CN106591156A - 一株黑附球菌fxz2及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种丝状真菌黑附球菌(Epicoccum nigrum)FXZ2,其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC NO.13573;将该菌株应用于重金属铅和镉污染的生物修复中,实验证明黑附球菌FXZ2对铅和镉具有高耐受性和高吸附性,该菌株的死菌体吸附镉的能力高于活性菌体,活性菌体吸附铅的能力高于死菌体;在重金属污染胁迫下,该菌株能显著促进植物生长,并对镉具有较好的累积能力,适合大面积重金属镉污染土壤的原位修复。
Description
技术领域
本发明属于环境治理领域,具体涉及一种黑附球菌(Epicoccum nigrum)FXZ2在重金属铅和镉污染的生物修复中的应用。
背景技术
随着科技的发展和人们生活水平的不断提高,生态系统中重金属污染越来越严重,重金属污染的治理已经成为亟待解决的重大环境问题。污染环境的重金属主要是砷、镉、铬、铜、镍、银、钒、锌、铅、汞(Ahmed et al., 2015),其来源有两种:一种是自然产生的重金属,一般不会对环境造成污染;另一种是人为产生的,这是环境重金属污染的主要原因。日常生活、工业生产、农业径流和大气沉降产生的重金属以离子形态或颗粒形态进入生态系统,随后通过食物链和饮水对人类及其他动植物造成危害(Zhang et al., 2008;胡春华等,2010)。例如,长期饮用和食用被重金属污染过的水和食物会导致人类患皮肤病、高血压、心血管疾病和癌症等(Zhang et al., 2015)。由于铅具有熔点低、密度高、抗腐蚀、易于机械加工等特点而被广泛应用于国民经济各个领域,而被应用的这些铅只有1/4被重新回收利用,其余大部分以各种形式排放到环境中造成污染,工业废水、废渣、废气的排放己成为水体、土壤和大气中铅的主要污染源,动植物原料、食品添加剂、接触食品的管道、容器、包装材料、加工松花蛋用黄丹粉(PbO)等,都会引起铅污染(李辉,2005)。金属镉(Cd)在工农业生产上具有非常重要的作用,其广泛应用于有色金属采选和冶炼、电镀工业、染料工业、电子工业、农药和食品添加剂生产等行业,大量的镉及其化合物随生产产生的废水、废气、废渣排放到环境中,造成大气、土壤、农作物及水产品的污染(冯宏等,2013)。在生态系统中,铅镉污染对人类和生态环境均有很大的危害,对植物而言,会导致其产量下降,严重的甚至会死亡;对人和动物而言,铅镉顺着食物链进入人体和动物体内,并不断积累。铅积累过量会导致肾脏衰竭、智力下降等中毒症状;镉积累过量可能会导致“痛痛病”,引起肾小球功能衰竭等疾病。
目前治理水体中铅、镉等重金属污染的方法包括化学沉淀法、氧化还原法、电化学法、离子交换法、膜分离法和生物吸附法等,其中生物吸附法因其来源广、费用低、对环境影响小、效率高等优点受到了广泛关注(姜烛等,2008;廖兴盛等,2013;郑彤等,2013;王艺霖等,2015)。研究表明,细菌、真菌和藻类都对重金属离子有较好的吸附能力(刘云国等,2008)。在众多生物吸附剂中真菌材料具有生物量大、重金属吸附量大、操作简单、易于工业化等特点,是重金属污水治理中的研究热点(Sun et al., 2015)。其中的酵母菌、根霉属、毛霉属、曲霉属、青霉属、木霉属等真菌在重金属污染修复中得到了广泛应用(姚远等,2015)。
植物内生真菌是真菌的重要组成部分,是指在其生活史的一定或全部阶段生活于健康植物组织和器官内部,而不使宿主植物表现出明显感染症状的真菌,广泛定殖于各种生境的各类植物中(Petrini et al., 1991)。在重金属污染地区的植物中内生真菌也普遍存在,同时因这些植物体内重金属含量一般较高,所以分离得到的内生菌一般都具有特定的重金属耐受性,是真菌吸附材料的重要来源之一(Deng et al., 2011);目前未见黑附球菌在吸附重金属铅和镉中的应用报道。
发明内容
本发明的目的是在于提供一株丝状真菌黑附球菌(Epicoccum nigrum)FXZ2,其于2016年12月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,保藏编号为CGMCC NO.13573。
本发明另一目的是提供黑附球菌FXZ2的新用途,即在重金属铅和镉污染的生物修复中的应用,本发明所提供的黑附球菌FXZ2经实验验证对铅、锌、镉具有较高耐受性,在实验室条件下可以高效去除污染水体中的铅和镉;同时,接种该内生真菌可显著促进小花南芥植物在重金属胁迫条件下的生长,并增强植物对镉的累积量,显示了本发明所提供的丝状真菌在重金属污染环境(土壤及水体)的生物修复过程中具有广阔的应用前景。
为了实现以上目的,本发明采取以下技术措施:
A、采集生长于重金属污染环境的小花南芥植物样品,于自来水下冲洗干净;
B、将植物样品分为根、茎、叶三部分进行表面消毒,首先用体积分数为75%的乙醇浸泡2min,无菌水冲洗3次,再用有效氯浓度为5%的次氯酸钠浸泡2min,无菌水冲洗3-5次,用滤纸吸干表面水分;将根、茎、叶组织块剪成2×2mm的片段并贴于含有0.5g/L的硫酸链霉素和青霉素的PDA培养基上,25℃培养45天,隔天观察,见组织块周围有菌落长出则挑取、分离纯化后获得该植物的内生真菌菌株;
C、将分离得到的内生真菌菌株接种于PDA平板上,25℃培养5天后,用打孔器沿菌落边缘打孔得到4.4mm的菌块,再将该菌块接种到含Pb2+(9.66 mmol/L)、Zn2+(46.20 mmol/L)或Cd2+(0.50 mmol/L)的PDA培养基上(以Pb(NO3)2、ZnSO4·7H2O和3CdSO4·8H2O分别配制获得)和不含重金属的PDA培养基上,25℃进行培养,隔天测量菌落直径,每个样品3个重复。若菌株在含有重金属培养基上的菌落直径占到菌株在不含重金属培养基上的菌落直径的50%及以上,则判定该菌株为重金属耐受菌;
D、经分离筛选后,将对重金属具有较强、稳定抗性的菌株保存于PDA斜面上备用;通过上述方法,将分离获得的丝状真菌命名为FXZ2;
E、丝状真菌FXZ2的鉴定:
丝状真菌FXZ2形态学特征:菌丝较粗而长,菌落较大,没有局限性,菌落与培养基连接紧密,不易挑取;菌落平展,初点状生长,棉絮状,白色,后期粉红色、红色、黄褐色。显微镜下清晰可见分生孢子梗紧密或分散,分生孢子梗短粗。分生孢子从分生孢子梗顶端膨大处生出,分生孢子球形,大小变异大,有隔膜,光滑,无色或极淡褐色,有瘤状突起或有褶纹。
分子鉴定:采用PowerSoil试剂盒提取该菌株总DNA,经检测后送测序公司进行序列测定,所获得的序列与NCBI上序列进行Blast比对;
结合形态学特征和分子分析结果,最终将该菌株鉴定为黑附球菌(Epicoccum nigrum);该菌株保存和活化所用的培养基均为PDA培养基。
本发明以从重金属污染地区植物中分离得到的内生真菌黑附球菌FXZ2的菌丝体作为吸附材料,进行重金属铅、镉污染水体的吸附实验,深入探讨内生真菌对重金属铅、镉的吸附能力;同时,将内生真菌黑附球菌FXZ2接种到盆栽的小花南芥植物中,探讨其对重金属铅、镉污染土壤植物修复的影响作用,即进行了黑附球菌FXZ2对盆栽小花南芥生长及重金属累积能力的影响研究,为环境重金属污染修复提供真菌菌种资源和理论依据,具有重要的理论和实际研究价值。
本发明与现有技术相比,具有以下优点和效果:
(1)菌株来源于重金属污染环境,对重金属铅、锌、镉的耐受性极强,通过简单液体发酵即可获得大量用于环境污染修复的菌丝体,易获取,成本低廉。
(2)菌株作为重金属吸附剂,用量较少,对铅和镉的吸附效率高,不同生物活性状态菌体对不同的重金属显示出较强的吸附能力,特别是活菌体能高效去除水体中的铅,死菌体能高效去除水体中的镉,选择性强,具有较好应用前景。
(3)菌株作为吸附剂通过简单过滤便可实现从液体中分离,不会产生二次污染,具有广阔的应用前景。
(4)菌株接种植物后,能够定植于植物体内,并能显著促进植物生长,增强植物对镉的累积量。
附图说明
图1为黑附球菌FXZ2在含铅平板上的生长情况,从左到右平板中铅浓度依次为10mmol/L、40 mmol/L、80 mmol/L;
图2为黑附球菌FXZ2在含锌平板上的生长情况,从左到右平板中锌浓度依次为10mmol/L、40 mmol/L、80 mmol/L;
图3为黑附球菌FXZ2在含镉平板上的生长情况,从左到右平板中镉浓度依次为60mmol/L、140 mmol/L、120 mmol/L;
图4为黑附球菌FXZ2两种不同活性状态菌体及其不同含量对重金属镉吸附率的影响;
图5为黑附球菌FXZ2两种不同活性状态菌体及其不同含量对重金属铅吸附率的影响。
具体实施方式
以下叙述是根据本发明方案的实施例;应该说明的是,本发明的实施例对于本发明只有说明作用,而没有限制作用。本发明所涉及的其他各种实验操作,均为本领域的常规技术,文中没有特别说明的部分,本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等加以实施。
实施例1:黑附球菌FXZ2的筛选、分类及鉴定
A、采集生长于重金属污染地的小花南芥植物样品,于自来水下冲洗干净;
B、将植物样品分为根、茎、叶三部分进行表面消毒,首先用体积分数为75%的乙醇浸泡2min,无菌水冲洗3次,再用有效氯浓度为5%的次氯酸钠浸泡2min,无菌水冲洗3-5次,用滤纸吸干表面水分。将根、茎、叶组织块剪成2×2mm的片段并贴于含有0.5g/L的硫酸链霉素和青霉素的PDA培养基上,25℃培养45天,隔天观察,见组织块周围有菌落长出则挑取、分离纯化后获得该植物的内生真菌菌株;
C、将分离得到的内生真菌菌株接种于PDA平板上,25℃培养5天后,用打孔器沿菌落边缘打孔得到4.4mm的菌块,再将该菌块接种到含Pb2+(9.66 mmol/L)、Zn2+(46.20 mmol/L)或Cd2+(0.50 mmol/L)的PDA培养基上(以Pb(NO3)2、ZnSO4·7H2O和3CdSO4·8H2O分别配制获得)和不含重金属的PDA培养基上,25℃进行培养,隔天测量菌落直径,每个样品3个重复。若菌株在含有重金属培养基上的菌落直径占到菌株在不含重金属培养基上的菌落直径的50%及以上,则判定该菌株为重金属耐受菌;
D、将经分离筛选获得的、对重金属具有较强稳定抗性能力的菌株保存在PDA斜面上备用;
通过上述方法筛选得到一种耐受铅、锌及镉的内生真菌,并将其命名为FXZ2;
E、丝状真菌FXZ2鉴定;
丝状真菌FXZ2形态学特征:菌丝较粗而长,菌落较大,没有局限性,菌落与培养基连接紧密,不易挑取;菌落平展,初点状生长,棉絮状,白色,后期粉红色、红色、黄褐色。显微镜下清晰可见分生孢子梗紧密或分散,分生孢子梗短粗。分生孢子从分生孢子梗顶端膨大处生出,分生孢子球形,大小变异大,有隔膜,光滑,无色或极淡褐色,有瘤状突起或有褶纹。
分子鉴定:采用PowerSoil试剂盒提取该菌株总DNA,经检测后送测序公司进行序列测定,所获得的序列与NCBI上序列进行Blast比对,其序列与黑附球菌(Epicoccum nigrum)的同源性达99%,并结合该菌株的形态特性确定该菌株为黑附球菌(Epicoccum nigrum)。
实施例2:黑附球菌FXZ2对不同重金属耐受性水平检测
将筛选出来的黑附球菌FXZ2于PDA平板活化后,分别接种到含不同重金属浓度梯度的PDA平板上(Pb、Zn:1 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L、30 mmol/L、...80 mmol/L;Cd:1mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L、30 mmol/L、...220 mmol/L),25 ℃培养7 d后,观察菌株在不同重金属含量PDA平板上的生长情况(见图1、2、3),并以不含重金属PDA平板上的生长作为对照,每组设置三个重复,获得各重金属对菌株的最小抑制浓度(能够抑制菌株生长的最低浓度)。
不同重金属对黑附球菌FXZ2的最小抑菌浓度分别为:镉(Cd2+)220 mmol/L、锌(Zn2 +)80 mmol/L、铅(Pb2+)80 mmol/L;本实验证实了本发明提供的黑附球菌FXZ2对铅、锌、镉都具有较好抗性,其中对镉的抗性极其突出,最小抑制浓度高达220 mmol/L。
实施例3: 黑附球菌FXZ2对重金属镉污染水体的吸附作用,其反应过程是:
A、将黑附球菌FXZ2接种于PDA平板上,培养3-6天,刮取菌丝体转接于马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)中,130-150r/min,28℃培养3-6天;
B、将液体培养基转移至50mL离心管中,7000r/min,离心10min,得到菌丝体。用无菌水冲洗3-5次,7000r/min,离心10min,得到活菌丝体;
C、从活菌中取部分尽量除去水分,放于烘箱中80℃烘干至恒重测得菌体含水量,并将烘干的死菌磨成粉状备用;
D、分别用两种不同生物活性状态的菌体对含镉的水体进行吸附实验,吸附体系设定为,镉溶液pH6.9,Cd2+浓度为20 mg/L,分别投加剂量为0.05、0.1、0.15、0.2 g/100mL(干重)的活菌和死菌,在130 r/min,28℃的条件下反应12h;
E、完成吸附试验后,离心去除菌丝体得到吸附后的重金属溶液,通过火焰原子吸收分光光度计对吸附前后溶液中镉离子浓度进行测量,得到菌株对水体中镉离子的去除效率及两种状态下菌的吸附能力;
图4结果表明,无论菌丝灭活与否,菌株对镉的吸附率随菌丝量的升高而升高,死菌比活菌吸附镉的能力强,加入0.5g/100mL死菌丝体时,吸附率达高达82.78%,加入0.05 g/100mL的死菌丝体得到最大吸附量为22.14 mg/g;本实验证实了本发明所提供的黑附球菌FXZ2在实验室条件下不同活性状态下都能有效吸附重金属镉,具有修复镉污染土壤和水体的能力。
实施例4:黑附球菌FXZ2对重金属铅污染水体的吸附作用,其反应过程是:
除铅溶液pH为6.34外,其操作方法及具体实验参数同实施例3;图5结果表明,无论菌丝灭活与否,菌株对铅的吸附效果均较好,但活菌体比死菌体吸附铅的能力更强,只加入0.05g/100mL活菌体,吸附率就达到了91.28%,而加入0.5g/100mL活菌体时,吸附率高达96.95%,加入0.05g/100mL的活菌体得到最大吸附量为25.74mg/g;本实验证实了本发明所提供的黑附球菌FXZ2在实验室条件下的不同活性状态下都能高效吸附重金属铅,具有修复铅污染土壤和水体的能力。
实施例5:接种黑附球菌FXZ2对盆栽小花南芥生长及重金属累积的影响研究
本实验旨在证明本发明所提供的丝状真菌FXZ2在重金属污染土壤中对植物生长及植物重金属污染土壤修复中的促进作用;以小花南芥(Arabis alpina)为供试植物,其实验过程如下:
A、小花南芥无菌苗的准备:小花南芥种子于2014年11月采自云南省曲靖市会泽县者海镇窝岩厂村旁废弃矿渣堆(北纬26°28′17″,东经103°37′34″),于4℃保存备用。按V腐殖土:V珍珠岩 = 7:3的比例制备混合土壤,121℃灭菌15min,隔天重复1次,共灭菌3次备用。随机挑出种子200粒,按下列程序进行表面消毒:体积分数75%的乙醇漂洗2 min、无菌水冲洗3次;有效氯浓度为5%的NaClO溶液漂洗1min、无菌水冲洗3次,置于无菌滤纸上吸干水分。向无菌花盘中加入150g无菌混合土壤并铺平,将表面消毒后的种子均匀地播撒在其中,置于室温(23-25℃)下、自然光周期进行萌发,每2d浇100mL无菌水。
B、接种剂及接种处理:将黑附球菌FXZ2活化后,在PDA平板上培养5天,之后用无菌手术刀刮下菌丝体。取20g菌丝体,用无菌剪刀剪碎,加入100mL无菌水中,混匀,制成菌悬液。将菌悬液平均分为2组(PA和PB,PB于121℃灭菌15min备用)。
C、矿区土壤盆栽实验:
①矿区土壤于2014年11月采自云南省曲靖市会泽县者海镇窝岩厂村旁废弃矿渣堆(北纬26°28′17″,东经103°37′34″)。采回的土壤经自然风干后,过0.5 cm筛以去除石块和植物残渣等,一部分送去进行重金属含量测定(土壤全量Pb、Zn、Cd分别为2250.00±31.25、31739.03±453.55、13.73± 0.17 mg/kg)。另一部分按V土壤: V珍珠岩 = 7:3的比例制备混合土壤用于盆栽实验。将100 g混合土壤装于7×4cm的小瓶中,密封后于121℃下灭菌15 min,隔天重复1次,共灭菌3次备用。选取长势一致的小苗进行移栽,种植密度为2株/瓶。之后将所有盆栽植物随机分为2组(Group I 和Group II),每组10个重复;
②将上述制备好的PA和PB分别接种到Group I(实验组)和Group II(对照组)的叶片及根部,每瓶接入5mL,在移栽后的第7天和15天再各接菌一次;将盆栽小苗置于人工气候箱中进行培养(条件为24/20℃ 白天/夜晚循环,60-70%的相对湿度,光照为15 h (300 µE))。培养期间每2d浇1次无菌水,每7 d浇1次Hogland培养液(浓度0.09%),每盆浇灌10mL。同时观察小苗生长、叶片变黄及死亡的情况。60 d后收获,并测定植物株高、根长、干重及土壤和植物中总铅、总锌、总镉的含量。
盆栽实验结果如表1所示,在Pb、Zn、Cd等混合重金属胁迫条件下,接种菌株FXZ2对宿主植物小花南芥的促生长效果显著,实验组植物的株高、根长、干重均明显高于对照组(P< 0.05, 独立样本T检验),证明了本发明所提供的丝状真菌FXZ2在含重金属污染土壤中对植物生长具有保护能力;重金属含量测定结果如表2所示,FXZ2可促进植物对镉的富集,达到对镉污染土壤进行修复的目的。
表1 菌株FXZ2对小花南芥在重金属胁迫条件下生长的影响
注:平均值±SE,n=10。方差分析结果: *号代表实验组与对照组有显著性差异,p<0.05,(α=0.05,T-test)。
表2 菌株FXZ2对小花南芥在重金属胁迫条件下重金属累积量的影响
注:平均值±SE,n=10。方差分析结果: *号代表实验组与对照组有显著性差异,p<0.05,(α=0.05,T-test)。
Claims (2)
1.一株黑附球菌(Epicoccum nigrum)FXZ2,其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC NO.13573。
2.权利要求1所述的黑附球菌FXZ2在重金属铅和镉污染的生物修复中的应用。
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