CN113502250A - 一种雷尔氏菌菌株及应用、获取和防效评价方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种雷尔氏菌菌株及应用、获取和防效评价方法，所述的雷尔氏菌菌株为Ralstoniasp.56D2；所述菌株于2019年11月12日保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学；保藏编号为CCTCC No：M 2019921。本发明提供了一种能够防治烟草青枯病的雷尔氏菌（Ralstonia sp.）56D2；提供所述雷尔氏菌（Ralstonia sp.）56D2的获取方法；揭示了所述雷尔氏菌（Ralstonia sp.）56D2在烟草青枯病中的应用。

Description

一种雷尔氏菌菌株及应用、获取和防效评价方法

技术领域

本发明属于微生物应用技术领域，具体涉及一种雷尔氏菌菌株及应用、获取和防效评价方法技术领域。

背景技术

烟草青枯病(Tobacco bacterial wilt,TBW)为维管束病害，是热带、亚热带和一些温带地区常见的植物细菌病害之一。植株发病时，病株茎部外观可见纵向的黑色条斑。有时病株一侧叶片先发病枯萎，相应一侧根部变黑腐烂。严重时，叶片出现大面积水渍状坏死斑。发病中后期，全部叶片枯萎。剖视病株茎秆可见维管束变褐色，含水量较高的部分用手挤压，可见导管中渗出黄色汁液，即为细菌溢脓。后期病茎髓部呈蜂窝状或全部腐烂成空腔。该病害在我国长江流域及其以南各大烟区普遍发生，其中云南、贵州、四川、重庆、福建、广西、安徽等省市危害严重，常爆发流行，造成毁灭性损失。

高温高湿有利于病菌生长繁殖。一般苗床和大田地势低凹，排水不良，土壤粘重，容易发病。连作地发病重。施氨态氮的田块比施硝态氮的田块发病重。地下害虫多的烟地发病重。不同烟草品种间对青枯病的感、抗性有一定的差异。

烟草青枯病的防治方法主要包括利用抗病品种、化学防治、农业防治和生物防治等。生物防治由于其防效高、专一性强、环境友好，以及不易产生抗药性等优点，因而受到青睐。目前利用生物防治方法防治植物病害取得较大的进展，并呈现多样化的发展趋势，在部分农作物上已成为防治病害的重要措施之一。

例如我国烟草上已注册的8种生防菌，主要为荧光假单胞菌、解淀粉芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等杀菌剂，多数菌剂具有拮抗青枯菌的能力。国内已报道无致病力青枯菌FJAT-aRS01(Ralstonia solanacearum)(刘波, 郑雪芳,朱育菁,等.一种高纯度无致病力的雷尔氏青枯菌：中国, CN105176871A[P].2015)、无致病力青枯菌(R.solanacearum)FJAT-1458(陈燕萍,刘波,肖荣凤,等.青枯病植物疫苗生产菌FJAT-1458的发酵方法：中国, CN108504600A[P].2018.)、皮氏雷尔氏菌(R.pickettii)NJQL-A6在番茄青枯病防治中的应用(沈其荣,韦中,徐阳春,等.一种能防治番茄青枯病的微生物植物疫苗：中国,CN102978132B[P].2015)。上述研究表明无致病力青枯菌、雷尔氏菌属细菌对作物青枯病有一定防治效果，以青枯菌属细菌为生防菌开发植物疫苗可能在烟草青枯病防治中有一定开发前景。但目前暂无雷尔氏菌属细菌在烟草青枯病防治中的应用，采用筛选无致病力青枯菌开发植物疫苗工程菌，来提供一种防治烟草青枯病的微生物植物疫苗，还未见报道。

发明内容

本发明的目的旨在克服现有技术存在的不足，提供了一种能够防治烟草青枯病的雷尔氏菌(Ralstonia sp.)56D2。本发明的第二目的在于提供所述雷尔氏菌(Ralstoniasp.)56D2的获取方法。本发明的第三目的在于提供所述雷尔氏菌 (Ralstonia sp.)56D2在烟草青枯病中的应用。

本发明的第一目的是这样实现的：一种雷尔氏菌(Ralstonia sp.)，命名为 56D2。经鉴定为雷尔氏菌(Ralstonia sp.)的一个株系，是从植烟土壤中分离得到，已于2019年11月12日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，中国典型培养物保藏中心，邮编：430072)，其保藏编号为CCTCC No：M2019921，保藏时命名为雷尔氏菌菌株为Ralstonia mannitolilytica 56D2。

本发明所述的雷尔氏菌菌株应用于防治烟草青枯病。

本发明所述的雷尔氏菌菌株的应用于代谢以下任一物质或组合：D-丝氨酸、 D-半乳糖、D-半乳糖酸内酯、D-半乳糖醛酸、D-山梨醇、D-果糖、D-棉子糖、 D-氨基葡萄糖酸、D-海藻糖、D-甘露醇、D-葡萄糖酸、D-葡萄糖醛酸、D-蜜二糖、D-阿拉伯醇、D-阿洛酮糖、DL-α-吲哚甘油磷酸、g-氨基丁酸、L-丙氨酰甘氨酸、L-丙氨酸、L-丝氨酸、L-亮氨酸、L-天冬氨酸、L-天门冬酰胺、L-海藻糖、 L-焦谷氨酸、L-组氨酸、L-脯氨酸、L-苏氨酸、L-苯丙氨酸、L-谷氨酸、L-鼠李糖、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、p-对羟基苯乙酸、α-酮戊二酸、β-甲基-D-葡萄糖苷、β-羟丁酸、丙三醇、丙酮酸甲酯、乙酸、乳果糖、单甲琥珀酸、吐温40、吐温 80、尿刊酸、木糖醇、松二糖、柠檬酸、淀粉、糊精、纤维素二塘、羟基-L-脯氨酸、肌苷、肌醇、胸苷、腐胺、葡萄糖1-磷酸盐、葡萄糖6-磷酸盐、蔗糖、金盏花醇、顺势乌头酸、麦芽糖、龙胆二塘。

本发明所述雷尔氏菌菌株的获取方法，所述雷尔氏菌菌株的获取方法包括以下步骤：

步骤1)：将土壤样品去除杂质和较大的块状物后，装入玻璃培养皿中，土层厚度为1.5±0.5cm，用蒸馏水采用滴定瓶将土壤润湿；

步骤2)：制备微生物诱集装置：首先在直径50mm、孔径为0.45μm的微孔滤膜边缘涂布胶水，将不锈钢平底垫圈置于微孔滤膜上；然后向垫圈内腔加入3 mL固体培养基；再用胶水涂布金属垫圈上表面，盖上另一孔径为0.45μm微孔滤膜；

步骤3)：将微生物诱集装置置于步骤1中湿润的土壤上，轻轻压实，确保微孔滤膜与土壤充分接触，再用剩余土壤将装置完全覆盖，并用蒸馏水采用滴定瓶再次润湿土壤；

步骤4)：盖好培养皿，用封口膜将培养皿封好，并置于30℃±2℃培养箱培养7d，期间观察土壤湿度，若土壤湿度低则用无菌水补足；

步骤5)：从培养箱中取出经过诱集的培养皿，将固体培养基捣碎，加入3mL 无菌水放置10min后，梯度稀释至10^-4、10^-5；

步骤6)：取10^-4、10^-5菌液涂布于寡营养培养基CN；每个梯度涂布5皿，于超净工作台吹干，并置于30℃培养箱中培养7d。

本发明所述雷尔氏菌菌株的获取方法包括纯化步骤，即：

步骤7):从寡营养培养基CN培养皿上挑取再次划线于寡营养培养基CN，获得纯菌56D2；挑取56D2的单一菌落接种于盛有2.5mL LB液体培养基的试管，置于28℃225r/min恒温振荡培养48h。

本发明所述的固体培养基含1.2％结冷胶和1.0％维生素。

本发明所述的寡营养培养基CN含0.1％酪蛋白氨基酸，0.1％营养肉汤，1.5％琼脂。

本发明所述的LB液体培养基含1％胰蛋白胨、0.5％酵母浸出物、1％氯化钠和0.5％蔗糖。

本发明所述雷尔氏菌菌株的防效评价方法，所述的防效评价方法包括以下步骤；

步骤S1，生测初筛选

S1.1烟苗处理：漂浮育苗法培育烟苗至4～5叶期，用苗前1d从育苗池中取出备用烟苗晾干漂盘，次日用无菌刀片在烟苗根部距烟株中心1.5cm的两侧造伤，将烟苗分为试验组和对照组，每组2株烟苗；

S1.2生防菌预处理：将试验组接种1mL供试细菌，以接接种LB培养液培养基的烟苗设为对照组；

S1.3烟苗悬根培养：在28℃恒温人工气候室内的培养架上放置一张尺寸比培育烟苗的漂浮盘略大的厚塑料布，并在塑料布的4角和中心共放置5个一次性培养皿作为支撑，将漂浮盘置于其上培养1d，其间分早、中、晚三次用喷水器具浇水，浇水量以漂盘孔内的水不下滴为宜；

S1.4病原菌接种：生防菌预处理1d后，对试验组和对照组接种0.5mL前述病原菌10倍稀释液，在28℃恒温人工气候室内继续培养15～20d，其间分早、中、晚三次用喷水器具浇水保湿；

S1.5观察与确认：观察试验组和对照组发病情况，当对照组发病率＞80％时，根据实验组烟株发病情况，烟株健康确认为1，烟株发病但未枯死确认为 0.5，烟株枯死确认为0，每株供试细菌处理的烟株的数值为两株烟株赋值的总和，选择供试细菌中赋值最高的菌株为潜力生防菌。

本发明所述的防效评价方法还包括生测复筛选，步骤如下：

步骤S2，生测复筛选

步骤S2.1供试菌株为步骤S1生测初筛获得的潜力生防菌；

步骤S2.2生测复筛中增加处理烟株数量，处理组和对照组均处理8株烟苗；

步骤S2.3分别于接种青枯菌后10、20d调查各处理组烟株的病害发生情况。

本发明雷尔氏菌(Ralstonia sp.)56D2的16S rDNA序列提交至GenBank，序列登录号为MW064126。

本发明的有益效果为，1、防病机理不同：常规青枯病生防菌筛选是通过室内平板拮抗初筛选、温室生测复筛选，而本发明中的雷尔氏菌(Ralstonia sp.) 56D2的防效评价时不以拮抗效果为平均指标，直接以控病能力为指标，经平板拮抗能力测定发现菌株56D2对烟草青枯菌的抑菌能力有限，说明菌株56D2的控病机理与传统的拮抗菌不同，可能通过生态位竞争、诱导植株抗病等机制防病；

2、不产生抗药性：菌株56D2对烟草青枯菌生长的抑制能力有限，说明菌株56D2发挥控病作用不以产生抗生素为主。因此在田间施用菌株56D2防治烟草青枯病时不会产生青枯菌对菌株56D2或菌株代谢产物的耐受性，施用菌株 56D2具有较好的安全性；

3、丰富生防资源：烟草青枯病生防菌以芽孢菌、假单胞菌为主，雷尔氏菌(Ralstoniasp.)为烟草青枯病生防菌的应用鲜有报道，本发明涉及的雷尔氏菌(Ralstoniasp.)56D2为烟草青枯病的防治提供新的生防资源。

下面结合附图和具体实施方式本发明做进一步解释。

附图说明

图1基于16S rDNA序列的系统发育树构建图。

图2基于全基因组构建的系统发育树图。

图3为雷尔氏菌56D2培养48h的菌落形态图。

图4为为雷尔氏菌56D2与青枯菌对峙培养菌落形态对比图。

具体实施方式

采用的培养基

LB液体培养基包含1％胰蛋白胨、0.5％酵母浸出物、1％氯化钠和0.5％蔗糖；

CG培养基包含0.1％酸水解酪蛋白、0.5％葡萄糖和2％蛋白胨；

CGA含0.1％酸水解酪蛋白、0.5％葡萄糖和2％蛋白胨、1.5％琼脂；

TTC培养基含1％蛋白胨、1％葡萄糖、0.1％酪素水解物、1.5％琼脂及0.005％的氯化三苯基四氮唑(TTC)。

漂浮育苗

以感病烟草品种红花大金元为生测对象，漂浮育苗培育烟苗至4～5叶期。

病原菌培养

从-80℃超低温冰箱活化烟草青枯菌RS于TTC培养基[1％蛋白胨、1％葡萄糖、0.1％酪素水解物、1.5％琼脂及0.005％的氯化三苯基四氮唑(TTC)]表面，置于28℃恒温培养箱培养36～48h；

挑取具有较宽白边、流动性较强、中间呈粉红色或浅红色稀液状的典型菌落，接种于盛有100mL CG液体培养基(1％蛋白胨、1％葡萄糖、0.1％酪素水解物)的三角瓶内，置于28℃225r/min恒温振荡培养24h；

取100μL稀释至10^-7，取100μL 10^-5、10^-6、10^-7稀释液涂布TTC平板，并于48h后观察菌落形态及计数菌落数，计算培养的菌液含有的菌体量。

实施例1

菌株获取

诱集、分离与培养

步骤1)：将土壤样品去除杂质和较大的块状物后，装入直径120mm的玻璃培养皿中，土层厚度约为1.5cm，用蒸馏水采用滴定瓶将土壤润湿；

步骤2)：制备微生物诱集装置：首先在直径50mm、孔径为0.45μm的微孔滤膜边缘涂布胶水，将不锈钢平底垫圈置于微孔滤膜上；然后向垫圈内腔加入3 mL固体培养基(1.2％结冷胶和1.0％维生素)；再用胶水涂布金属垫圈上表面，盖上另一孔径为0.45μm微孔滤膜；

步骤3)：将微生物诱集装置置于步骤1中湿润的土壤上，轻轻压实，确保微孔滤膜与土壤充分接触，再用剩余土壤将装置完全覆盖，并用蒸馏水采用滴定瓶再次润湿土壤；

步骤4)：盖好培养皿，用封口膜将培养皿封好，并置于30℃培养箱培养7d，期间观察土壤湿度，若土壤湿度低则用无菌水补足；

步骤5)：从培养箱中取出经过诱集的培养皿，将固体培养基捣碎，加入3mL 无菌水放置10min后，梯度稀释至10^-4、10^-5；

步骤6)：取10^-4、10^-5菌液涂布于寡营养培养基CN(含0.1％酪蛋白氨基酸， 0.1％营养肉汤，1.5％琼脂)，每个梯度涂布5皿，于超净工作台吹干，并置于30℃培养箱中培养7d；

实验结果：通过上述实验，从CN培养皿上挑取再次划线于CN培养基，获得纯菌56D2；挑取56D2的单一菌落接种于盛有2.5mL LB液体培养基(1％胰蛋白胨、0.5％酵母浸出物、1％氯化钠和0.5％蔗糖)的试管，置于28℃225r/min 恒温振荡培养48h，其菌落形态如图3所示；

实施例2

生防菌防治烟草青枯病的防效评价：

防效评价分为室内生测初筛选、复筛选，具体操作如下：

步骤S1，生测初筛

烟苗处理：漂浮育苗法培育烟苗至4～5叶期，用苗前1d从育苗池中取出备用烟苗晾干漂盘，次日用无菌刀片在烟苗根部距烟株中心1.5cm的两侧造伤，将烟苗分为试验组和对照组，每组2株烟苗；

生防菌预处理：将试验组接种1mL供试细菌，以接接种LB培养液培养基的烟苗设为对照组；

烟苗悬根培养：在28℃恒温人工气候室内的培养架上放置一张尺寸比培育烟苗的漂浮盘略大的厚塑料布，并在塑料布的4角和中心共放置5个一次性培养皿作为支撑，将漂浮盘置于其上培养1d，其间分早、中、晚三次用喷水器具浇水，浇水量以漂盘孔内的水不下滴为宜；

病原菌接种：生防菌预处理1d后，对试验组和对照组接种0.5mL前述病原菌10倍稀释液，在28℃恒温人工气候室内继续培养15～20d，其间分早、中、晚三次用喷水器具浇水保湿；

观察记录：观察试验组和对照组发病情况，当对照组发病率＞80％时，记录实验组烟株发病情况，烟株健康记为1，烟株发病但未枯死赋值为0.5，烟株枯死赋值为0，每株供试细菌处理的烟株的数值为两株烟株赋值的总和，选择供试细菌中赋值最高的菌株为潜力生防菌，用于室内复筛选。

步骤S2，生测复筛

步骤S2生测复筛，除以下试验不同外，其余操作步骤与步骤S1生测初筛相同。

1)供试菌株为步骤S1生测初筛获得的潜力生防菌；

2)生测复筛中增加处理烟株数量，处理组和对照组均处理8株烟苗；

3)分别于接种青枯菌后10、20d调查各处理组烟株的病害发生情况，如表 1所示。

表1生长室内菌株56D2防治烟草青枯病的效果

实验结果表明，在初筛选中，经菌株56D2处理的两株烟均健康，故赋值2；在温室复筛选中，接种10、20dpi分别有4、3株烟株健康，而对照处理的烟株已全部死亡。上述结果说明56D2具有一定的防治效果，可用作温室大棚盆栽评价其防效。

实施例3

菌株鉴定与保藏

菌株鉴定

常规细菌鉴定参照文献《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等编著.科学出版社.2001年)。

采用Biolog GEN III板分析菌株56D2的化合物代谢特征。

分子鉴定方法如下：细菌基因组DNA的提取试剂盒，方法参见试剂盒说明书。用通用引物F27/R1492PCR扩增16S rDNA序列，常规条件扩增，扩增产物经胶回收后，连接于载体pEAZY-T5 Zero载体，热激转化大肠杆菌感受态细胞 DH5α，挑取菌落以M13F/M13R为引物进行菌落PCR鉴定。阳性克隆送上海英骏生物技术有限公司进行序列测定。通过上述16S rDNA序列分析，序列表如 NCBI数据库BioProject Number为PRJNA735438所示，初步确认菌株的分类地位如图1所示。

进一步地，运用基因组测序技术获取菌株的全基因组。运用Ezcloud数据库进行比对，计算专利菌株与亲缘关系最近的种的平均核苷酸一致性(ANI)和 isDDH值，最终确定菌株的分子分类地位，如图2所示。

综合形态学和分子生物学特征，确定生防菌的分类地位。

实验结果记录如下：

1、培养特性与形态特征：

菌株56D2在NA、CA培养基于28℃培养，24～36h即可见圆形菌落形成，菌落初期浅，后期淡黄色。菌株56D2在半固体游动性培养基SMM(每升含有 0.lg葡萄糖、胰蛋白胨0.lg、乙二胺四乙酸二钠0.038g、10mL pH 7.0磷酸缓冲液)上游动能力较强。菌株56D2在LB液体培养基中于15～40℃条件下均能生长。挑取菌株置于显微镜下镜检，细菌呈杆状，鞭毛较少，单极生。细菌革兰氏染色呈阴性。

3、化合物代谢特征：菌株56D2能利用D-丝氨酸、D-半乳糖、D-半乳糖酸内酯、D-半乳糖醛酸、D-山梨醇、D-果糖、D-棉子糖、D-氨基葡萄糖酸、D-海藻糖、D-甘露醇、D-葡萄糖酸、D-葡萄糖醛酸、D-蜜二糖、D-阿拉伯醇、D-阿洛酮糖、DL-α-吲哚甘油磷酸、g-氨基丁酸、L-丙氨酰甘氨酸、L-丙氨酸、L-丝氨酸、L-亮氨酸、L-天冬氨酸、L-天门冬酰胺、L-海藻糖、L-焦谷氨酸、L-组氨酸、L-脯氨酸、L-苏氨酸、L-苯丙氨酸、L-谷氨酸、L-鼠李糖、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、p-对羟基苯乙酸、α-酮戊二酸、β-甲基-D-葡萄糖苷、β-羟丁酸、丙三醇、丙酮酸甲酯、乙酸、乳果糖、单甲琥珀酸、吐温40、吐温80、尿刊酸、木糖醇、松二糖、柠檬酸、淀粉、糊精、纤维素二塘、羟基-L-脯氨酸、肌苷、肌醇、胸苷、腐胺、葡萄糖1-磷酸盐、葡萄糖6-磷酸盐、蔗糖、金盏花醇、顺势乌头酸、麦芽糖、龙胆二塘；不能利用N-乙酰-D-氨基半乳糖、α-D-葡萄糖、α-丁酮酸、α-氧代戊酸、丙二酸、奎宁酸、癸二酸、溴丁二酸、D-丙氨酸、DL-肉毒碱、苯乙胺、环糊精、DL-乳酸、丙酸、D-砂糖酸、丁二酸、琥珀酰胺酸、甘氨酰-L- 谷氨酸、α-羟丁酸、g-羟丁酸、亚甲基丁二酸、氨基丙酰胺、葡糖醛酰胺、2-氨基乙醇、2,3-丁二醇。

3、菌株的分子鉴定：

16S rDNA序列分析表明菌株与R.insidiosa、R.mannitolilytica、R.pickettii聚为一支，并与R.pickettii亲缘关系最近，但56D2的16S rDNA序列与上述三种青枯菌有明显不同(图1)。经基因组测序分析，获得菌株56D2的全长基因组，序列已提交NCBI数据库，菌株的BioProject Number为PRJNA735438。

运用典型菌株基因组服务器构建菌株56D2及其近缘种的系统发育树，结果表明菌株56D2与R.pickettii的标准菌株NBRC 102503的亲缘关系最近，但分为两个不同的分支(图2)。

经Ezcloud数据库的分析工具OrthoANI比较菌株56D2与雷尔氏菌属内的5 株青枯菌进行ANI比较，结果表明Original ANI、OrthoANI均小于95％，且isDDH 值均小于70.00(表2)。

上述结果说明56D2为雷尔氏菌属内的另一新种，本发明将菌株56D2暂命名为雷尔氏菌属(Ralstoniasp.)的一株细菌。

表2 56D2与雷尔氏菌属细菌的基因组相似性比较分析

(2)雷尔氏菌(Ralstonia sp.)56D2的保藏

通过上述鉴定结果，确认菌株56D2为雷尔氏菌(Ralstonia sp.)的一个株系，命名为56D2。菌株56D2已于2019年11月12日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，中国典型培养物保藏中心，邮编：430072)，其保藏编号为CCTCC No：M 2019921。雷尔氏菌(Ralstonia sp.)56D2的16S rDNA序列提交至GenBank，序列登录号为MW064126；雷尔氏菌(Ralstonia sp.)56D2的基因组序列信息已存储于NCBI 数据库，BioProject Number为PRJNA735438。

生防菌的保藏

菌株56D2已于2019年11月12日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，中国典型培养物保藏中心，邮编：430072)，其保藏编号为CCTCC No：M 2019921。

实施例4

菌株在烟草青枯病防治中的应用

试验设置：于温控28～30℃温室大棚进行，试验设置青枯菌处理组、对照组 (浇灌等体积LB培养基+自来水)，每处理3次重复，每重复10株烟株；

供试菌株培养：室内筛选获得的生防菌用LB液体培养基(1％胰蛋白胨、 0.5％酵母浸出物、1％氯化钠和0.5％蔗糖)培养，在225r/min 30℃摇培48h；试验选择实验室保存的来自云南省玉溪市(LLRS1)、文山州(QBRS1)、临沧市(BSRS1)、普洱市(PEJG01)及福建省(FQY-4、FZ-GNX、FZ1-1)的7株青枯菌为病原菌，病原青枯菌用CG液体培养基(0.1％酸水解酪蛋白、0.5％葡萄糖和2％蛋白胨)培养，在225r/min 30℃摇培24h；

烟苗移栽：采用漂浮育苗方式培育的烟苗，烟苗为二次剪叶的烟苗，约培育50d，移栽时将红壤与有机质按3：1混匀后移栽烟苗；

接种：移栽后将250mL生防菌发酵液稀释25倍，每株烟灌根200mL稀释液，以等体积LB稀释液处理对照组；次日将CG培养基摇陪24h的青枯菌稀释 100倍，每株烟接种200mL青枯菌稀释液。

调查统计：接种后每7d调查一次病情指数，共调查5次。烟草青枯病的发病率、病情指数和防治效果按下式计算：发病率＝发病植株/调查植株总数×100％；病情指数＝[Σ(病情级数×此级菌株数)/(最高级数×总株数)]×100；防治效果＝(对照病情指数－处理病情指数)/对照病情指数×100％。病情指数按照中华人民共和国烟草行业标准烟草病害分级及调查方法调查(GB/T 23222-2008)，病害分级如下：全株无病为0级，病侧二分之一以下叶片凋萎为1级，病侧二分之一至三分之二叶片凋萎为3级，病侧三分之二以上叶片凋萎为5级，病株叶片全部凋萎为7级，病株基本枯死为9级。

试验结果：结果表明经56D2菌株处理的烟株在观察期内病情指数均低于对照组，且菌剂56D2对不同地理来源的供试烟草青枯菌均有防治效果，防效在 43.04～87.50％，其中56D2菌剂对来自云南省普洱市(PEJG)、玉溪市(LLRS-1)、文山州(QBRS1)、临沧市(BSRS1)及福建省(FZ1-1)的青枯菌的防效优于对照药剂噻菌铜。上述结果说明菌株56D2对不同地理来源的烟草青枯菌具有较好的防治效果，防效优于对照药剂，具有一定开发价值(表3)。

表3菌株56D2对不同地理来源的青枯菌的防治效果

实施例6

平板拮抗法：

采用平板对峙培养法，测量菌株的抑菌带。操作步骤如下：将CG培养基(0.1％酸水解酪蛋白、0.5％葡萄糖和2％蛋白胨)培养24h的青枯菌梯度稀释至10^-4；取100μL稀释液置于CGA(0.1％酸水解酪蛋白、0.5％葡萄糖和2％蛋白胨、1.5％琼脂)培养基表面，用涂布株涂布均匀，置于超净工作吹干；挑取单菌落接种于含有青枯菌的培养基表面，培养2～3d后观测各菌株的抑菌情况，有抑菌效果的菌株用四点法对峙培养并测量菌株的抑菌圈和抑菌带(图4)。

以上所述的仅是本发明的部分具体实施例(由于本发明的配方属于数值范围，故实施例不能穷举，本发明所记载的保护范围以本发明的数值范围和其他技术要点范围为准)，方案中公知的具体内容或常识在此未作过多描述。应当指出，上述实施例不以任何方式限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

Claims (10)

1.一种雷尔氏菌菌株，其特征在于，所述的雷尔氏菌菌株为Ralstoniasp.56D2；所述菌株于2019年11月12日保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学；保藏编号为CCTCC No：M 2019921。

2.根据权利要求1所述的雷尔氏菌菌株的应用，其特征在于，所述的雷尔氏菌菌株用于防治烟草青枯病。

3.根据权利要求1所述的雷尔氏菌菌株的应用，其特征在于，所述的雷尔氏菌菌株用于代谢以下任一物质或组合：D-丝氨酸、D-半乳糖、D-半乳糖酸内酯、D-半乳糖醛酸、D-山梨醇、D-果糖、D-棉子糖、D-氨基葡萄糖酸、D-海藻糖、D-甘露醇、D-葡萄糖酸、D-葡萄糖醛酸、D-蜜二糖、D-阿拉伯醇、D-阿洛酮糖、DL-α-吲哚甘油磷酸、g-氨基丁酸、L-丙氨酰甘氨酸、L-丙氨酸、L-丝氨酸、L-亮氨酸、L-天冬氨酸、L-天门冬酰胺、L-海藻糖、L-焦谷氨酸、L-组氨酸、L-脯氨酸、L-苏氨酸、L-苯丙氨酸、L-谷氨酸、L-鼠李糖、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、p-对羟基苯乙酸、α-酮戊二酸、β-甲基-D-葡萄糖苷、β-羟丁酸、丙三醇、丙酮酸甲酯、乙酸、乳果糖、单甲琥珀酸、吐温40、吐温80、尿刊酸、木糖醇、松二糖、柠檬酸、淀粉、糊精、纤维素二塘、羟基-L-脯氨酸、肌苷、肌醇、胸苷、腐胺、葡萄糖1-磷酸盐、葡萄糖6-磷酸盐、蔗糖、金盏花醇、顺势乌头酸、麦芽糖、龙胆二塘。

4.根据权利要求1所述雷尔氏菌菌株的获取方法，其特征在于，所述雷尔氏菌菌株的获取方法包括以下步骤：

步骤1）：将土壤样品去除杂质和较大的块状物后，装入玻璃培养皿中，土层厚度为1.5±0.5cm，用蒸馏水采用滴定瓶将土壤润湿；

步骤2）：制备微生物诱集装置：首先在直径50mm、孔径为0.45 µm的微孔滤膜边缘涂布胶水，将不锈钢平底垫圈置于微孔滤膜上；然后向垫圈内腔加入3 mL固体培养基；再用胶水涂布金属垫圈上表面，盖上另一孔径为0.45 µm微孔滤膜；

步骤3）：将微生物诱集装置置于步骤1中湿润的土壤上，轻轻压实，确保微孔滤膜与土壤充分接触，再用剩余土壤将装置完全覆盖，并用蒸馏水采用滴定瓶再次润湿土壤；

步骤4）：盖好培养皿，用封口膜将培养皿封好，并置于30℃±2℃培养箱培养7d，期间观察土壤湿度，若土壤湿度低则用无菌水补足；

步骤5）：从培养箱中取出经过诱集的培养皿，将固体培养基捣碎，加入3mL无菌水放置10 min后，梯度稀释至10^-4、10^-5；

步骤6）：取10^-4、10^-5菌液涂布于寡营养培养基CN；每个梯度涂布5皿，于超净工作台吹干，并置于30℃培养箱中培养7 d。

5.根据权利要求4所述的雷尔氏菌菌株的获取方法，其特征在于，所述雷尔氏菌菌株的获取方法包括纯化步骤，即：

步骤7）:从寡营养培养基CN培养皿上挑取再次划线于寡营养培养基CN，获得纯菌56D2；挑取56D2的单一菌落接种于盛有2.5 mL LB液体培养基的试管，置于28℃ 225 r/min恒温振荡培养48 h。

6.根据权利要求4所述的雷尔氏菌菌株的获取方法，其特征在于，所述的固体培养基含1.2%结冷胶和1.0%维生素。

7.根据权利要求4所述的雷尔氏菌菌株的获取方法，其特征在于，所述的寡营养培养基CN含0.1%酪蛋白氨基酸，0.1%营养肉汤，1.5%琼脂。

8.根据权利要求5所述的雷尔氏菌菌株的获取方法，其特征在于，所述的LB液体培养基含1%胰蛋白胨、0.5%酵母浸出物、1%氯化钠和0.5%蔗糖。

9.根据权利要求1所述雷尔氏菌菌株的防效评价方法，其特征在于，所述的防效评价方法包括以下步骤；

步骤S1，生测初筛选

S1.1烟苗处理：漂浮育苗法培育烟苗至4~5叶期，用苗前1d从育苗池中取出备用烟苗晾干漂盘，次日用无菌刀片在烟苗根部距烟株中心1.5 cm的两侧造伤，将烟苗分为试验组和对照组，每组2株烟苗；

S1.2生防菌预处理：将试验组接种1mL供试细菌，以接接种LB培养液培养基的烟苗设为对照组；

S1.3烟苗悬根培养：在28℃恒温人工气候室内的培养架上放置一张尺寸比培育烟苗的漂浮盘略大的厚塑料布，并在塑料布的4角和中心共放置5个一次性培养皿作为支撑，将漂浮盘置于其上培养1d，其间分早、中、晚三次用喷水器具浇水，浇水量以漂盘孔内的水不下滴为宜；

S1.4病原菌接种：生防菌预处理1 d后，对试验组和对照组接种0.5 mL前述病原菌10倍稀释液，在28℃恒温人工气候室内继续培养15~20 d，其间分早、中、晚三次用喷水器具浇水保湿；

S1.5观察与确认：观察试验组和对照组发病情况，当对照组发病率＞80%时，根据实验组烟株发病情况，烟株健康确认为1，烟株发病但未枯死确认为0.5，烟株枯死确认为0，每株供试细菌处理的烟株的数值为两株烟株赋值的总和，选择供试细菌中赋值最高的菌株为潜力生防菌。

10.根据权利要求9所述雷尔氏菌菌株的防效评价方法，其特征在于，所述的防效评价方法还包括生测复筛选，步骤如下：

步骤S2，生测复筛选

步骤S2.1供试菌株为步骤S1生测初筛获得的潜力生防菌；

步骤S2.2生测复筛中增加处理烟株数量，处理组和对照组均处理8株烟苗；

步骤S2.3分别于接种青枯菌后10、20 d调查各处理组烟株的病害发生情况。

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