CN115612651B - 一株指示器寡养单胞菌菌株107e3及其应用、产品和方法 - Google Patents

一株指示器寡养单胞菌菌株107e3及其应用、产品和方法 Download PDF

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Abstract

本发明“一株指示器寡养单胞菌菌株107E3及其应用、产品和方法”属于微生物技术领域。本发明提供一株指示器寡养单胞菌(Stenotrophomonas indicatrix)菌株107E3，其保藏编号为CCTCC No：M 2019923。本发明还提供所述指示器寡养单胞菌(Stenotrophomonas indicatrix)菌株107E3在防治青枯病方面的用途。本发明还提供基于指示器寡养单胞菌(Stenotrophomonas indicatrix)菌株107E3的菌剂和防治青枯病的方法。经实验证实，指示器寡养单胞菌(Stenotrophomonas indicatrix)菌株107E3可有效使得青枯病发病烟株的病情指数维持在较低水平。

Description

一株指示器寡养单胞菌菌株107E3及其应用、产品和方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株指示器寡养单胞菌菌株107E3及其应用、产品和方法。
背景技术
青枯病由罗尔斯通氏菌(Ralstonia spp.)侵染引起，是作物重要的土传病害。罗尔斯通氏菌寄主范围广泛，能侵染400多种作物，在香蕉、番茄、马铃薯、烟草上为害较重。烟草青枯病主要由假茄科罗尔斯通氏菌(R.pseudosolanacearum)侵染引起，该病在我国长江流域及其以南各烟区普遍发生。笔者经过4年研究，目前已探明该病在云南省12个州市的43个区(县)有发生(卢灿华,刘俊莹,马俊红等.云南省烟草青枯病病原多样性初探[C].中国植物病理学会2019年学术年会论文集,2019:381.)。虽然烟草青枯病为害较重，但因抗病资源匮乏，加之无化学防治的特效药，该病一直是制约烟草产量和品质提升的重要因素。
生物防治因其对环境友好而受到广泛关注。我国已针对烟草青枯病开发注册9种生防菌，主要为荧光假单胞菌、解淀粉芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等杀菌剂，多数菌剂具有拮抗罗尔斯通氏菌的能力。
寡养单胞菌作为重要的生防资源，已在土壤改良、有机肥发酵和病害防治中得到应用。例如，帕万氏寡养单胞菌(S.pavanii)LC00168防治防治松材线虫病(CN112877240A)、嗜根寡氧单胞菌(S.rhizophila)Sneb 1777诱导花生抗根结线虫病(CN106148221A)、嗜根寡养单胞菌(S.rhizophila)S11防治水稻稻瘟病(CN110643551A)、嗜麦芽寡养单胞菌属(S.maltophilia)防治黄瓜绿斑驳花叶病毒病(CN105219673A)、嗜麦芽糖寡养单胞菌(S.maltophilia)ZL-2防治小麦锈病(CN112708584A)、嗜麦芽寡养单胞菌(S.maltophilia)TDJN1 防治黄瓜霜霉病(CN105002111A)、微嗜酸寡养单胞菌(S.acidaminiphila)菌株BJ1防治苹果树腐烂病(CN102851225A)。寡养单胞菌与其他属细菌组合形成复合微生物菌剂也有相关报道，例如不动杆菌(Acinetobacter sp.)NXH1、克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)NXH2、寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)NXH3及假单胞菌(Pseudomonas sp.)XKS组合形成生态改良基质(CN111011159A)，嗜麦芽寡养单胞菌(S.maltophilia)37-1用于制备菜粕微生物酶解物防治番茄根结线虫病(CN102154159A)、辣椒疫病(CN101948780A)、甜瓜枯萎病(CN101691549A)，木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)、肠杆菌(Enterobacter sp.)、苍白杆菌(Ochrobactrum sp.)、寡养单胞菌(Stenotrophomonassp.)、枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)组成的微生物菌剂防治烟草赤星病(CN110402964A)，嗜根寡养单胞菌(S.rhizophila)、嗜麦芽寡养单胞菌(S.maltophilia)、聚硼贪噬菌(Variovorax boronicumulans)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、噬几丁质菌(Chitinophaga niastensis)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)组成的合成菌群具有防病、促生长和改善品质的功能(CN115161406A)。
目前仅有嗜麦芽寡养单胞菌(S.maltophilia)防治马铃薯青枯病(CN102174428A、CN102154156A)、茄子青枯病(CN102168046A)和姜青枯病(CN102146351A)的报道。但无寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)细菌在烟草青枯病防治中的应用，更未见可防治或抑制作物青枯病的指示器寡养单胞菌(Stenotrophomonas indicatrix)的报道。
发明内容
基于本领域现有技术存在的上述空白，本发明提供一种能够防治烟草青枯病的指示器寡养单胞菌(Stenotrophomonas indicatrix)107E3及其应用、产品与方法。
本发明的技术方案如下：
一株指示器寡养单胞菌(Stenotrophomonas indicatrix)菌株107E3，其特征在于，其保藏编号为CCTCC No：M 2019923。
保藏编号为CCTCC No：M 2019923的指示器寡养单胞菌(Stenotrophomonasindicatrix) 菌株107E3在防治青枯病方面的应用。
所述青枯病指烟草青枯病，由假茄科罗尔斯通氏菌(Ralstonia solanacearum)或假茄科罗尔斯通氏菌(R.pseudosolanacearum)或蒲桃罗尔斯通氏菌(R.syzygii)侵染引发的疾病。
指示器寡养单胞菌(Stenotrophomonas indicatrix)菌株107E3不通过拮抗或抑制茄科罗尔斯通氏菌(R.solanacearum)或假茄科罗尔斯通氏菌(R.pseudosolanacearum)或蒲桃罗尔斯通氏菌(R.syzygii)来防治青枯病。
一种菌剂，其特征在于，包括：保藏编号为CCTCC No：M 2019923的指示器寡养单胞菌(Stenotrophomonas indicatrix)菌株107E3。
所述的菌剂还包括：辅料。
所述的菌剂的剂型选自：发酵液、粉剂、悬乳剂。
一种防治青枯病的方法，其特征在于，保藏编号为CCTCC No：M 2019923的指示器寡养单胞菌(Stenotrophomonas indicatrix)菌株107E3防治青枯病。
采用菌浓度为107-109CFU/mL的指示器寡养单胞菌(Stenotrophomonasindicatrix)菌株 107E3的发酵稀释液对发病植株进行灌根处理。
所述发病植株指：由茄科罗尔斯通氏菌(R.solanacearum)或假茄科罗尔斯通氏菌(R. pseudosolanacearum)或蒲桃罗尔斯通氏菌(R.syzygii)侵染引发青枯病的烟草植株。
本发明的有益效果如下：
1、防病机理不同：常规青枯病生防菌筛选是通过室内平板拮抗初筛选、温室生测复筛选，而本发明中的指示器寡养单胞菌(Stenotrophomonas indicatrix)107E3的防效评价时不以拮抗效果为评价指标，直接以控病能力为指标，经平板拮抗能力测定发现菌株107E3对罗尔斯通氏菌的无抑菌能力，说明菌株107E3的控病机理与传统的拮抗菌不同，可能通过生态位竞争、诱导植株抗病、调节根际微生物群落等机制防病；
2、不产生抗药性：菌株107E3对罗尔斯通氏菌生长无抑制能力，说明菌株107E3发挥控病作用不以产生抗生素为主。因此在田间施用菌株107E3防治烟草青枯病时不会产生青枯菌对菌株107E3或菌株代谢产物的耐受性，施用菌株107E3具有较好的安全性；
3、丰富生防资源：烟草青枯病生防菌以芽孢菌、假单胞菌、链霉菌为主，无寡养单胞菌(S.)在烟草青枯病生物防治中的报道，本发明涉及的指示器寡养单胞菌(Stenotrophomonas indicatrix)107E3为烟草青枯病的防治提供新的生防资源。
本发明的指示器寡养单胞菌(Stenotrophomonas indicatrix)107E3的保藏信息如下：
保藏编号：CCTCC NO:M 2019923；
分类命名：Stenotrophomonas indicatrix 107E3；
保藏日期：2019年11月12日；
保藏单位：中国典型培养物保藏中心；
保藏地址：中国、武汉、武汉大学。
附图说明
图1为本发明实验例1的指示器寡养单胞菌107E3培养48h的菌落形态图。
图2为本发明实验例3对指示器寡养单胞菌107E3基于全基因组构建的系统发育树图。
图3为本发明实验例5的指示器寡养单胞菌107E3与罗尔斯通氏菌QBRS-1对峙培养菌落形态对比图。
具体实施方式
下面结合具体实施例、实验例和附图对本发明的技术方案做进一步详细说明，但本发明并不局限于以下技术方案。
生物材料的来源
一、实验例2、实验例4和实验例5使用的烟草材料为公知公用的烟草品种红花大金元，由申请人实验室保存，也可商购获得。
二、实验例2、4和5使用的罗尔斯通氏菌：
假茄科罗尔斯通氏菌(R.pseudosolanacearum)RS已完成基因组测序，序列提交至GenBank数据库，Bioproject Number为PRJNA594457，GenBank assembly accession号为GCA_018243235.1，该菌已于2022年7月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC 1.3533。
蒲桃罗尔斯通氏菌(R.syzygii)LLRS-1为“Can-Hua Lu,Jun-Ying Li,Meng-GeMi,et al. Complete Genome Sequence of Ralstonia syzygii subsp.indonesiensisStrain LLRS-1,Isolated from Wilted Tobacco in China.Phytopathology,2021,111:12:2392-2395)”一文中记载的 LLRS-1菌株。
茄科罗尔斯通氏菌(R.solanacearum)FQY_4为“Cao Yi,Tian Baoyu,Liu Yanxia,et al. Genome Sequencing of Ralstonia solanacearum FQY_4,Isolated from aBacterial Wilt Nursery Used for Breeding Crop Resistance.GenomeAnnouncements,2013,1(3):e00125-13.”一文中记载的FQY_4菌株。
茄科罗尔斯通氏菌(R.solanacearum)CQPS-1为“Liu Y,Tang Y,Qin X,etal.Genome Sequencing of Ralstonia solanacearum CQPS-1,a Phylotype I StrainCollected from a Highland Area with Continuous Cropping ofTobacco.Front.Microbiology,2017,8:974.”一文记载的 CQPS-1菌株。
假茄科罗尔斯通氏菌(R.pseudosolanacearum)BSRS-1、QBRS-1、PEJG01均为申请人实验室保存的菌株，申请人承诺自本发明申请日起20年内免费向公众发放用于验证本发明的效果。
本发明实验例采用的培养基及培养育苗方法
一、采用的培养基
LB液体培养基包含1％胰蛋白胨、0.5％酵母浸出物、1％氯化钠和0.5％蔗糖；
CG培养基包含0.1％酸水解酪蛋白、0.5％葡萄糖和2％蛋白胨；
CGA含0.1％酸水解酪蛋白、0.5％葡萄糖和2％蛋白胨、1.5％琼脂；
寡营养培养基CN含0.1％酪蛋白氨基酸、0.1％营养肉汤、1.5％琼脂；
TZC培养基含1％蛋白胨、1％葡萄糖、0.1％酪素水解物、1.5％琼脂及0.005％的氯化三苯基四氮唑(TTC)。
二、漂浮育苗
以感病烟草品种红花大金元为生测对象，漂浮育苗培育烟苗至4～5叶期。
三、病原菌培养
从-80℃超低温冰箱活化罗尔斯通氏菌RS于TZC培养基[1％蛋白胨、1％葡萄糖、0.1％酪素水解物、1.5％琼脂及0.005％的氯化三苯基四氮唑(TTC)]表面，置于28℃恒温培养箱培养36～48h；
挑取具有较宽白边、流动性较强、中间呈粉红色或浅红色稀液状的典型菌落，接种于盛有100mL CG液体培养基(1％蛋白胨、1％葡萄糖、0.1％酪素水解物)的三角瓶内，置于28℃225r/min恒温振荡培养24h；
取100μL稀释至10-7，取100μL10-5、10-6、10-7稀释液涂布TZC平板，并于48h后观察菌落形态及计数菌落数，计算培养的菌液含有的菌体量。
第1组实施例、本发明的菌株107E3
本组实施例提供一株指示器寡养单胞菌(Stenotrophomonas indicatrix)菌株107E3，其特征在于，其保藏编号为CCTCC No：M 2019923。
任何利用、使用、销售、许诺销售、生产、制备、培养、扩繁、发酵保藏编号为CCTCCNo：M 2019923的指示器寡养单胞菌(Stenotrophomonas indicatrix)菌株107E3的行为均落入本发明的保护范围。
本领域技术人员根据本发明的教导和启发，出于实际生产需要，结合微生物工艺领域常用技术手段选择合适的辅料加以调配，将本发明保藏编号为CCTCC No：M 2019923的指示器寡养单胞菌(Stenotrophomonas indicatrix)菌株107E3制成各种符合各类符合工艺生产要求的剂型产品，例如，粉剂、片剂、液体剂等。
本文中，发明内容、具体实施方式部分记载的生防菌、指示器寡养单胞菌107E3、107E3、菌株107E3、107E3菌株、指示器寡养单胞菌均指：本发明的保藏编号为CCTCC No：M2019923的指示器寡养单胞菌(Stenotrophomonas indicatrix)菌株107E3。
第2组实施例、本发明的菌株107E3的应用
本组实施例提供保藏编号为CCTCC No：M 2019923的指示器寡养单胞菌(Stenotrophomonas indicatrix)菌株107E3在防治青枯病方面的应用。
在一些实施例中，所述青枯病指烟草青枯病，由假茄科罗尔斯通氏菌(R.solanacearum) 或假茄科罗尔斯通氏菌(R.pseudosolanacearum)或蒲桃罗尔斯通氏菌(R.syzygii)侵染引发的疾病。
在另一些实施例中，指示器寡养单胞菌(Stenotrophomonas indicatrix)菌株107E3不通过拮抗或抑制茄科罗尔斯通氏菌(R.solanacearum)或假茄科罗尔斯通氏菌(R.pseudosolanacearum)或蒲桃罗尔斯通氏菌(R.syzygii)来防治青枯病。
第3组实施例、本发明的菌剂
本组实施例提供一种菌剂。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述菌剂包括：保藏编号为CCTCC No：M 2019923的指示器寡养单胞菌(Stenotrophomonasindicatrix)菌株 107E3。
在进一步的实施例中，所述菌剂还包括：辅料。
在更具体的实施例中，所述药用辅料选自：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂等。
在具体的实施例中，剂型为粉剂。
本发明的菌剂剂型不限于粉剂，本领域技术人员根据本发明的教导和启发，出于实际生产需要，结合微生物工艺领域常用技术手段(例如，《制剂技术百科全书》、《药物制剂技术》等)，选择合适的辅料加以调配，将本发明保藏编号为CCTCC No：M 2019923的指示器寡养单胞菌(Stenotrophomonas indicatrix)菌株107E3制成各种符合各类符合工艺生产要求的其他剂型产品，例如，片剂、液体剂、喷雾剂、颗粒剂等。
第4组实施例、本发明防治青枯病的方法
本组实施例提供一种防治青枯病的方法。本组所有的实施例都具备如下共同特征：保藏编号为CCTCC No：M 2019923的指示器寡养单胞菌(Stenotrophomonasindicatrix)菌株107E3 防治青枯病。
在优选的实施例中，采用菌浓度为107-108CFU/mL的指示器寡养单胞菌(Stenotrophomonas indicatrix)菌株107E3的发酵稀释液对发病植株进行灌根处理。
在具体的实施例中，所述发病植株指：由茄科罗尔斯通氏菌(R.solanacearum)或假茄科罗尔斯通氏菌(R.pseudosolanacearum)或蒲桃罗尔斯通氏菌(R.syzygii)侵染引发青枯病的烟草植株。
实验例1、菌株获取
一、诱集、分离与培养
将土壤样品去除杂质和较大的块状物后，装入直径120mm的玻璃培养皿中，土层厚度约为1.5cm，用蒸馏水采用滴定瓶将土壤润湿；
制备微生物诱集装置：首先在直径50mm、孔径为0.45μm的微孔滤膜边缘涂布胶水，将不锈钢平底垫圈置于微孔滤膜上；然后向垫圈内腔加入3mL固体培养基(1.2％结冷胶和1.0％维生素)；再用胶水涂布金属垫圈上表面，盖上另一孔径为0.45μm微孔滤膜；
将微生物诱集装置置于(1)中湿润的土壤上，轻轻压实装置，确保微孔滤膜与土壤充分接触，再用剩余土壤将装置完全覆盖，并用蒸馏水采用滴定瓶再次润湿土壤；
盖好培养皿，用封口膜将培养装置封好，并置于30℃培养箱培养7d，期间观察土壤湿度，若土壤湿度低则用无菌水补足；
从培养箱中取出经过诱集的培养装置，将固体培养基捣碎，加入3mL无菌水放置10min 后，梯度稀释至10-4；
取10-4、10-5菌液涂布于寡营养培养基CN(含0.1％酪蛋白氨基酸，0.1％营养肉汤，1.5％琼脂)，每个梯度涂布5皿，于超净工作台吹干，并置于30℃培养箱中培养7d；
二、实验结果
通过上述实验，从CN培养皿上挑取再次划线于CN培养基，获得纯菌107E3；挑取107E3 的单一菌落接种于盛有2.5mL LB液体培养基(1％胰蛋白胨、0.5％酵母浸出物、1％氯化钠和0.5％蔗糖)的试管，置于28℃225r/min恒温振荡培养48h，其菌落形态如图1所示；实验例2、生防菌107E3防治烟草青枯病的防效评价：
防效评价分为室内生测初筛选、复筛选，具体操作如下：
步骤S1，生测初筛
烟苗处理：漂浮育苗法培育烟苗至4～5叶期，用苗前1d从育苗池中取出备用烟苗晾干漂盘，次日用无菌刀片在烟苗根部距烟株中心1.5cm的两侧造伤，将烟苗分为试验组和对照组，每组2株烟苗；
生防菌预处理：将试验组接种1mL供试细菌，以接接种LB培养液培养基的烟苗设为对照组；
烟苗悬根培养：在28℃恒温人工气候室内的培养架上放置一张尺寸比培育烟苗的漂浮盘略大的厚塑料布，并在塑料布的4角和中心共放置5个一次性培养皿作为支撑，将漂浮盘置于其上培养1d，其间分早、中、晚三次用喷水器具浇水，浇水量以漂盘孔内的水不下滴为宜；
病原菌接种：生防菌预处理1d后，对试验组和对照组接种0.5mL罗尔斯通氏菌RS10 倍稀释液，在28℃恒温人工气候室内继续培养15～20d，其间分早、中、晚三次用喷水器具浇水保湿；
观察记录：观察试验组和对照组发病情况，当对照组发病率＞80％时，记录实验组烟株发病情况，烟株健康记为1，烟株发病但未枯死赋值为0.5，烟株枯死赋值为0，每株供试细菌处理的烟株的数值为两株烟株赋值的总和，选择供试细菌中赋值最高的菌株为潜力生防菌，用于室内复筛选。
步骤S2，生测复筛
步骤S2生测复筛，除以下试验不同外，其余操作步骤与步骤S1生测初筛相同。
1)供试菌株为步骤S1生测初筛获得的潜力生防菌；
2)生测复筛中增加处理烟株数量，处理组和对照组均处理8株烟苗；
3)分别于接种罗尔斯通氏菌后10、20d调查各处理组烟株的病害发生情况，如表1所示。
表1.生长室内菌株107E3防治烟草青枯病的效果
实验结果表明，在初筛选中，经菌株107E3处理的两株烟株均健康，故赋值2.0；在温室复筛选中，接种10、20dpi分别有4、3株烟株健康，而对照处理的烟株已全部死亡。上述结果说明107E3具有一定防治效果，可用作青枯病防治温室大棚盆栽评价其防效。
实验例3、菌株鉴定与保藏
一、菌株鉴定
常规细菌鉴定参照文献《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等编著.科学出版社.2001 年)。
采用Biolog GEN III板分析菌株107E3的化合物代谢特征。
分子鉴定方法如下：细菌基因组DNA的提取试剂盒，方法参见试剂盒说明书。用通用引物F27/R1492进行PCR扩增16S rDNA序列，常规条件扩增，扩增产物经胶回收后，连接于载体pEAZY-T5 Zero载体，热激转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取菌落以 M13F/M13R为引物进行菌落PCR鉴定。阳性克隆送上海英骏生物技术有限公司进行序列测定。运用Ezbiocloud数据库(https://www.ezbiocloud.net/)，分析与菌株107E3相近的模式种，初步确认菌株的属一级分类地位。
进一步地，运用基因组测序技术获取菌株的全基因组。运用TYPE数据库进行比对，计算专利菌株与亲缘关系最近的种的DNA分子杂交值(dDDH)，最终确定菌株的分子分类地位，如图2和表2所示。
综合形态学和分子生物学特征，确定生防菌的分类地位。
二、实验结果记录如下：
1、培养特性与形态特征：
菌株107E3为革兰氏阴性菌，严格好养，无芽孢，具鞭毛，具游动性，杆状，宽1.0-1.4 μm，长1.8-2.7μm。菌株107E3在10-37℃、pH 6.0-9.0、NaCl 0-4％条件下生长。
3、化合物代谢特征：
Gen III鉴定结果表明，生防菌107E3能利用的碳源有水苏糖、L-天冬氨酸、L-焦谷氨酸、甲酸、β-羟基-D,L丁酸、D-麦芽糖、N-乙酰-β-D-甘露糖胺、D-果糖-6-磷酸、D-甘露醇、L-丙氨酸、α-D-乳糖、L-丝氨酸、L-精氨酸、α-D-葡糖、明胶、D-松二糖、D-水杨苷、蜜二糖、甘油、肌苷、N-乙酰-D-葡糖胺、蜜三糖,棉子糖、D-甘露糖、D-葡糖-6-磷酸、N-乙酰神经氨酸、糖质酸、L-果糖、D-阿拉伯醇、L-半乳糖醛酸内酯、D-葡糖酸、L-乳酸、D-纤维二糖、α-酮-戊二酸、α-羟基-丁酸、溴-丁二酸、L-苹果酸、D-乳酸甲酯、吐温40、p-羟基-苯乙酸、丙酮酸甲酯、D-苹果酸、柠檬酸、γ-氨基-丁酸，不能利用的碳源有D-海藻糖、D- 葡糖醛酸、糊精、粘酸、D-半乳糖、N-乙酰-D-半乳糖胺、葡糖醛酰胺、奎宁酸、蔗糖、氨基乙酰-L-脯氨酸、β-甲酰-D-葡糖苷、3-甲酰葡糖、D-果糖、D-半乳糖醛酸、果胶、乙酰乙酸、L-谷氨酸、D-天冬氨酸、L-鼠李糖、D-丝氨酸、L-组胺、龙胆二糖、肌醇、乙酸、D- 果糖、D-山梨醇、丙酸；、能在含有醋竹桃霉素、萘啶酮酸、丁酸钠、氯化锂、四唑紫、1％乳酸钠、pH 6、利福霉素SV、林肯霉素,洁霉素、亚碲酸钾、氨曲南的条件下生长，而不能在含有、pH 5、D-丝氨酸、万古霉素、硫酸四癸钠、四唑蓝、梭链孢酸、盐酸胍、溴酸钠、二甲胺四环素的条件下生长。
3、菌株的分子鉴定：
16S rDNA序列分析表明菌株107E3与指示器寡养单胞菌(Stenotrophomonasindicatrix) WS40T相似性最高，为100.00％，与导奶管寡养单胞菌(S.lactitubi)M15T、膝形寡养单胞菌(S.geniculata)ATCC 19374T、S.chelatiphaga DSM 21508T的序列相似性分别为99.66％、 99.23％、99.05％。上述结果表明菌株107E3属于寡养单胞菌，且与指示器寡养单胞菌 (Stenotrophomonas indicatrix)亲缘关系最近。经基因组测序分析，获得菌株107E3的全长基因组。经Type(Strain)Genome Server(https://tygs.dsmz.de/)数据库分析，结果表明菌株107E3与指示器寡养单胞菌(Stenotrophomonas indicatrix)WS40T相似性最高，为84.8％ (dDDH4)，大于新种的鉴定阈值70.0％；菌株107E3与导奶管寡养单胞菌(S.lactitubi) M15T的DDH(d4)值为53％；菌株107E3与其他寡养单胞菌的dDDH值小于50％。基于菌株107E3及其近缘种基因组构建系统发育树，结果表明菌株107E3与指示器寡养单胞菌 (Stenotrophomonas indicatrix)的标准菌株WS40T的亲缘关系最近，两者聚为一支(图2)。上述结果说明菌株107E3为指示器寡养单胞菌(Stenotrophomonasindicatrix)。
表2.107E3与寡养单胞菌细菌的基因组相似性比较分析
三、指示器寡养单胞菌(Stenotrophomonas indicatrix)107E3的保藏
通过上述鉴定结果，确认菌株107E3为指示器寡养单胞菌(Stenotrophomonasindicatrix) 的一个株系，命名为107E3，并将该菌株送保藏，其保藏信息如下：
保藏编号：CCTCC NO:M 2019923；
分类命名：Stenotrophomonas indicatrix 107E3；
保藏日期：2019年11月12日；
保藏单位：中国典型培养物保藏中心；
保藏地址：中国、武汉、武汉大学。
实验例4、菌株在烟草青枯病防治中的应用
试验设置：于温控28～30℃温室大棚进行，试验设置罗尔斯通氏菌处理组、对照组(灌根等体积LB培养基+自来水)，每处理3次重复，每重复10株烟株；
供试菌株培养：室内筛选获得的生防菌107E3用LB液体培养基(1％胰蛋白胨、0.5％酵母浸出物、1％氯化钠和0.5％蔗糖)培养，在225r/min 30℃摇培48h，即获得菌剂107E3；试验选择实验室保存的来自云南省玉溪市(LLRS-1)、文山州(QBRS-1)、临沧市(BSRS-1)、普洱市(PEJG01)、重庆市(CQPS-1)和福建省(FQY_4)的6株罗尔斯通氏菌为病原菌，病原青枯菌用CG液体培养基(0.1％酸水解酪蛋白、0.5％葡萄糖和2％蛋白胨)培养，在225 r/min 30℃摇培24h；
烟苗移栽：采用漂浮育苗方式培育的烟苗，烟苗为二次剪叶的烟苗，约培育50d，移栽时将红壤与有机质按3:1混匀后移栽烟苗；
接种：移栽后将250mL生防菌发酵液稀释25倍，每株烟灌根200mL稀释液(稀释液中的107E3菌浓度约107CFU/mL)，以等体积LB稀释液处理对照组；次日将CG培养基摇陪24h的罗尔斯通氏菌稀释100倍，每株烟接种100mL罗尔斯通氏菌稀释液(接种浓度约为107CFU/mL)。
调查统计：接种后每7d调查一次病情指数，共调查3-6次。烟草青枯病的发病率、病情指数和防治效果按下式计算：发病率＝发病植株/调查植株总数×100％；病情指数＝[Σ(病情级数×此级菌株数)/(最高级数×总株数)]×100；防治效果＝(对照病情指数－处理病情指数)/对照病情指数×100％。病情指数按照中华人民共和国烟草行业标准烟草病害分级及调查方法调查(GB/T 23222-2008)，病害分级如下：全株无病为0级，病侧二分之一以下叶片凋萎为1级，病侧二分之一至三分之二叶片凋萎为3级，病侧三分之二以上叶片凋萎为5 级，病株叶片全部凋萎为7级，病株基本枯死为9级。
试验结果：结果表明经菌剂107E3处理的烟株在观察期内病情指数均低于对照组，且菌剂107E3对不同地理来源的供试罗尔斯通氏菌均有防治效果，防效在12.70～66.32％，其中对来自普洱(PEGJ01)和玉溪(LLRS-1)的罗尔斯通氏菌防治效果较好，分别达66.32％和51.55％。菌剂107E3对来自云南省普洱市(PEJG01)、文山州(QBRS-1)、临沧市(BSRS-1)、重庆市(CQPS-1)的4株罗尔斯通氏菌的防效优于对照药剂噻菌铜。上述结果说明菌剂107E3对不同地理来源的罗尔斯通氏菌有较好的防治效果(表3)。
表3.菌剂107E3对不同罗尔斯通氏菌的防治效果
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实验例5、菌株107E3拮抗罗尔斯通氏菌的效果
采用平板对峙培养法，测量菌株的抑菌带。操作步骤如下：分别将CG培养基(0.1％酸水解酪蛋白、0.5％葡萄糖和2％蛋白胨)培养24h的罗尔斯通氏菌QBRS-1、RS、LLRS-1 和BSRS-1梯度稀释至10-4；取100μL稀释液置于CGA(0.1％酸水解酪蛋白、0.5％葡萄糖和2％蛋白胨、1.5％琼脂)培养基表面，用涂布株涂布均匀，置于超净工作吹干；挑取单菌落接种于含有罗尔斯通氏菌的培养基表面，培养2～3d后观测各菌株的抑菌情况，有抑菌效果的菌株用四点法对峙培养并测量菌株的抑菌圈和抑菌带(图3)。
试验结果：结果表明菌株107E3对罗尔斯通氏菌RS、LLRS-1、BSRS-1和QBRS-1均无拮抗作用。上述结果说明生防菌107E3不以抑菌作用控制青枯病，可能通过非拮抗的生态位竞争、诱导抗性、调节根际微生态结构而发挥作用。
表4.生防菌107E3对不同罗尔斯通氏菌的拮抗能力
罗尔斯通氏菌 生防菌 抑菌圈/cm 抑菌带/cm
RS 107E3 0.00±0.00 0.00±0.00
LLRS-1 107E3 0.00±0.00 0.00±0.00
BSRS-1 107E3 0.00±0.00 0.00±0.00
QBRS-1 107E3 0.00±0.00 0.00±0.00

Claims (9)

1.一株指示器寡养单胞菌(Stenotrophomonas indicatrix)菌株107E3，其特征在于，其保藏编号为CCTCC No：M 2019923。
2.保藏编号为CCTCC No：M 2019923的指示器寡养单胞菌(Stenotrophomonas indicatrix)菌株107E3在防治青枯病方面的应用；所述青枯病指烟草青枯病，所述烟草青枯病是由茄科罗尔斯通氏菌(Ralstonia solanacearum)或假茄科罗尔斯通氏菌(R.pseudosolanacearum)或蒲桃罗尔斯通氏菌(R.syzygii)侵染引发的疾病。
3.根据权利要求2所述的保藏编号为CCTCC No：M 2019923的指示器寡养单胞菌(Stenotrophomonas indicatrix)菌株107E3在防治青枯病方面的应用，其特征在于，指示器寡养单胞菌(Stenotrophomonas indicatrix)菌株107E3不通过拮抗或抑制茄科罗尔斯通氏菌(R.solanacearum)或假茄科罗尔斯通氏菌(R.pseudosolanacearum)或蒲桃罗尔斯通氏菌(R.syzygii)来防治青枯病。
4.一种菌剂，其特征在于，包括：保藏编号为CCTCC No：M 2019923的指示器寡养单胞菌(Stenotrophomonas indicatrix)菌株107E3。
5.根据权利要求4所述的菌剂，其特征在于，还包括：辅料。
6.根据权利要求4或5所述的菌剂，其特征在于，剂型选自：发酵液、粉剂、悬乳剂。
7.一种防治青枯病的方法，其特征在于，保藏编号为CCTCC No：M 2019923的指示器寡养单胞菌(Stenotrophomonas indicatrix)菌株107E3防治青枯病；所述青枯病指烟草青枯病，所述烟草青枯病是由茄科罗尔斯通氏菌(Ralstonia solanacearum)或假茄科罗尔斯通氏菌(R.pseudosolanacearum)或蒲桃罗尔斯通氏菌(R.syzygii)侵染引发的疾病。
8.根据权利要求7所述的一种防治青枯病的方法，其特征在于，采用菌浓度为107-109CFU/mL的指示器寡养单胞菌(Stenotrophomonas indicatrix)菌株107E3的发酵稀释液对发病植株进行灌根处理。
9.根据权利要求8所述的一种防治青枯病的方法，其特征在于，所述发病植株指：由茄科罗尔斯通氏菌(R.solanacearum)或假茄科罗尔斯通氏菌(R.pseudosolanacearum)或蒲桃罗尔斯通氏菌(R.syzygii)侵染引发青枯病的烟草植株。
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