CN108504600A - 青枯病植物疫苗生产菌fjat-1458的发酵方法 - Google Patents

青枯病植物疫苗生产菌fjat-1458的发酵方法 Download PDF

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朱育菁
郑雪芳
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    • C05F9/00—Fertilisers from household or town refuse
    • C05F9/04—Biological compost

Abstract

本发明属于微生物发酵领域，具体公开了一种青枯病植物疫苗生产菌FJAT‑1458的发酵方法，将青枯病植物疫苗生产菌FJAT‑1458接种至SPA液体发酵培养基中制备生产用的液体菌种；以微生物发酵床养猪垫料与黄豆饼粉按照质量比为6～8:2～4的比例混合后，加入质量百分数为0.04～0.06％的K2HPO4和0.02～0.03％的MgSO4，控制含水量40～50％，作为制备菌肥生产的固体培养基，灭菌后分装到已灭菌的发酵盒中，控制通气量65～75％，接种液体菌种，34～36℃条件下进行固体发酵培养40‑60h，发酵结束后将其拌匀，即得青枯病植物疫苗菌菌肥。本发明采用固态发酵方式，利用微生物发酵床养猪垫料作为固态发酵培养基成份之一，即可为菌株发酵提供所需养分，降低生产成本，又可降低农副产品废弃物对环境的污染。

Description

青枯病植物疫苗生产菌FJAT-1458的发酵方法
技术领域
本发明属于微生物发酵领域，具体地说，涉及一种青枯病植物疫苗生产菌FJAT-1458的发酵方法。
背景技术
由青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的作物青枯病是一种毁灭性的土传病害。目前对作物青枯病的防治尚未有理想的药剂，由于青枯病原菌为兼性寄生，品种抗性利用难度很大，使得该病害的防治一直是一大难题。在自然界中，青枯雷尔氏菌存在丰富的致病力分化，即强致病力、无致病力和过渡型菌株。研究发现青枯雷尔氏菌无致病力菌株具有免疫接种的功能，苗期预先接种其就会侵入植株体内，并随着植株的生长在体内繁殖，通过竞争生长阻碍病原菌的侵入、从而抑制病害发生。因此，无致病力菌株可用作为“植物疫苗”，在作物青枯病防治中具有重要的生防应用潜力。
福建省农业科学院农业生物资源研究所经多年研究获得一株性状稳定无致病力青枯雷尔氏菌(plant vaccin avirulent strain FJAT-1458)，研究该菌株的发酵工艺和生产工艺，并研制出青枯免疫液体接种剂“鄂鲁冷特”，对番茄的盆栽苗试验防效均达90％以上，田间防效达75％以上。在设施番茄示范应用中比较植物疫苗、生防菌制剂及化学农药对番茄青枯病防治效果，结果表明，植物疫苗能较好地抑制番茄青枯病的发生，其防效(77.45％)与化学农药-农用链霉素(77.23％)相当，配合生防菌“安地”施用，效果更佳，防效达81.81％，具有良好应用潜力。
菌株生产发酵常采用液体发酵或液固双向发酵。在发酵设备和工艺方面，虽深层液体发酵工艺都较为成熟，但用于农用微生物制剂的生产，存在成本高、代谢物不能充分利用、有废液排放等弊端。而固态发酵具湿度低，能耗低，培养基来源广泛等优越性，特别适宜发展中国家生物农药的有效生产。
然而，目前常用固态发酵原料为麸皮、米糠、黄豆粉饼、花生粉饼等农业副产物，存在价格高、高温灭菌后粘度增加、疏松度不够、空隙小、后续接种困难等问题，因此寻找一种新的农业副产物作为固态发酵的主要培养基是必需的。
近几年兴起的微生物发酵床养猪技术产生的副产物--微生物发酵床养猪垫料(以下简称垫料)，它是通过微生物将谷壳，锯末、猪粪、尿等物混合经原位分解发酵而成，富含养分，可考虑作为生产青枯病植物疫苗菌固态发酵原料进行生产。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是针对青枯病植物疫苗菌FJAT-1458，提供一种利用微生物发酵床养猪垫料生产青枯病植物疫苗菌菌肥的方法，采用固态发酵方式，利用微生物发酵床养猪垫料作为固态发酵培养基成份之一，即可为菌株发酵提供所需养分，降低生产成本，又可降低农副产品废弃物对环境的污染。辅以其他常用农业副产物如玉米粉、麦粒、棉籽壳、麸皮、黄豆饼粉，以活菌量为指标，通过单因素法和正交试验优化菌株的培养基成份和培养条件，获得最佳的培养条件，为地青枯病植物疫苗菌菌肥的工业化生产提供理论指导。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
本发明提供一种青枯病植物疫苗生产菌FJAT-1458的发酵方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将青枯病植物疫苗生产菌FJAT-1458接种至SPA液体发酵培养基中，发酵培养得到种子液；
(2)将上述种子液接种至固体发酵培养基中，进行固体发酵培养；
所述固体发酵培养基由垫料与黄豆饼粉按照质量比为6～8:2～4的比例混合后，加入质量百分数为0.04～0.06％的K2HPO4和0.02～0.03％的MgSO4而成。
本发明所述的青枯病植物疫苗生产菌FJAT-1458，经鉴定为青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏日期为2011年08月04日，保藏编号为CGMCC No.5111。
作为优选，所述方法包括如下步骤：
(1)将青枯病植物疫苗生产菌FJAT-1458接种至SPA液体发酵培养基中，并在28-32℃条件下进行发酵培养，得到种子液；
(2)将上述种子液接种至固体发酵培养基中，并在34～36℃、含水量40～50％、通气量65～75％的条件下进行固体发酵培养。
进一步优选，所述方法包括如下步骤：
(1)以1％(v/v)的接种量将青枯病植物疫苗生产菌FJAT-1458接种至SPA液体发酵培养基中，并在30℃、200r/min条件下进行发酵培养48h，作为种子液备用；
(2)以15％(v/g)的接种量将上述种子液接种至固体发酵培养基中，并在34～36℃、含水量40～50％、通气量65～75％的条件下进行固体发酵培养。
其中，所述垫料指微生物发酵床养猪垫料(以下简称垫料)，它是通过微生物将谷壳，锯末、猪粪、尿等物混合经原位分解发酵而成，当发酵程度达三级及以上即可作为该菌固体发酵培养基配料。
所述“发酵程度达三级及以上”可参考文献：养猪微生物发酵床垫料发酵指数的研究[J].宋泽琼,蓝江林,刘波,林娟.福建农业学报,2011，26(6):1069-1075,2011.。
作为优选，所述固体培养基由垫料与黄豆饼粉按照质量比为7:3的比例混合。
作为优选，所述垫料与黄豆饼粉混合后，加入质量百分数为0.05％的K2HPO4和0.025％的MgSO4。
进一步地，在确定了最适固体培养基的基础上，本发明进一步提供了在该固体培养基上进行发酵的最佳条件。
本发明通过实验研究发现，当发酵条件为温度35℃、含水量45％、接菌量15％、通气量70％时，在上述固体培养基上培养40h后，固体菌剂中的活菌量可达4.68×108cfu/g。
本发明进一步提供了由所述发酵方法制备得到的微生物菌剂或菌肥。
本领域技术人员应当理解，在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。
本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。
本发明的有益效果在于：
本发明采用固态发酵工艺，利用微生物发酵床养猪垫料作为固体发酵原料之一，通过单因子和正交设计试验优化进行固体发酵培养基及培养条件的优化，得到了最适宜菌株FJAT-1458固体发酵培养的固体发酵培养基配方与培养条件，进一步得到由菌株FJAT-1458制备的植物固体疫苗菌菌肥。
附图说明
图1为本发明实施例中对固体发酵培养基中碳、氮源载体筛选。
图2为本发明实施例中固体发酵菌体生长曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
1、材料与方法
1.1材料
1.1.1供试菌种
无致病力青枯雷尔氏菌FJAT-1458(Ralstoniasolanacearum FJAT-1458)，由福建省农业科学院农业生物资源研究所提供，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5111。
1.1.2培养基
TTC培养基：葡萄糖5g、蛋白胨10g、水解酪蛋白1g、琼脂17g、H2O 1L，混合灭菌后冷却至60℃左右，加入TTC，使其终浓度为0.005％(W/V)。SPA培养基：蔗糖20.0g、蛋白胨5.0g、K2HPO4 0.5g、MgSO40.25g、H2O 1L、pH 7.0。优化培养基原料：玉米粉、麦粒、棉籽壳、麸皮、黄豆饼粉、均购自农贸市场；蔗糖、蛋白胨、K2HPO4、MgSO4均为国药化学纯试剂；垫料来源于琅岐岛某猪场，使用年限为一年。
1.2方法
以1％(v/v)接种量将SPA培养基培养的种子液接种到已优化获得最佳液体培养基中(250mL三角瓶装液35mL)，30℃、200r/min培养48h，作为固体发酵的接种液备用。
1.2.1固体发酵基础培养基筛选
将玉米粉、麦粒、棉籽壳、麸皮、黄豆饼粉等5种原料分别与垫料按3:7(质量比)两两组合，设置为处理1、处理2、处理3、处理4、处理5共5个处理(表1)，每组无机盐添加量K2HPO40.05％、MgSO4 0.025％，最终培养基含水量45％，3L一袋，灭菌备用。将容积为12L的长方体容器用清水洗净晾干，酒精擦洗消毒后再紫外灭菌30min。将已灭菌的培养基倒到已灭菌容器中，5％(v/g)接种量接种以上制备的发酵液，容器口敷上保鲜膜，30℃静置培养，每隔24h在无菌环境下翻动一次，培养72h后，称取固体发酵物5g溶于50mL无菌水中进行活菌含量检测，活菌计数采用平板菌落计数法，选用TTC培养基，每处理3次重复。
表1固体发酵基础培养基的筛选各处理组
1.2.2固体发酵培养基成分的正交试验优化
根据筛选的主基质结果，以垫料、麸皮、黄豆饼粉为影响因子，采用L9(34)正交表进行三因素三水平正交试验(培养基中另含K2HPO4 0.05％、MgSO4 0.025％，含水量45％)，试验因素水平设置见表2，培养条件及活菌检测方法同1.2.1。
表2固体发酵培养基优化正交试验设计因素水平
1.2.3固体发酵培养条件的正交试验优化
在上述优化的最佳固体发酵培养基基础上，以发酵温度、含水量、接种量、通气量为影响因子，采用L9(34)正交表进行三因素三水平正交试验(培养基中另含K2HPO4 0.05％、MgSO4 0.025％)，试验因素水平设置见表3，培养条件及活菌检测方法同1.2.1。通过正交试验计算K值和极差值R，优化固体发酵最佳培养条件。
表3固体发酵培养条件正交试验设计因素水平
1.2.4固体发酵周期筛选
以优化后的固体培养基成分及培养条件，进行该菌固体发酵培养，分别在发酵第16、40、64、88、112、136h时取样测固体发酵产物含菌量，优化该菌固体发酵最佳周期。活菌检测操作方法同1.2.1，重复3次。
2、结果与分析
2.1固体培养基成分筛选
不同培养基成分对FJAT-1458菌的固体发酵影响显著(图1)，其中垫料:黄豆饼粉为7:3显著高于其他处理组(P＜0.05)，发酵72h固体发酵物含菌量为1.87×107cfu·g-1；其次是垫料:麸皮＝7:3(处理组4)，发酵72h固体发酵物含菌量为5.67×106cfu·g-1；其他处理组固体发酵物菌含量在(2.13-7.50)×105cfu·g-1。故选黄豆饼粉和麸皮为与垫料混合配制培养基的主成分进一步进行培养基配方筛选。
2.2固体培养基成分优化正交试验
在2.1基础上，以黄豆饼粉、麸皮和垫料为培养基主成分，采用L9(34)正交表进行四因素三水平正交试验，极差大小(R值)结果显示(表4)，黄豆饼粉对固体发酵产菌量影响最大，其次是垫料和麸皮。K值分析结果显示，理论上产菌量最大的组合为A2B1C2，与试验中产菌量最大的组合一致，固体发酵产菌量为1.68×108cfu·g-1，故选垫料:黄豆饼粉＝7:3(质量比)，K2HPO40.05％、MgSO40.025％为FJAT-1458菌固体发酵最佳培养基配方。
表4菌株固体发酵培养基配方正交实验结果
备注：Ki为各因素第i水平组在试验组对应试验结果指标总和；ki为Ki的平均值。极差R为ki最大值和最小值的差。
2.3固体发酵条件优化正交试验
在优化的固体培养基基础上，以发酵温度、含水量、接种量、通气量4个为影响因子进行正交试验，极差大小(R值)结果显示(表5)，菌剂的接种量对该菌的固体发酵产菌量影响最大，其次为通气量、温度、含水量。K值分析结果显示，理论上产菌量最大的组合为A3B1C3D2，与试验中产菌量最大的组合一致，固体发酵产菌量为2.97×108cfu·g-1，故选FJAT-1458固体发酵最佳条件为温度35℃、含水量45％、接菌量15％、通气量70％。
表5菌株固体发酵培养基配方正交实验结果
备注：Ki为各因素第i水平组在试验组对应试验结果指标总和；ki为Ki的平均值。极差R为ki最大值和最小值的差。
2.4固体发酵菌体生长曲线
利用优化后的培养基和培养条件，对菌株FJAT-1458固体发酵产菌量进行实验，结果显示(图2)，随着培养时间的延长，产菌量逐渐递增后减少。培养40h时产菌量最高，为4.68×108cfu·g-1，其次是64h时产菌量为4.33×108cfu·g-1；两者差异不显著(P﹥0.05)，但均显著高于其发酵周期(P﹤0.05)。其他发酵周期固体菌剂含量为(1.69-14.07)×107cfu·g-1。综合分析选培养40h为该菌固体发酵的最佳培养周期。
本发明在实验室用小体积法对植物疫苗菌FJAT-1458培养基的组成及其培养条件进行了优化。优化后的配方成本较低，为下一步中试生产提供技术支撑。优化后的发酵培养基配方和发酵条件是否符合工业化大规模生产还需要进行大体积发酵罐实际验证。接下来还将进一步对固态发酵菌剂的田间应用做进一步的研究。
应当理解的是，对上述实施例所用试剂或原料的用量进行等比例扩大或者缩小后的技术方案，与上述实施例的实质相同。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.一种青枯病植物疫苗生产菌FJAT-1458的发酵方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)将青枯病植物疫苗生产菌FJAT-1458接种至SPA液体发酵培养基中，发酵培养得到种子液；
(2)将上述种子液接种至固体发酵培养基中，进行固体发酵培养；
所述固体发酵培养基由垫料与黄豆饼粉混合后，加入K2HPO4和MgSO4而成。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)将青枯病植物疫苗生产菌FJAT-1458接种至SPA液体发酵培养基中，并在28-32℃条件下进行发酵培养，得到种子液；
(2)将上述种子液接种至固体发酵培养基中，并在34～36℃、含水量40～50％、通气量65～75％的条件下进行固体发酵培养；
所述固体发酵培养基由垫料与黄豆饼粉按照质量比为6～8:2～4的比例混合后，加入质量百分数为0.04～0.06％的K2HPO4和0.02～0.03％的MgSO4而成。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)以1％的接种量将青枯病植物疫苗生产菌FJAT-1458接种至SPA液体发酵培养基中，并在30℃、200r/min条件下进行发酵培养48h，作为种子液备用；
(2)以15％的接种量将上述种子液接种至固体发酵培养基中，并在34～36℃、含水量40～50％、通气量65～75％的条件下进行固体发酵培养。
4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述固体培养基由垫料与黄豆饼粉按照质量比为7:3的比例混合后，加入质量百分数为0.04～0.06％的K2HPO4和0.02～0.03％的MgSO4而成。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述固体培养基由垫料与黄豆饼粉按照质量比为7:3的比例混合后，加入质量百分数为0.05％的K2HPO4和0.025％的MgSO4而成。
6.根据权利要求1～3和权利要求5任一项所述的方法，其特征在于，在35℃、含水量45％、通气量70％的条件下进行固体发酵培养，培养时间为40～60h。
7.由权利要求1～6任一项所述方法制备得到的微生物菌剂或菌肥。
8.权利要求7中所得微生物菌剂或菌肥，其特征在于，所述微生物菌剂或菌肥含有垫料，所述垫料为发酵程度达三级及以上的微生物发酵床养猪垫料。
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