CN117801966A - 一株真菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株真菌及其应用，涉及环境微生物技术领域，所述真菌为拟盘多毛孢属（Pestalotiopsis sp.），菌种已在广东省科学院微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）登记保藏，保藏编号为GDMCC.No 64089。将本发明提供的菌株接种植物后，能够提升植物在重金属环境下的存活率，为重金属土壤环境植物绿化提供方向，同时为利用根际微生物修复土壤重金属污染提供可靠依据。
Description
技术领域
本发明涉及环境微生物技术领域，具体涉及一株真菌及其应用。
背景技术
重金属包括铁（Fe）、锰（Mn）、铜（Cu）、锌（Zn）、镉（Cd）、汞（Hg）、铬（Cr）、镍（Ni）、钼（Mo）、钴（Co）等。而土壤重金属污染是指由重金属及其化合物造成的土壤重金属含量超标。
机动车排放、垃圾焚烧、工业废弃物以及自然大气降尘等活动均会对土壤造成重金属排放，土壤重金属含量过高将会影响植物生长，甚至导致植物死亡，影响绿化建设。
关于土壤重金属污染修复技术主要包括：生物修复技术、化学修复技术、土壤物理修复技术及电动化修复技术，其中生物修复技术包括微生物修复技术、植物修复技术和根际微生物-植物联合修复技术。其中，根际微生物-植物联合修复技术是利用土壤-植物-微生物复合体系，植物修复技术和微生物修复技术联合使用相互促进，共同降低土壤污染物、缓解环境污染的一种新兴生物修复技术，因而利用根际微生物-植物联合修复技术修复土壤重金属具有很大的发展潜力与研究价值。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一株真菌及其应用，该真菌是从六盘水煤矸山两头毛根际土壤中提取，为拟盘多毛孢属（Pestalotiopsis sp.），菌种已于2023年11月30号保藏于广东省科学院微生物研究所（广东省微生物分析检测中心），保藏编号为GDMCC.No64089，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
该菌的分离、纯化包括：
A、取样：采集六盘水煤矸山两头毛根际土壤样品。采用“S”型选点，四分法混合取样，无菌袋收集，密封并置于4℃冰箱下保存备用。
B、培养基的制备：制备PDA培养基，在培养基中加入氯化镉溶液（分析纯），在121℃下灭菌20min，使镉浓度达到50mg/L，倒置PDA培养基时加入青霉素和链霉素。
C、分离纯化：将采回的土样用梯度稀释法进行土壤悬液制备，准确称取1g土壤加入到盛有99mL无菌水的250mL三角瓶中，200r/min震荡1h制成浓度10-2的土壤悬液，吸取0.1mL土壤悬液涂布在Cd2+离子浓度为50mg/L的PDA培养基上，接种完毕后放置于25℃恒温培养箱中倒置培养，待其长出较小菌落时在无菌条件下挑取菌丝进行初次培养，经3~4次纯化后获得单菌株。
D、菌株鉴定：
1）形态鉴定：依据《微生物分类学》、《真菌鉴定手册》和《普通真菌学》，且以菌落的个体形态特征为主进行鉴定：
菌落光滑呈不规则圆形，菌落正面为乳白色（中央质地厚，面积多）；外部一圈质地薄，面积少；菌丝短密；菌落背面最中央为黄棕色；内部一层粉袖色；外部一层略透白色。
分生孢子呈长圆形至纺锤形、5个细胞，具有4个隔膜，中间三个细胞呈暗褐色，两端的两个细胞无色，上端细胞的顶上有1~3根（1根较少）长而无色的附属丝，下端细胞附有无色而细、线形、或直或弯的分生孢子梗；分生孢子长38.71±4.20μm，宽5.82±0.74μm，有色部分长14.01±1.33μm，长附属丝的顶部无色部分长3.88±0.83μm，长分生孢子梗的底部无色部分长3.85±0.71μm，两根附属丝长13.22±2.67μm、14.99±2.89μm，分生孢子梗5.77±1.14μm。
2）分子学鉴定：将纯化的真菌送到天一辉远生物科技有限公司进行测序。
结合形态学特征和分子鉴定结果，最终将该菌株鉴定为拟盘多毛孢属（Pestalotiopsis sp.）；该菌株保存和活化所用培养基均为PDA培养基。
本发明拟盘多毛孢属GDMCC 64089从六盘水煤矸山优势植物两头毛根际土壤中分离得到，进行重金属环境下对植物生长影响的研究，为重金属土壤环境植物绿化提供方向，同时为利用根际微生物修复土壤重金属污染提供可靠依据。
本发明的有益效果是：
1）将本发明提供的菌株接种植物后，能够提升植物在重金属环境下的存活率，为重金属土壤环境植物绿化提供方向，同时为利用根际微生物修复土壤重金属污染提供可靠依据。
2）本发明所提供的菌种来源于重金属污染地区，对重金属铅、锌、镉有极强的耐受性，通过简单液体发酵即可获得大量的菌丝体，菌体易获取，成本低廉，拥有商业化应用的潜能。
附图说明
图1为拟盘多毛孢属GDMCC 64089在培养基上菌落正面形态；
图2为拟盘多毛孢属GDMCC 64089在培养基上菌落背面形态；
图3为拟盘多毛孢属GDMCC 64089的分生孢子放大图；
图4为实施例2中菌株对白菜萌发、成苗的影响结果；
图5为实施例2中菌株对白菜幼苗株高、根长的影响结果；
图6为菌株对白菜幼苗CAT酶活含量的影响。
具体实施方式
下面将结合实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有付出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：拟盘多毛孢属GDMCC 64089的分离、筛选与鉴定
A、取样：采集六盘水煤矸山两头毛根际土壤样品。采用“S”型选点，四分法混合取样，无菌袋收集，密封并置于4℃冰箱下保存备用。
B、培养基的制备：制备PDA培养基，在培养基中加入氯化镉溶液（分析纯），在121℃下灭菌20min，使之浓度达到50mg/L，倒置PDA培养基时加入青霉素和链霉素。
C、分离纯化：将采回的土样用梯度稀释法进行土壤悬液制备，准确称取1g土壤加入到盛有99mL无菌水的250mL三角瓶中，200r/min震荡1h制成浓度10-2的土壤悬液，吸取0.1mL土壤悬液涂布在Cd2+离子浓度为50mg/L的PDA培养基上，接种完毕后放置于25℃恒温培养箱中倒置培养，待其长出较小菌落时在无菌条件下挑取菌丝进行初次培养，经3~4次纯化后获得单菌株。
D、菌株鉴定：参阅图1-3
1）形态鉴定：依据《微生物分类学》、《真菌鉴定手册》和《普通真菌学》，且以菌落的个体形态特征为主进行鉴定：
菌落光滑呈不规则圆形，菌落正面为乳白色（中央质地厚，面积多）；外部一圈质地薄，面积少；菌丝短密。菌落背面最中央为黄棕色；内部一层粉袖色；外部一层略透白色。
分生孢子呈长圆形至纺锤形、5个细胞，具有4个隔膜，中间三个细胞暗褐色，两端的两个细胞无色，上端细胞的顶上有1~3根（1根较少）长而无色的附属丝，下端细胞附有无色而细、线形、或直或弯的分生孢子梗；分生孢子长38.71±4.20μm，宽5.82±0.74μm，有色部分长14.01±1.33μm，长附属丝的顶部无色部分长3.88±0.83μm，长分生孢子梗的底部无色部分长3.85±0.71μm，两根附属丝长13.22±2.67μm、14.99±2.89μm，分生孢子梗5.77±1.14μm。
2）分子学鉴定：将纯化的真菌送至天一辉远生物科技有限公司进行测序，菌株样本与同源序列ITS的对比结果如表1，结果显示菌株与拟盘多毛孢属（Pestalotiopsis sp.）下的已知种Pseudopestalotiopsis theae的同源性为100%。
表1 样本与同源序列ITS的对比结果
| 样本 | 种名 | 基因登录号 | 同源性 |
| 菌株 | Pseudopestalotiopsis theae | MT252050.1 | 100% |
结合形态学特征和分子鉴定结果，最终将该菌株鉴定为拟盘多毛孢属（Pestalotiopsis sp.）。
实施例2：拟盘多毛孢属GDMCC 64089对重金属环境下白菜生长的影响
A、将保存在4 ℃冰箱的拟盘多毛孢属GDMCC 64089菌种取出，放置在25 ℃恒温箱中活化4 h后，接种至PDA培养基中，然后放置25 ℃恒温箱中培养，菌株培养大小合适以后，配制PDA培养液（不加琼脂），分装在大小一致的三角瓶中，用打孔器（直径6 cm）取三块大小一致的菌饼，接种至三角瓶中。接种结束后，放置摇床中25 ℃、170 r/min培养9-10天，取出后，用离心机在4000 r/min条件下离心20分钟，取上清液作为发酵液。
B、挑选状态大小基本一致的白菜种子，置于0.5%的NaClO溶液中浸泡10 min，然后用蒸馏水反复清洗5次。设置加入拟盘多毛孢属GDMCC 64089发酵液的为实验组，以15 mg/L的镉溶液处理为对照组，采用平皿培养方式进行培养。在每个培养皿中放大小一致的滤纸，统一用15 mg/L的镉溶液润湿，每个培养皿数100粒白菜种子，再分别加入2ml15 mg/L的镉溶液，在实验组中加入2ml发酵液，将两组培养皿放入光照培养箱中培养，条件设置为白天16 h、25 ℃，晚上8 h、20 ℃，每天观察并进行镉溶液浇注，每次浇入量控制一致，同时记录种子发芽情况，计算发芽率、成苗率，取最有效数据，以连续三天没有发芽变化即萌发结束。萌发结束后开始记录其株高根长，两天一测，取最有效数据，连续测三次即可结束，最后测量酶活。试验重复三次，每次试验使用同一个培养皿。
拟盘多毛孢属GDMCC 64089菌株影响白菜幼苗株高根长数据统计如表2（表中小写字母表示检验结果的差异性）；菌株对白菜萌发、成苗的影响如图4；菌株对白菜幼苗株高、根长的影响如图5，数据分析均采用 SPSS 23.0 进行方差分析，后采用 Duncan（P<0.05）进行多重比较分析。
表2白菜幼苗株高根长数据
| Cd2+（mg/L）+发酵液（ml） | 株高/cm | 根长/cm |
| 15+2 | 2.989±0.381a | 1.907±0.182a |
实施例3：拟盘多毛孢属GDMCC 64089菌株对白菜幼苗CAT酶的影响
A、酶液制备
称取植物材料并记录鲜重量（g），随后加入20 mmol/L KH2PO4溶液1 mL，于大小一致的2 mL离心管中冰浴研磨成匀浆，在5000 r/min、4 ℃下离心30 min，上清液转入5 mL离心管中，残渣再用1 mL KH2PO4溶液提取一次，将两次上清液合并，保存于4 ℃冰箱中干燥处备用。
B、过氧化氢酶（CAT）含量测定
CAT反应液配制：将0.1 mol/L的H2O2与0.1 mol/L的pH 7.0的磷酸缓冲液按1：4的比例混匀，即为反应液。
CAT活性测定：取0.5 mL酶液于比色杯中，加入3 mL CAT反应液，240 nm波长下比色，每隔1分钟读数1次，连续读数3次。
菌株对白菜幼苗酶活CAT含量的影响如图6，数据分析均采用 SPSS 23.0 进行方差分析，后采用 Duncan（P<0.05）进行多重比较分析。
总结：
从实施例2和3中的试验数据可得出，实验组中白菜成苗率、白菜株高根长均高于对照组，且实验组中白菜幼苗CAT酶含量高于对照组，说明拟盘多毛孢属GDMCC 64089对植物在重金属环境下生长具有促进作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
Claims (2)
1.一株真菌，其特征在于：所述真菌为拟盘多毛孢属（Pestalotiopsis sp.），菌种已在广东省科学院微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）登记保藏，保藏编号为GDMCC.No64089。
2.根据权利要求1所述的真菌在重金属环境下白菜种植中的应用。
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