CN112358974A

CN112358974A - 一株植物内生真菌黑附球菌fzt214及其应用

Info

Publication number: CN112358974A
Application number: CN202011426140.7A
Authority: CN
Inventors: 李海燕; 李绍仕; 汤雯婷; 毛文沁; 江悦娟
Original assignee: Kunming University of Science and Technology
Current assignee: Kunming University of Science and Technology
Priority date: 2020-12-09
Filing date: 2020-12-09
Publication date: 2021-02-12
Anticipated expiration: 2040-12-09
Also published as: CN112358974B

Abstract

本发明公开了一株黑附球菌（Epicoccum nigrum）FZT214，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.21045；将该菌株运用于促进植物种子萌发、幼苗生长中，实验证明在重金属污染胁迫下，该菌株能够促进植物种子萌发、幼苗生长、增加植物种子产量以及对重金属镉较强的累积能力，适合大面积重金属镉污染土壤Cd的原位修复。

Description

一株植物内生真菌黑附球菌FZT214及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株植物内生真菌黑附球菌（Epicoccum nigrum）FZT214及其在重金属胁迫下促进植物种子萌发及幼苗生长中的应用。

背景技术

由于矿山开采与冶炼、化肥农药的大量使用、农田污灌以及固体废弃物弃置等人类活动，土壤重金属污染越来越严重，土壤中过量的重金属不仅会抑制作物生长，破坏土壤微生物菌群结构，还会通过食物链产生毒性放大作用，严重威胁人类健康，污染土壤修复成为环境研究热点问题之一。在所有修复方法中，植物修复（Phytoremediation）因其原位、环保、费用低、操作简单而在重金属污染土壤修复中展现出较好的应用前景。超累积植物（Hyperaccumulator）也因能超量吸收重金属并能将其运移到植物地上部份而成为植物修复的明星材料，在植物修复中具有极其重要的地位。然而，由于绝大多数超累积植物生长缓慢、生物量低，生长周期长、对重金属富集具有专一性，当土壤中目标重金属含量过高或存在其他重金属时会表现出某些中毒症状，从而制约了超累积植物的应用范围和实际修复效果。因此，提高超累积植物重金属抗性、促进其生长，增加生物量成为植物修复技术亟待解决的难题。

植物内生菌（endophyte）指一类生活在健康植物组织内部而不引起植物组织明显症状改变的微生物。由于内生菌长期生活在植物组织内部，与宿主植物协同进化，植物为内生菌提供生长所需环境和营养物质，内生菌则通过代谢出众多的生物活性物质来促进宿主植物的生长发育，提高其对各种生物和非生物胁迫的抵抗能力，对于内生菌的研究主要集中于农业和医药业领域，而在修复污染环境方面的应用潜力则一直被忽视。随着根际细菌在环境污染修复领域展现出巨大的应用前景，越来越多研究者的目光开始向植物内生菌转移。

种子是植物的繁殖器官，种子内也定殖有一定数量的内生菌，已有研究表明，有些种子内生菌可通过垂直传播，成为新生植物组织内最早定殖的内生菌，内生菌能够增强种子的活力、发芽率和恢复力，改善植物的生长和发育，从而赋予植物对生物和非生物胁迫的耐受性。在重金属污染环境中，通过种子垂直传播给下一代的部分内生菌菌株，能够显著增强宿主植物的重金属抗性，这在植物重金属污染环境适应过程中发挥着重要作用。例如李柯等人研究表明，在高浓度重金属铅胁迫下，侵染内生真菌Epichloë guerinii的德兰臭草（Melica transsilvanica）种子比未侵染内生真菌的种子萌发率更高，其子代植物幼苗生物量更大。Sánchez-López等人发现，在复合重金属（锌、镉、铜）胁迫下，植物连续三代Crotalaria pumila种子中都具有相似的内生细菌群落，部分菌株具有重金属抗性，并且还表现出有机酸生成、磷酸盐溶解能力和ACC脱氨酶活性。Sánchez-López 等（2018）也发现，巴豆（Crotalaria pumila）种子内生菌的优势类群能够稳定地垂直传递给下一代，并显著促进下一代植物的营养吸收和生长，增强宿主植物的重金属抗性。这些研究表明某些内生菌可以垂直传播给下一代并赋予其重金属抗性，对植物适应重金属胁迫环境具有重要意义。

发明内容

本发明目的在于提供一种植物内生真菌黑附球菌（Epicoccum nigrum）FZT214，其于2020年11月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21045，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明另一目的是提供上述植物内生真菌黑附球菌FZT214的新用途，即将其应用在重金属胁迫下促进植物种子萌发及幼苗生长中，本发明提供的黑附球菌FZT214有较强的重金属耐受性，在重金属镉胁迫下能显著促进植物种子萌发、提高幼苗存活率、增强植物重金属抗性，且接种该内生真菌可以显著促进土荆芥植物在重金属胁迫条件下的生长，增加植物的种子产量，并增强植物对镉的累积；

为了实现以上目的，本发明采取以下技术措施：

A、采集重金属污染区矿渣堆上优势植物土荆芥的种子样品，于自来水下冲洗干净；

B、从每种植物样品中随机挑选出种子50粒，在自来水下冲洗干净，按下列程序进行表面消毒：体积浓度75%的乙醇漂洗2min、无菌水冲洗3次；有效氯浓度为5%的NaClO溶液漂洗2min、无菌水冲洗3次，置于无菌滤纸上吸干水分。将表面消毒后的种子贴到PDA平板上(90mm)，每皿5粒，25℃培养60d，隔天观察，培养期间见组织块周围有真菌长出，则挑取、纯化并保藏；同时，通过漂洗液检验法检验种子表面消毒是否彻底；

C、将分离得到的内生菌株接种到PDA平板上，用无菌打孔器沿菌落边缘打下直径为4.4mm的菌块，再将该菌块接种到含Pb²⁺、Zn²⁺或Cd²⁺的PDA培养基上及不含重金属的PDA平板上，25℃培养，隔天测量菌落直径，每个样品3个重复；用菌株在重金属平板上的菌落直径除以该菌株在不含重金属平板上的菌落直径所得值来反应菌株对重金属的耐受性（耐受性指数，MTI），并将第6天的MTI值超过50%的菌株定义为重金属耐受菌株；

经过分离筛选后，将对重金属具有较强抗性的菌株保存于PDA斜面上备用；通过上述方法，将分离获得的丝状真菌命名为FZT214；

D、菌株FZT214的鉴定

FZT214形态学特征：培养初期菌落呈白色，近圆形，不透明，后期菌落呈黄褐色，菌落与培养基连接紧密；显微镜下观察分生孢子座垫状、暗色、大小不等。分生孢子梗松散或紧密，暗色，相当短；分生孢子球形或卵圆形，多砖格孢，深黄褐色，有小刺，常聚集成球状。

分子鉴定：采用试剂盒提取该菌株总DNA，经检测后送测序公司进行序列测定，将测序结果与NCBI上序列进行比对；

结合形态学特征和分子鉴定结果，最终将该菌株鉴定为黑附球菌（Epicoccum nigrum）；该菌株保存和活化所用培养基均为PDA培养基。

本发明从重金属污染地土荆芥种子中分离得到重金属耐受菌株黑附球菌FZT214，同时采用该菌株的发酵液对土荆芥种子在重金属胁迫下的萌发、以及接种该菌株对盆栽土荆芥生长及对重金属累积能力的影响进行研究，为重金属污染土壤修复提供真菌菌种和理论依据，具有重要的理论和实际研究价值。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

（1）黑附球菌FZT214来源于重金属污染区超累积植物土荆芥的种子，对重金属铅、锌、镉有极强的耐受性，且通过简单液体发酵即可获得大量的菌丝体，菌体易获取，成本低廉，拥有商业化应用的潜能；

（2）菌株FZT214在重金属镉胁迫下能显著促进种子萌发、提高幼苗存活率、增强其重金属抗性；

（3）菌株FZT214在不同浓度重金属镉胁迫下能显著促增加植物的种子产量；

（4）菌株FZT214接种植物后，能够定植于植物体内，并且能对植物的生长产生影响，增强植物对重金属镉的累积量，对重金属镉的修复效果较为明显。

附图说明

图1为黑附球菌FZT214在PDA培养基上的菌落形态；

图2为黑附球菌FZT214 接种（Endophyde+）和未接种（Endophyde -）下土荆芥的种子萌发率；

图3为黑附球菌FZT214 接种（E+）和未接种（E-）下土荆芥的种子鲜重；

图4为在不同浓度重金属Cd胁迫下，接种黑附球菌FZT214对土荆芥生长期茎长（左图）和根长（右图）的影响结果；

图5为在不同浓度重金属Cd胁迫下，接种黑附球菌FZT214对土荆芥生长期地上（左图）地下（右图）鲜重的影响结果

图6为在不同浓度重金属Cd胁迫下，接种黑附球菌FZT214对土荆芥生长期地上（左图）地下（右图）干重的影响结果；

图7为不同浓度重金属Cd胁迫下，接种黑附球菌FZT214对土荆芥生长期的叶绿素的影响结果；

图8为在不同浓度重金属Cd胁迫下，接种黑附球菌FZT214对土荆芥果期种子干重的影响结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，但本发明并不局限于以下技术方案。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等加以实施。

实施例1：黑附球菌FZT214的分离、筛选与鉴定

A、采集重金属污染地矿渣区优势植物土荆芥的植物种子样品，于自来水下冲洗干净；

B、从土荆芥植物样品中随机挑选出种子50粒，在自来水下冲洗干净，按下列程序进行表面消毒：体积分数75%的乙醇漂洗2 min、无菌水冲洗3次；有效氯浓度5% NaClO溶液漂洗2min、无菌水冲洗3次，置于无菌滤纸上吸干水分。将表面消毒后的种子贴到PDA平板上(90mm) ，每皿5粒，25℃培养60d，隔天观察，培养期间见组织块周围有真菌长出，则挑取、纯化并保藏，同时，通过漂洗液检验法检验种子表面消毒是否彻底。

C、将分离得到的内生菌株接种到PDA平板上，用无菌打孔器沿菌落边缘打下直径为4.4mm的菌块，再将该菌块接种到含Pb²⁺（9.66mmol/L）、Zn²⁺（46.20mmol/L）或Cd²⁺（1mmol/L）的PDA培养基上（用Pb（NO₃）₂、ZnSO₄·7H₂O和CdSO₄·8H₂O分别配制得到）及不含重金属的PDA平板上，25℃培养，隔天测量菌落直径，每个样品3个重复；用菌株在重金属平板上的菌落直径除以该菌株在不含重金属平板上的菌落直径所得值来反应菌株对重金属的耐受性（耐受性指数，MTI），并将第6天的MTI值超过50%的菌株定义为重金属耐受菌株。

D、经过分离筛选后，将对重金属具有较强抗性的菌株保存于PDA斜面上备用，通过上述方法，将分离获得的丝状真菌命名为FZT214；

E、菌株FZT214的鉴定

分子鉴定：采用试剂盒提取该菌株总DNA，经检测后送测序公司进行序列测定，将测序结果与NCBI上序列进行Blast比对，其序列与黑附球菌（Epicoccum nigrum）同源性达99%，并结合该菌的形态学特征确定该菌株为黑附球菌（Epicoccum nigrum）。

实施例2：在重金属Cd胁迫下植物内生真菌黑附球菌FZT214对土荆芥种子萌发的影响

1、黑附球菌FZT214悬浮液的制备：挑选之前保藏的纯净无污染的FZT214菌株接种到PDA培养基中活化，置于28℃隔水式恒温培养箱中培养7天，挑选长势良好且无污染的平板，挑取菌丝体接种到PDB培养基中，于28℃、130rpm 的恒温摇床中培养3-5天，在无菌条件下，将等量菌丝体滤出，用无菌水冲洗3遍，避免菌丝体上沾有培养基，然后无菌剪刀剪碎，将剪碎后的菌丝转移至无菌水中定容至150 mL，制成FZT214菌丝悬浮液；

2、将土荆芥种子用黑附球菌FZT214菌丝悬浮液处理1 h，无菌水处理的为对照组，将感染种子和对照种子浸润在含有不同浓度的Cd²⁺溶液的培养皿中（培养皿铺有两层灭菌的滤纸，每个培养皿中Cd²⁺溶液为5mL）；Cd²⁺溶液浓度为0、1、5、15、30mg/mL，每个浓度设置三个重复组，培养皿用封口膜密封，置于25℃的培养箱中培养；从有种子萌发的第1天开始记录每天萌发的种子数，直到无萌发为止；计算萌发率(%)为(Gt/T) ×100，其中Gt为10天内萌发种子总数，T为种子数；实验结束时，测定了所有种子的鲜重；

结果如图2、图3所示，黑附球菌FZT214在重金属胁迫下能显著促进种子萌发、提高幼苗存活率、增强其重金属抗性。

实施例3：在重金属Cd胁迫下种子黑附球菌FZT214对生长期土荆芥的影响

本实施例旨在证明黑附球菌FZT214在重金属污染中对植物生长及植物重金属污染修复中的促进作用；以土荆芥（Dysphania ambrosioides）为供试植物，实验过程如下：

A、内生真菌接种剂和灭活剂的制备：挑选之前保藏的纯净无污染的黑附球菌FZT214菌株接种到PDA培养基中活化，置于28℃隔水式恒温培养箱中培养7天，挑选长势良好且无污染的平板，挑取菌丝体接种到PDB培养基中，于28℃、130rpm 的恒温摇床中培养3-5 天，在无菌条件下，将菌丝体滤出，用无菌水冲洗3遍，避免菌丝体上沾有培养基，然后无菌剪刀剪碎，将剪碎后的菌丝转移至无菌水中制成FZT214菌丝悬浮液，将菌悬液平均分成2组，每组加入无菌水定容至150mL，一组作为接种剂，另一组于121℃高压蒸汽灭菌15 min制成灭活剂。

B、土荆芥无菌苗的准备：土荆芥种子样品于2018年8月10日采于会泽县者海镇三多多村旁废弃矿渣堆（北纬26°28′17″，东经103°37′34″，海拔2273 m），4℃保存备用；随机挑选若干粒土荆芥种子，按下列程序进行表面消毒：首先在体积浓度75%的乙醇溶液中浸泡3 min、无菌水冲洗4次；然后在有效氯浓度为5%的NaClO溶液浸泡1min、用无菌水冲5次，将其置于无菌滤纸上吸干水分，备用；将表面灭菌后的种子浸泡在FZT214菌丝悬浮液中，28 C条件下浸泡1h人工定殖，对照种子浸泡在等体积蒸压蒸馏水中。按加拿大水藓泥炭: 珠岩的体积比为7:3的比例制备混合土壤，于121℃高压蒸汽灭菌15min，间歇灭菌三次，每次间隔24h，室温下冷却，均匀平铺于无菌平皿中（150× 20mm）。将处理后的种子均匀播撒于其中，置于光照培养箱中，25℃光照10h与18℃避光14h下交替培养；培养期间注意观察种子萌发情况，在萌发期间，每2天浇一次无菌水，以浇透土壤但无积水为准；待种子萌发后，每3天浇一次无菌水，每7天浇等量混合营养液（美施乐全水溶清液型盆栽复合肥），种子萌发21d后，选取长势一致的幼苗备用。

C、盆栽实验：

将加拿大泥炭藓按照体积比7:3的比例与珍珠岩混合并充分搅拌均匀，作为栽培基质，土壤经121℃下高压蒸汽灭菌15min，间歇灭菌三次，每次间隔24h，而后放在室温下充分冷却，以每盆150g分装，分别按Cd²⁺0、5、15、30mg/kg的比例将CdCl₂·2.5H₂O加入到土壤中，平衡15天后，用于重金属Cd胁迫盆栽实验；选取步骤B中若干长势一致的土荆芥幼苗，移栽至各组土壤中，每盆移栽一株；花盆随机排列，放置在人工植物光照下(16/8 h明暗循环)，按要求每2-3天用无菌水给植株浇水，每周提供一次营养液；在移植后30天分别对处理组植物喷洒FZT214菌丝悬浮液，对对照组植物喷洒等量的灭活FZT214菌丝悬浮液；实验过程中密切观察各组土荆芥苗的生长状况，40d后收获，测定茎长、根长、鲜重、干重、叶绿素及土壤和植物中总镉的含量；

结果如图4-6所示，从图中可以看出在不同重金属Cd胁迫下，接种黑附球菌FZT214对生长期土荆芥的促生长效果明显，实验组的茎长、根长、地下鲜重均显著高于对照组（p<0.05，t检验）；

从图7结果可以看出实验组的叶绿素含量高于对照组，且在30mg/kg Cd污染胁迫时有显著性差异（p<0.05，t检验）；证明了本发明所提供的丝状真菌在含Cd污染土壤中对植物生长具有保护能力。

从表1结果可以看出，在重金属富集方面，接种FZT214，实验组中在15、30mg/kg Cd污染胁迫时，土壤中Cd含量显著低于对照组（p<0.05, t检验），实验证明了本发明所提供的菌株FZT214可促进生长期植物对重金属镉的富集，达到对镉污染土壤进行修复的目的；

表1 菌株FZT214对不同浓度重金属Cd胁迫下重金属富集的影响（生长期）

注：平均值±STD，n=3。采用单因素方差分析，不同小写字母表示处理间差异显著，p<0.05，（Duncans检验）。

实施列4：在重金属Cd胁迫下种子内生真菌FZT214对土荆芥种子产量的影响

实验过程和技术方法同实施例3，所不同的是在移植后30、60、90、120天分别对处理组植物喷洒FZT214菌丝悬浮液，对对照组植物喷洒等量的灭活FZT214菌丝悬浮液；实验过程中密切观察各组土荆芥苗的生长状况，150d后收获，测定种子干重。

结果如图8所示，从图中可以看出在重金属Cd不同浓度胁迫下，接种黑附球菌FZT214能够增加植物种子的产量，实验组的种子干重均显著高于对照组（p<0.05，t检验）。

Claims

1.一株植物内生真菌黑附球菌（Epicoccum nigrum）FZT214，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.21045。

2.权利要求1所述的植物内生真菌黑附球菌FZT214在重金属胁迫下促进植物种子萌发、幼苗生长中的应用。

3.权利要求1所述的植物内生真菌黑附球菌FZT214在重金属胁迫下增加植物种子产量的应用。