CN108485998A - 一株高效活化矿质元素和重金属镉的土壤杆菌t29 - Google Patents

一株高效活化矿质元素和重金属镉的土壤杆菌t29 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株高效活化矿质元素和重金属镉的土壤杆菌（Agrobacterium sp.）T29；所述菌株于2018年1月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），菌种保藏编号为GDMCC No：60321；所述土壤杆菌（Agrobacterium sp.）T29可高效活化矿质元素钾和磷以及重金属镉。利用本发明所述土壤杆菌（Agrobacterium sp.）T29菌株在根际活化土壤矿物养分，促进植物生长的同时，能够有效溶解土壤镉，有效提高超累积植物修复土壤重金属镉的效率。利用本发明土壤杆菌（Agrobacterium sp.）T29菌株活化土壤重金属镉过程中，不会产生任何对环境不利的排放污染物，使其在土壤改良中具有极大的应用前景。

Description

一株高效活化矿质元素和重金属镉的土壤杆菌T29
技术领域
本发明涉及土壤污染生物处理技术领域，更具体地，涉及一株高效活化矿质元素和重金属镉的土壤杆菌（Agrobacterium sp.）T29。
背景技术
我国农田土壤重金属污染严重，其中镉是主要污染物。镉超富集植物提取是土壤重金属修复最具前景的技术途径之一。东南景天、龙葵、伴矿景天等是国内报道最多的用于土壤镉污染提取修复的超富集植物。然而这些超富集植物存在的共同问题是茎叶对弱酸性或中性土壤镉的富集系数比酸性土壤大幅度下降，提取效率低，因而严重限制了它们的实际工程应用。弱酸性或中性土壤镉的活性较低是影响提取效率的关键因素。采用细菌活化土壤镉、促进植物吸收，是强化植物修复土壤镉的有效途径。
现有报道的强化植物提取修复菌剂主要为重金属耐性菌，从矿区及重度污染的土壤中筛选抗重金属污染微生物的报道较多，包括伯克霍尔德氏菌属，假单胞菌属和芽孢杆菌属。
根际促生菌可以通过活化土壤矿质养分等途径为植物生长提供养分，已经成为农业生产中重要的微生物肥料。采用根际促生菌活化土壤镉，不仅可以促进植物镉吸收，而且可以给修复植物提供矿质养分。已有报到，采用溶磷菌弯曲芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌活化土壤镉。
而现有技术中，从农田土壤中筛选出土壤杆菌，并专门利用土壤杆菌活化重金属镉的研究未见报道。
发明内容
本发明为了解决上述现有技术的缺陷和不足，提供一株高效活化矿质元素和重金属镉的土壤杆菌（Agrobacterium sp.）T29菌株；利用所述土壤杆菌（Agrobacterium sp.）T29菌株在根际活化土壤矿物钾养分，促进植物生长的同时使土壤重金属镉从惰性态转化为生物可利用态，有效提高植物修复土壤重金属镉污染的效率。
本发明的第一个目的是提供一株高效活化矿质元素和重金属镉的土壤杆菌（Agrobacterium sp.）T29。
本发明的第二个目的是提供土壤杆菌（Agrobacterium sp.）T29在污染土壤修复中的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
一株高效活化矿质元素和重金属镉的土壤杆菌（Agrobacterium sp.）T29菌株，所述菌株于2018年1月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏编号为GDMCC No：60321，分类命名号为Agrobacterium sp. T29；保藏地址为中国广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
所述土壤杆菌（Agrobacterium sp.）T29菌株分离自受重金属镉污染的苋菜根际土壤中，其菌落呈圆形，边缘整齐，乳白色，表面光滑，菌体形状呈杆状，长约1～2 µm，无芽孢，有鞭毛，菌体呈串状排列；革兰氏染色为阴性。所述菌株的生理生化鉴定实验结果如下：葡萄糖氧化（阳性）、糖醇发酵（阳性）、硝酸盐还原（阳性）、接触酶（阳性）、氧化酶（阳性）、明胶液化（阳性）、葡萄糖发酵（阴性）、3-酮基乳糖（阴性）、2%NaCl抗性（阴性）、石蕊牛奶（胨化）、吲哚试验（阴性）、脲酶试验（阴性）。
进一步地，所述菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO：1所示。
进一步地，所述矿质元素为磷和/或钾。
同时，本发明还请求保护所述土壤杆菌（Agrobacterium sp.）T29在制备高效活化矿质元素和/或重金属镉的微生物菌剂中的应用。
本发明还提供一种高效活化矿质元素和/或重金属镉的微生物菌剂，所述微生物菌剂包含土壤杆菌（Agrobacterium sp.）T29；是通过发酵等生物工程手段制备得到，所述菌剂剂型包括颗粒剂、粉剂、溶液、悬乳液或棒剂。
优选地，所述土壤杆菌（Agrobacterium sp.）T29的菌落数为7×10^8CFU/mL。
本发明将菌落数为7×10^8CFU/mL的Agrobacterium sp. T29菌株菌液按培养基体积的2%（2mL）接种于解钾培养基中，结果显示接菌后培养液中的钾含量为2.78mg/L，比对照高出1.54倍，说明本发明土壤杆菌（Agrobacterium sp.）T29溶钾能力较强。
本发明将菌落数为7×10^8CFU/mL的Agrobacterium sp. T29菌株菌液按培养基体积的2%接种于含Ca3(PO4)2与CdCO3的功能培养基中，结果显示接菌条件下滤液中的磷和镉含量分别为15.53mg/L和10.81mg/L，相比对照分别增加了42.0%和146.6%；同时T29的溶磷率和溶镉率分别为11.9%和34.8%，说明T29具有较强的溶磷和溶镉的能力。进一步试验表明，本发明土壤杆菌（Agrobacterium sp.）T29在充足的营养条件下，T29通过分泌自身代谢产物，将土壤中的难溶态Cd活化为水溶态，并且随着碳源含量的不断增加，T29对难溶态Cd的活化能力也在不断增强。
由于土壤杆菌（Agrobacterium sp.）T29可充分活化土壤矿质元素-钾和/或磷，挺高植物对矿质元素的吸收，促进植物生长。因此，所述土壤杆菌（Agrobacterium sp.）T29在促进植物生长和/或在制备植物促生长剂中的应用亦在本发明保护范围内。
本发明从根际土壤中筛选出具有活化镉功能的土壤杆菌Agrobacterium sp.，并以Agrobacterium sp.为菌种发酵培养制备得到溶镉菌剂，该溶镉菌剂能够有效溶解土壤主要形态镉，在促进植物生长的同时活化土壤重金属镉，有效地提高了超累积植物龙葵修复土壤重金属镉的效率。
将本发明土壤杆菌（Agrobacterium sp.）T29的菌悬液与与未接菌的进行吸收镉含量对比，超累积植物龙葵上部和根部吸收的镉含量分别比不接菌对照增加 1.29倍和1.87倍。
本发明还请求保护土壤杆菌（Agrobacterium sp.）T29在重金属镉污染土壤修复中的应用，所述菌株于2018年1月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏编号为GDMCC No：60321。
土壤杆菌（Agrobacterium sp.）T29在制备重金属镉污染土壤修复剂中的应用，所述菌株于2018年1月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏编号为GDMCC No：60321。
具体地，所述应用为将土壤杆菌（Agrobacterium sp.）T29活化后制得的菌悬液接入重金属镉污染污染中，再用超累积植物吸收土壤中的隔。
优选地，所述超累积植物为龙葵。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明从农田土壤中分离得到了一株高效活化矿质元素和重金属镉的土壤杆菌（Agrobacterium sp.）T29菌株；所述菌株于2018年1月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），菌种保藏编号为GDMCC No：60321；所述土壤杆菌（Agrobacterium sp.）T29可高效活化矿质元素钾和/或磷以及重金属镉。利用本发明所述土壤杆菌（Agrobacteriumsp.）T29菌株在根际活化土壤矿物钾养分，促进植物生长的同时，能够有效溶解土壤镉，有效提高超累积植物修复土壤重金属镉的效率。利用本发明土壤杆菌（Agrobacterium sp.）T29菌株活化土壤重金属镉过程中，不会产生任何对环境不利的排放污染物，使其在土壤改良中具有极大的应用前景。
附图说明
图1为土壤杆菌（Agrobacterium sp.）T29在钾长石固体培养基上生长3天的形态特征图。
图2为土壤杆菌（Agrobacterium sp.）T29的透射电镜照片图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1 菌株的分离与鉴定
本实施例提供的一株高效溶镉土壤杆菌，是通过以下方式筛选而成：
1、菌株分离
取1L烧杯加入定量去离子水，按筛选培养基配方称取各成分，依次加入水中。将每100mL培养基分装于锥形瓶中，再加入1g 钾长石至培养基中并用稀NaOH溶液调节其pH为7.0～7.5，加入琼脂，包扎，121℃条件下灭菌20min.倒入培养皿中，待培养基冷却后即为固体培养基（平板）。采集受重金属镉污染的苋菜根际土，称取10g新鲜土样于90mL无菌水（内含玻璃珠）中包扎好，转移至摇床于28℃，180r/min振荡20min。制成菌悬液。吸取1mL的菌悬液于9mL无菌水中，吹洗3次，摇匀即为10-2的浓度菌悬液，依次类推至10-7，用无菌移液管分别吸取0.1mL 稀释倍数为10-4、10-5、10-6、10-7的菌悬液于相应编号的平板内，用灭菌冷却后的三角刮刀在平板上旋转涂布于筛选培养基上，28℃倒置培养3～5天。待平板上长出单菌落后，挑取具有溶钾圈的单菌落多次划线纯化（图1），分离获得一株细菌并保存于斜面中，编号T29。所述筛选培养基成分为NaCl 0.3g，MgSO4·7H2O 0.5343g，MnSO4·H2O 0.0227g，(NH4)2SO4 0.5g，FeSO4·7H2O 0.03g，Na2HPO4 2g，葡萄糖10g，琼脂18～20g，去离子水1000mL，pH7.0～7.5。
2、菌株鉴定
（1）透射电镜镜观察鉴定：将纯化后的菌株T29在LB培养基（液体）中进行富集，吸取菌悬液滴到铜片上，静置数分钟，然后用滤纸吸去多余的液体，滴上负染色液，染色1～2min后滤纸吸去负染色液，干燥20min后用于透射电镜观察。图2可见，T29呈杆状，长约1～2 µm，无芽孢，有鞭毛，菌体呈串状排列。
（2）菌株的生理生化鉴定指标包括12项，具体的生理生化鉴定结果如表1所示：
表1 菌株T29的生理生化特性
特征 菌株T29 特征 菌株T29
葡萄糖氧化 + 葡萄糖发酵 -
糖醇发酵 + 3-酮基乳糖 -
硝酸盐还原 + 2%NaCl抗性 -
接触酶 + 石蕊牛奶 胨化
氧化酶 + 吲哚试验 -
明胶液化 + 脲酶试验 -
注：“+”表示反应为阳性，“-”表示反应为阴性。
（3）T29菌株的16S rDNA分子鉴定：提取细菌总DNA，用细菌16S rDNA 通用引物对该菌基因组进行PCR扩增。PCR产物经测序（由上海美吉生物完成测序）后，将测序结果与GenBank 中已报道的其他菌株的16S rDNA 序列进行同源性比对，并选取相关菌种做进化树分析。结合其形态特征和生理生化指标，与土壤杆菌属（Agrobacterium sp.）最为相似，因此所述分离获得的高效溶钾离溶镉细菌T29经鉴定为土壤杆菌（Agrobacterium sp.）。
将该菌株命名为土壤杆菌（Agrobacterium sp.）T29，所述菌株于2018年1月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），保藏编号为GDMCC No.60321，分类命名号为Agrobacterium sp. T29；保藏地址为中国广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
实施例2 土壤杆菌T29对土壤中矿物质钾的活化
将实施例1筛选得到的土壤杆菌通过下述实验证实有较好的活化土壤中矿物质钾（钾长石）的作用。
1、从保存的斜面中挑取土壤杆菌T29菌株，接种于LB培养基（固体）中进行活化，培养24h后。从固体培养基上挑取T29，接种于LB培养基（液体）中进行富集，转移至摇床于28℃，150r/min培养18h。获得富集后的菌液或制成菌剂，通过稀释平板计数法得到菌落数为7×10^8CFU/mL。将富集后的菌液按培养基体积的2%（2mL）接种于100mL解钾培养基中，同时设定不加菌作为对照并设置3个平行，于摇床中28 ℃，150r/min振荡7天。经4000r/min离心10min后，过0.22um滤膜，采用火焰原子吸收测定滤液中的钾含量。所述解钾培养基成分：NaCl 0.3g，MgSO4·H2O 0.3g，MnSO4·4H2O 0.03g，(NH4)2SO4 0.5g，FeSO4·7H2O 0.03g，NaHPO4 2g，钾长石0.3g/L，葡萄糖10g，去离子水1000mL，pH7.0～7.5。LB培养基成分：胰蛋白胨10g；酵母粉5g；NaCl 10g；去离子水1L；10 g琼脂。
2、结果显示，接菌后培养液中的钾含量为2.78mg/L，比对照高出1.54倍，说明本利得到的土壤杆菌T29溶钾能力较强。
实施例3 土壤杆菌T29活化磷酸钙和碳酸镉的能力测定
1、配制功能培养基（无水溶性磷酸根离子和镉离子），将每100mL培养基分装于锥形瓶中，加入0.0668g Ca3(PO4)2与0.0060g CdCO3于培养液中。用稀NaOH溶液调节其pH为7.0～7.5，120℃，30min灭菌，制成溶镉培养基备用。菌悬液制备参考实施例2中的方法，将菌悬液按2%（2mL）的体积接种到溶镉培养基中，同时设定不加菌作为对照，分别设置3个平行，一共6个样品，转移至恒温培养箱于28 ℃,150r/min培养7天。取出，定容至100mL容量瓶，将定容后的培养液经4000r/min离心10min并过0.22um滤膜，采用可见光分光光度计和火焰原子吸收分光光度计分别测定滤液的磷和镉含量。所述功能培养基成分为：NaCl 0.3g，MgSO4·7H2O 0.5343g，MnSO4·H2O 0.0227g，钾长石 0.3g，(NH4)2SO4 0.5g，FeSO4·7H2O 0.03g，葡萄糖1g，去离子水1000mL，pH7.0～7.5。
2、结果表明：接菌条件下滤液中的磷和镉含量分别为15.53mg/L和10.81mg/L，相比对照分别增加了42.0%和146.6%。同时T29的溶磷率和溶镉率分别为11.9%和34.8%，说明T29具有较强的溶磷和溶镉的能力。
实施例4 土壤杆菌T29活化土壤镉的能力测定
将前期采集的镉污染土烘干过100目筛，按水土比10:1，即在100mL不同浓度（2g/L，4g/L，6g/L，8g/L，10g/L）的葡萄糖溶液中加入10g土，设定不接菌为对照，同时设置3个平行，一共18个样品，121℃条件下灭菌20min，菌悬液制备参考实施例2中的方法，将菌悬液按10％体积比（10mL）加入至100mL葡萄糖溶液中，150r/min,28℃恒温振荡培养7天。4000r/min离心10min，定容至100mL容量瓶，121℃条件下灭菌20min并过0.22um滤膜，采用pH计和石墨炉分光光度计分别测定滤液的pH和Cd含量。结果表明：接菌条件下，随着葡萄糖浓度的增加，溶液中的Cd含量也在不断上升，pH值在不断下降，其中接菌处理的10g/L葡萄糖溶液中，Cd含量最大为10ug/L（换算成干重土含量为0.1mg/kg），约为对照的23.9倍，同时其pH值由对照的7.56下降至4.38，呈现强酸性。说明在充足的营养条件下，T29通过分泌自身代谢产物，将土壤中的难溶态Cd活化为水溶态。并且随着碳源含量的不断增加,T29对难溶态Cd的活化能力也在不断增强。
实施例5 高效溶镉菌剂提高超累积植物龙葵对镉的吸收
1、菌液制备；将实施例1的T29菌株从斜面转接至牛肉膏蛋白胨培养基中，置于恒温震荡培养箱中150 r·min-1，28℃培养14h，取菌液离心后用无菌水重悬，置于4℃冰箱中备用。
2、土壤采自受Cd污染农田土，其土壤基本理化性质：pH 6.28，TOC:35.39 g∙kg-1，有效磷含量95 mg∙kg-1，CEC:20.90 cmol∙kg-1，总Cd含量为1.37 mg∙kg-1，其中可交换态Cd0.46mg·kg-1；碳酸盐结合态Cd 0.21 mg·kg-1；铁锰氧化物结合态Cd 0.54 mg·kg-1；有机碳结合态Cd 0.08 mg·kg-1；残渣态Cd 0.08 mg·kg-1。将土壤采集后置于玻璃温室中自然晒干，敲碎混匀备用。选取尺寸为180×210cm的塑料盆，每盆装土1500g，去离子水浇透盆中土壤，放置过夜。
3、龙葵购自沈阳中科院生态所。对种子进行消毒，消毒后的种子种到沙培中，置于光照培养箱中培养。待种子长出3-5片真叶后移出洗净根部，在上述菌种重悬液中浸泡 2h然后移栽到土壤，每盆3株，并将菌液按30 mL·pot-1浇入根区周围，覆土。置于温室中培养，土壤定期浇水保持湿润，待生长至60天收获植株。植物样品烘干经微波消解后用石墨炉原子吸收分光光度计测Cd含量。
4、结果表明，所述土壤杆菌（Agrobacterium sp.）T29菌株能显著促进植株生长，活化植株根际镉，接土壤杆菌T29处理的龙葵吸收镉含量地上部（4.74 mg /Kg）、根部（3.31mg/Kg）分别比不接菌对照（2.07mg/Kg、1.77mg/Kg）增加1.29倍和1.87倍。
序列表
<110> 暨南大学
<120> 一株高效活化矿质元素和重金属镉的土壤杆菌T29
<130> YG18100608AA042
<141> 2018-02-12
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1346
<212> DNA
<213> 土壤杆菌(Agrobacterium sp.)
<400> 1
ctgcctcctt gcggttagcg cactaccttc gggtaaaacc aactcccatg gtgtgacggg 60
cggtgtgtac aaggcccggg aacgtattca ccgcagcatg ctgatctgcg attactagcg 120
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tcagaccagc tatggatcgt cgccttggta ggcctttacc ccaccaacta gctaatccaa 1200
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agtttcccgg agctattccg caggaaaggg tatgttccca cgcgttactc acccgtctgc 1320
cactcccctt gcggggcgtt cgactg 1346

Claims (9)

1. 一株高效活化矿质元素和/或重金属镉的土壤杆菌（Agrobacterium sp.）T29，其特征在于，所述菌株于2018年1月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏编号为GDMCC No：60321。
2. 根据权利要求1所述的土壤杆菌（Agrobacterium sp.）T29，其特征在于，所述菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO：1所示。
3. 根据权利要求1所述的土壤杆菌（Agrobacterium sp.）T29，其特征在于，所述矿质元素为磷和/或钾。
4. 权利要求1所述土壤杆菌（Agrobacterium sp.）T29在制备高效活化矿质元素和/或重金属镉的微生物菌剂中的应用。
5. 一种高效活化矿质元素和/或重金属镉的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂包含权利要求1所述的土壤杆菌（Agrobacterium sp.）T29。
6. 根据权利要求5所述的微生物菌剂，其特征在于，所述土壤杆菌（Agrobacteriumsp.）T29的菌落数为7×10^8CFU/mL。
7. 土壤杆菌（Agrobacterium sp.）T29在重金属镉污染土壤修复中的应用，其特征在于，所述菌株于2018年1月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏编号为GDMCCNo：60321。
8. 土壤杆菌（Agrobacterium sp.）T29在制备重金属镉污染土壤修复剂中的应用，其特征在于，所述菌株于2018年1月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏编号为GDMCC No：60321。
9. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用为将土壤杆菌（Agrobacteriumsp.）T29活化后制得的菌悬液接入重金属镉污染中，再用超累积植物吸收土壤中的隔。
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