CN110283736B - 一株耐铬的石油烃降解菌Tph1-14及其应用 - Google Patents

一株耐铬的石油烃降解菌Tph1-14及其应用 Download PDF

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Abstract

一株耐铬的石油烃降解菌Tph1‑14及其应用,涉及石油烃降解菌。石油烃降解菌(Streptomyces sp.)Tph1‑14已于2018年11月28日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏中心保藏编号为CCTCC NO:M 2018838。一株耐铬的石油烃降解菌(Streptomyces sp.)Tph1‑14在治理废机油及Cr6+污染的土壤环境中应用。

Description

一株耐铬的石油烃降解菌Tph1-14及其应用
技术领域
本发明涉及石油烃降解菌,尤其是涉及一株耐铬的石油烃降解菌Tph1-14及其应用。
背景技术
随着我国汽车工业的快速发展和生活水平的大幅提升,机动车数量急剧增加,伴随而来的是机油使用量大幅提高。这就导致了废机油的数量持续大幅度提高。近年来,每年平均产生的废机油达到约4000万吨,其中只有40%得到有效回收,剩余的60%则在未经处理情况下被排放至各种环境介质中(O.Arpa,R.Yumrutas,A.Demirbas.Production ofdiesel-like fuel from waste engine oil by pyrolitic distillation.Appl.Energy,87(2010),pp.122-127)。前期研究结果表明,一夸脱废机油可能会污染250,000加仑饮用水与40,730平方英尺的土壤,使土壤丧失耕种价值(A.B.Suriani,S.Alfarisa,A.Mohamed,I.M.Isa,A.Kamari,N.Hashim,M.H.Mamat,A.R.Mohamed,M.Rusop.Quasi-aligned carbonnanotubes synthesised from waste engine oil.Mater.Lett.,139(2015),pp.220-223)。因此,如何利用环境友好的方式处理和利用废机油类的石油烃污染物,成为当下迫在眉睫的环境问题之一,吸引了世界各国科研工作者们的广泛关注。
铬(Cr)是一种广泛应用于工业生产的重金属元素,常被广泛应用于电镀、制革、染色、合金生产、木材保藏等行业(Deflora S,Bagnasco M,Serra D,ZanacchiP.Genotoxicity Of Chromium Compounds-A Review.Mutat Res,1990,238(2):99-172)。我国是世界铬盐生产大国,据中华人民共和国环境保护部公布的2015年中国环境统计年报显示,本年度工业废水中六价铬(Cr6+)及总铬(Cr)的排放量分别为70.4吨和188.6吨。由于Cr在环境中长期存在、不易降解,且具有通过食物链的生物聚集和放大作用,人为活动产生未经处理的Cr不仅对环境造成严重的污染,还可能威胁公众健康(Garg SK,Tripathi M,Srinath T.Strategies for Chromium Bioremediation of Tannery Effluent.RevEnviron Contam T,2012,217:75-140.)。自然环境中,Cr主要以Cr6+及Cr3+形式稳定存在。Cr3+的性质较稳定,毒性较小;Cr6+由于具有强氧化性和腐蚀性,同时能够穿过生物膜进入细胞内部,因而,对人体有很强的毒性作用且能够造成人类遗传性基因缺陷(Pajor F,PótiP,Bárdos L.Accumulation of some heavy metals(Pd,Cd and Cr)in milk of grazingsheep in north-east Hungary.Food Sci Biotechnol,2012,2(1):389-394.)。研究表明,Cr6+的毒性是Cr3+毒性的100倍,致突变性是Cr3+的1000倍(ZHAO Ran#*,WANG Bi,CAI QingTao,LI Xiao Xia,LIU Min,HU Dong,GUO Dong Bei,WANG Juan,FAN Chun*.Bioremediation of Hexavalent Chromium Pollution by SporosarcinasaromensisM52 Isolated from Offshore Sediments in Xiamen,China.2016,Biomed Environ Sci,29(2):127-136.),是国际公认的3种致癌重金属物之一,已被美国环境保护局列为A类污染物,国际癌症研究机构(IARC)及美国政府工业卫生学家协会(ACGIH)也已经确定Cr6+化合物具有致癌性。因此,研究其处理技术对生态环境保护和人类健康意义重大。
同时,有研究表明:受废机油污染的土壤常伴随有重金属类物质污染的现象,而部分重金属污染物本身具有高毒性,对微生物具有致死作用,因此,大部分高效废机油污染修复微生物在上述情况下降解效率大大下降(Dong,Zhi-Yong,Wen-Hui Huang,Ding-FengXing&Hong-Feng Zhang.2013.Remediation of soil co-contaminated with petroleumand heavy metals by the integration of electrokinetics andbiostimulation.Journal of Hazardous Materials 260.399-408)。因此,寻求具有石油烃污染物-Cr6+复合污染的微生物资源,对环境污染问题具有极其重要的实际意义。
目前,分别针对含石油烃与重金属污染物土壤治理的物理法、化学法、生物法及不同方法的组合应用已经较为普遍,但专门针对废机油-Cr6+复合污染的微生物修复技术却鲜见报道。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一株耐铬的石油烃降解菌(Streptomyces sp.)Tph1-14。
本发明的第二目的在于提供一株耐铬的石油烃降解菌(Streptomyces sp.)Tph1-14在治理废机油及Cr6+污染的土壤环境中应用。
本发明所提供的菌株为石油烃降解菌(Streptomyces sp.)Tph1-14,筛选自澳门发电厂的一处石油烃污染区域(E113°55′,N22°20′),土壤样品经无菌采集、分装、密封后,经低温运送至实验室进行下一阶段的功能菌株分离筛选工作。
在实验室条件下:取洁净的250mL锥形瓶加注90mL去离子水并添加直径为0.5cm玻璃珠30颗,封口后置于高压灭菌锅内,121℃高温高压灭菌20min。待温度降至室温后,在超净工作台中将10.0g前述土壤样品加入锥形瓶中,重新封口后,置于28℃恒温摇床内震荡约30min,混匀、研磨土壤颗粒,使微生物充分暴露于悬浊液中。该过程所产生的悬浊液即为梯度稀释的原液。该原液以10倍等比稀释,经预实验确定以10-6为最终稀释浓度,均匀涂布于LB固体平板上,后将平板倒置于28℃恒温培养箱培养约48h。经反复分离纯化,最终得到纯净单菌石油烃降解菌(Streptomyces sp.)Tph1-14。
提取石油烃降解菌(Streptomyces sp.)Tph1-14的基因组DNA并作为模板,扩增16S rDNA片段,并在EZ Biocloud(https://www.ezbiocloud.net/)上选取高相似度序列,用MEGA 7.0计算出序列的系统进化距离,并构建系统发育树。系统发育树显示:石油烃降解菌(Streptomyces sp.)Tph1-14,其16s rDNA序列与模式菌株StreptomycesspinoverrucosusNBRC 14228(T)相似性为98.99%,但经系统发育学鉴定后,其单独形成独立的一枝,因此命名为石油烃降解菌(Streptomyces sp.)Tph1-14。石油烃降解菌(Streptomyces sp.)Tph1-14已于2018年11月28日保藏于中国典型培养物保藏中心,地址:中国武汉武汉大学,邮编:430072,保藏中心保藏编号为CCTCC NO:M 2018838。
将10g废机油与90mL无机盐液体培养基分别灭菌后混合,即配制含100g/L废机油的原油-无机盐培养基,并在此培养基中加入干燥至恒重的重铬酸钾粉末使该体系中的Cr6+约50mg/L(该数值经预实验确定)。接入Tph1-14种子液,于150rpm,28℃培养共计15d,每3d取样分析Cr6+及石油烃含量,并计算对应时点的降解率;再以50mg/L Cr6+为梯度,不断增加LB液体培养基中的Cr6+浓度,后接入Tph1-14种子液,通过监测一定培养周期后培养基中的吸光度值是否变化并加以LB固体平板涂布验证,以确定石油烃降解菌(Streptomyces sp.)Tph1-14最高可耐受Cr6+浓度。
经上述实验验证:本发明所述石油烃降解菌(Streptomyces sp.)Tph1-14在pH7.0,温度28℃,含Cr6+约50mg/L的10%废机油-无机盐液体培养基中,150rpm培养15d,对Cr6+去除率总计达73.4%,同时可以完全降解反应体系中的废机油。且石油烃降解菌(Streptomyces sp.)Tph1-14最高可在含约300mg/LCr6+的LB液体培养基中生长。
上述LB固体培养基组分为:胰蛋白胨10g,酵母浸粉5g,氯化钠10g,琼脂粉15g/L,去离子水1L,pH6.9~7.1。LB液体培养基组分为:胰蛋白胨10g,酵母浸粉5g,氯化钠10g,去离子水1L,pH6.9~7.1。无机盐液体培养基组分为:氯化钙2.0g,定容至100mL,制成1000×氯化钙溶液;七水合硫酸镁2.0g,定容至100mL,制成100×硫酸镁溶液;硫酸铵0.5g,硝酸钠0.5g,磷酸二氢钾1.0g,水合磷酸二氢钠1.0g,去离子水800mL,调pH至7.0~7.2,高压灭菌后,于无菌环境下按比例加入氯化钙溶液与硫酸镁溶液,并加无菌水补齐至1L。
故石油烃降解菌(Streptomyces sp.)Tph1-14在实际污染环境中的应用具有创新性。因而,得益于其成本低、效益高、不易造成二次污染等优点,同时兼具重金属耐受能力并能高效降解废机油污染物的微生物在实际应用中受到了广泛关注,并在投资、运作、操作管理方面展现出巨大的实际应用前景。
附图说明
图1为本发明的石油烃降解菌(Streptomyces sp.)Tph1-14不同时间对六价铬及废机油的降解率。在图1中,标尺表示差异精度。
图2为本发明的石油烃降解菌(Streptomyces sp.)Tph1-14的系统发育分析树。在图2中,a为六价铬,b为废机油。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
实施例1:石油烃降解菌(Streptomyces sp.)Tph1-14形态特征
将单菌落划线接种至LB固体培养基中,将平板倒置于恒温培养箱内,28℃培养72h,菌落不规则,米白色半透明,表面不光滑不湿润,边缘规则,无晕环,中央微凸起,直径3~5mm,见图1。
实施例2:石油烃降解菌(Streptomyces sp.)Tph1-14的筛选与系统发育学鉴定
(1)现场采集澳门发电厂石油烃污染区域(E113°55′,N22°20′)地表下5~20cm深度的土壤样品,初步剔除草根、石块等杂质后,低温寄送至实验室进行一下阶段功能菌株分离筛选工作。
(2)在实验室条件下:取250mL锥形瓶,洗净后加注90mL去离子水并添加直径为0.5cm玻璃珠30颗,封口后置于高压灭菌锅内,121℃高温高压灭菌20min。
(3)待上述体系冷却至室温后,在超净工作台中将10.0g前述土壤样品加入体系中,重新封口锥形瓶后,置于28℃恒温摇床内震荡约30min,以达到混匀、研磨土壤颗粒,使微生物充分暴露于悬浊液中的目的。
(4)上述过程所产生的悬浊液即为梯度稀释的原液,该原液以10倍等比稀释,以10-6为稀释终浓度,均匀涂布于LB固体平板上,后将平板倒置于28℃恒温培养箱中培养约48h。经反复分离纯化,最终得到单菌石油烃降解菌(Streptomyces sp.)Tph1-14。
(5)提取石油烃降解菌(Streptomyces sp.)Tph1-14的基因组DNA并以此为模板扩增16srDNA序列,并将该序列通过EZbiocloud(https://www.ezbiocloud.net/)与数据库中已有的16S rDNA核酸序列进行相似性比较分析。用ClustalX进行序列比对后采用Mega7.0软件进行系统发育分析。石油烃降解菌(Streptomyces sp.)Tph1-14的系统发育分析树(neighbor-joining tree)见图1。系统发育树显示:石油烃降解菌(Streptomyces sp.)Tph1-14与模式菌株Streptomyces spinoverrucosus NBRC 14228(T)相似性为98.99%,但经系统发育学鉴定后,其单独形成独立的一枝,因此命名为石油烃降解菌(Streptomycessp.)Tph1-14。
实施例3:本发明的石油烃降解菌(Streptomyces sp.)Tph1-14对废机油及Cr6+的去除能力
(1)配制LB液体培养基,并在LB固体平板上挑取石油烃降解菌(Streptomycessp.)Tph1-14的一个单菌落接种于LB液体培养基中,过夜培养,即为Tph1-14种子液。
(2)将10g原油与90mL无机盐液体培养基分别灭菌后混合,即配制100g/L的原油-无机盐培养基,并加入重铬酸钾粉末使该体系中的Cr6+约50mg/L。于28℃,150rpm条件下培养共计15d,每3日取样分析石油烃及Cr6+含量。结果显示:石油烃降解菌(Streptomycessp.)Tph1-14对Cr6+去除率总计达73.4%,同时可以完全降解反应体系中的废机油。见图2。
实施例4:本发明的石油烃降解菌(Streptomyces sp.)Tph1-14对Cr6+的最高耐受浓度
(1)配制LB液体培养基,并在LB固体平板上挑取石油烃降解菌(Streptomycessp.)Tph1-14的一个单菌落接种于LB液体培养基中,过夜培养,即为Tph1-14种子液。
(2)以50mg/L Cr6+为梯度间隔配制含不同浓度Cr6+的LB液体培养基,接入Tph1-14种子液,通过监测一定培养周期后培养基中的吸光度值是否变化并加以LB固体平板涂布验证,以确定其最高可耐受Cr6+浓度。
(3)该实验结果显示:石油烃降解菌(Streptomyces sp.)Tph1-14最高可在含约300mg/L Cr6+的LB液体培养基中生长。
在上述实验中,LB固体培养基组分为:胰蛋白胨10g,酵母浸粉5g,氯化钠10g,琼脂粉15g/L,去离子水1L,pH6.9~7.1。LB液体培养基组分为:胰蛋白胨10g,酵母浸粉5g,氯化钠10g,去离子水1L,pH6.9~7.1。无机盐液体培养基组分为:氯化钙2.0g,定容至100mL,制成1000×氯化钙溶液;七水合硫酸镁2.0g,定容至100mL,制成100×硫酸镁溶液;硫酸铵0.5g,硝酸钠0.5g,磷酸二氢钾1.0g,水合磷酸二氢钠1.0g,去离子水800mL,调pH至7.0~7.2,高压灭菌后,于无菌环境下按比例加入氯化钙溶液与硫酸镁溶液,并加无菌水补齐至1L。
序列表
<110> 厦门大学
<120> 一株耐铬的石油烃降解菌Tph1-14及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1383
<212> DNA
<213> Streptomyces sp. Tph1-14
<400> 1
ccgtgcgagt cgacgatgac cacttcggtg gggattagtg gcgaacgggt gagtaacacg 60
tgggcaatct gccctgcact ctgggacaag ccctggaaac ggggtctaat accggatact 120
gattgtcttg ggcatccttg atgatcgaaa gctccggcgg tgcaggatga gcccgcggcc 180
tatcagcttg ttggtgaggt aacggctcac caaggcgacg acgggtagcc ggcctgagag 240
ggcgaccggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtggg 300
gaatattgca caatgggcgc aagcctgatg cagcgacgcc gcgtgaggga tgacggcctt 360
cgggttgtaa acctctttca gcagggaaga agcgaaagtg acggtacctg cagaagaagc 420
gccggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg gcgcaagcgt tgtccggaat 480
tattgggcgt aaagagctcg taggcggctt gtcgcgtcgg ttgtgaaagc ccggggctta 540
accccgggtc tgcagtcgat acgggcaggc tagagttcgg taggggagat cggaattcct 600
ggtgtagcgg tgaaatgcgc agatatcagg aggaacaccg gtggcgaagg cggatctctg 660
ggccgatact gacgctgagg agcgaaagcg tggggagcga acaggattag ataccctggt 720
agtccacgcc gtaaacggtg ggcactaggt gtgggcaaca ttccacgttg tccgtgccgc 780
agctaacgca ttaagtgccc cgcctgggga gtacggccgc aaggctaaaa ctcaaaggaa 840
ttgacggggg cccgcacaag cggcggagca tgtggcttaa ttcgacgcaa cgcgaagaac 900
cttaccaagg cttgacatac accggaaacg tctggagaca ggcgccccct tgtggtcggt 960
gtacaggtgg tgcatggctg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca 1020
acgagcgcaa cccttgtccc gtgttgccag caggcccttg tggtgctggg gactcacggg 1080
agaccgccgg ggtcaactcg gaggaaggtg gggacgacgt caagtcatca tgccccttat 1140
gtcttgggct gcacacgtgc tacaatggcc ggtacaaaga gctgcgatac cgtgaggtgg 1200
agcgaatctc aaaaagccgg tctcagttcg gattggggtc tgcaactcga ccccatgaag 1260
tcggagtcgc tagtaatcgc agatcagcat tgctgcggtg aatacgttcc cgggccttgt 1320
acacaccgcc cgtcacgtca cgaaagtcgg taacacccga agccggtggc ccaacccctt 1380
gtg 1383

Claims (3)

1.一株耐铬的石油烃降解菌(Streptomyces sp.)Tph1-14,其特征在于已于2018年11月28日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏中心保藏编号为CCTCC NO:M2018838。
2.如权利要求1所述一株耐铬的石油烃降解菌(Streptomyces sp.)Tph1-14在治理废机油中应用。
3.如权利要求1所述一株耐铬的石油烃降解菌(Streptomyces sp.)Tph1-14在治理Cr6+污染的土壤环境中应用。
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