcgaatcacc ggccgggcgg 3000

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial chromosome)

<400> 2

tggaggtgta aaagttgcca aa 22

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial chromosome)

<400> 3

ccaacgaaaa gatcagatat tcctcta 27

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial chromosome)

<400> 4

gtatgccacg tcgcattcca ga 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial chromosome)

<400> 5

gaatgccctt agcagttttg gc 22

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial chromosome)

<400> 6

tgagtgatcg tcaggcagcc ttag 24

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial chromosome)

<400> 7

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Claims (2)

1.一种生物控制剂在脱除柑橘幼树黄龙病病原中的应用，其特征在于，所述生物控制剂为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)GJ1，保藏号为CCTCC NO: M2017456；采用解淀粉芽孢杆菌GJ1菌液对黄龙病感染的苗木进行脱除处理；

所述解淀粉芽孢杆菌GJ1菌液通过以下方法制备得到：配制解淀粉芽孢杆菌GJ1培养基，高压灭菌后，按1:100体积比接种活化的解淀粉芽孢杆菌GJ1，在28℃条件下，培养48h，当OD₆₀₀达到0.8-1.3时，制备得到解淀粉芽孢杆菌GJ1菌液；

所述解淀粉芽孢杆菌GJ1培养基的成分如下：玉米面粉1％，豆粉1％，(NH₄)₂SO₄ 0.5％，余量为水，以上质量百分含量为100％，pH7.5。

2.根据权利要求1所述的生物控制剂在脱除柑橘幼树黄龙病病原中的应用，其特征在于，当解淀粉芽孢杆菌GJ1的OD₆₀₀达到0.8-1.3时对柑橘黄龙病感病树进行苗木灌根处理。

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