CN103103150B - 一种高效溶磷促生菌、由其制备的微生物菌剂及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种高效溶磷促生菌及由其制备的微生物菌剂，该微生物菌剂的有效成分为菠萝泛菌(Pantoea ananatis)P21和明尼苏达被毛孢菌(Hirsutella minnesotensis)。本发明将广泛适应性的高效溶磷细菌菠萝泛菌P21与高效防治线虫病害的真菌有机地结合起来，通过施用本发明的复合菌剂，在高效利用土壤磷素、提高磷肥利用率的同时，充分发挥微生物防治线虫病害的作用，达到了溶磷增产、防病增产的效果，对我国粮食持续增产、节约磷肥资源、减少线虫病害和保护农田生态环境具有重要意义。

Description

一种高效溶磷促生菌、由其制备的微生物菌剂及应用

技术领域

本发明属于微生物菌剂领域，具体地说，涉及一种高效溶磷促生菌、由其制备的微生物菌剂及应用。

背景技术

（一）溶磷微生物菌剂发展现状

我国90%以上的耕地缺磷，使用磷肥是解决作物增产的主要措施，磷肥日益成为限制我国农业可持续发展的瓶颈。我国是世界化肥消费第一大国，也是磷肥第一消费大国，每年磷肥消费量1100万吨左右。众所周知，我国磷矿资源缺乏，保有储量151.98亿吨，再过20年中高品位磷矿开采殆尽（李志宁,2003a,李志宁,2003b），不得不依靠购买国外高价磷矿石保障粮食生产。一些研究显示，我国磷肥当季利用率仅为3.22～18%（周晓芬,马民强,1994;张李康,1997;崔正忠等,2001;周广业等,1991;李云等,2002）。磷肥施入土壤后80～90%很快被土壤固定（范丙全等,1998,2004a），石灰性土壤中有效磷转变成溶解度极低的磷灰石（lschmidt&Nixon,1944;Murrmann&Peech,1968），而在酸性土壤中形成磷酸铁和磷酸铝（Ford,1933）。我国自20世纪70年代使用磷肥以来，土壤磷积累显著（林葆，2009）。土壤磷绝大部分以难溶无机磷形态存在，释放缓慢，作物有效性低。随着辚肥用量增加，磷肥转化为极难利用的闭蓄态磷（来路等,2003）与高稳定性有机磷（黄庆海等,2003）。解决土壤磷的活化与释放是提高土壤磷和磷肥利用效率的关键。因此，增强土壤磷有效性，提高磷肥增产效益，是我国农业可持续发展的必然之路。

溶磷微生物是一类具有活化土壤难溶无机磷能力的有益微生物。应用溶磷微生物活化土壤难溶磷是世界公认的安全、经济和有效的生物措施（Kucey,1988;Kamble&Mohite,1996；Morales等,2007；El-Gawad等,2009），倍受各国科学家和政府高度重视。开展高效溶磷微生物研究与利用，对于挖掘土壤磷资源的利用潜力、提高磷肥利用率、节约磷肥、发挥我国有限磷矿资源的增产作用和农业持续发展意义重大。

溶磷真菌（Salih等,1989;王延秋等,1993;Vassileva,1998;Asea等,1988；Abd-Alla&Omar,2001;程淑琴等,2003;Wakelin等,2007;Morales等,2007）和溶磷细菌（Rasal,等,2004;Raychaudhuri,等,2003;Orhan,等,2006;）都具有显著增加土壤有效磷、提高作物产量能力，以及节约磷肥的效果（El-Lateef,1998;Suri,等,2006）。同时，溶磷微生物提高磷肥利用率（Tomar等,1994;Tomar等,1996;Kamble&Mohite,1996;范丙全等,2004a），具有改善作物品质的能力（Hamed,2003;El-Gawad,2009），溶磷微生物对于提高土壤难溶磷和磷肥的生物有效性具有巨大应用潜力。

以往研究涉及面非常广，为溶磷微生物应用提供了技术支撑。然而，长期以来没有重视溶磷微生物在大范围、大区域与多种土壤、多种作物的广泛适应性进行研究，使得大量溶磷菌种很大程度上无法找到更适合的应用土壤与作物，难以发挥溶解土壤磷和增强磷肥有效性的最大潜力。严重限制了溶磷菌的使用范围和应用潜力发挥。对整体溶磷微生物资源而言，可能造成了巨大浪费，由此导致各国溶磷微生物菌剂研究和生产进入更大误区。一些国家仍然以单株溶磷菌株生产溶磷微生物菌剂，而在全国范围所有土壤和各种上使用。世界上大型溶磷微生物菌剂公司，如加拿大Philom Bios公司使用单株溶磷拜莱青霉菌（Penicillium bilaii）(Kucey,1988,1989)生产微生物菌剂JumpStart。印度Ruchi Biochemicals公司使用并生产一种溶磷微生物，推荐在全国使用。比利时生产一株溶磷细菌生产菌剂Phosphorene（Ahmed等,1999）。我国主要以巨大芽孢杆菌（Bacillus megatarium）生产溶磷微生物菌剂（葛诚,吴薇,1995;范丙全,2007）。其他国家情形大致相似。没有考虑溶磷微生物与地域、土壤类型、作物种类的最佳适配性，溶磷微生物菌剂的使用效果受到严重影响。

因此，针对我国土壤磷有效性低、难溶磷积累，磷肥利用率持续下降的现状，并且针对我国缺乏高效广谱溶磷微生物菌种资源、微生物菌剂产业仍然使用适应范围窄、溶磷能力低的老菌种的现状，筛选和培育广泛适用我国各类主要土壤、多种作物的新的溶磷微生物菌株，是开发高效溶磷微生物菌剂的重要前提。

（二）土传病害防治菌剂发展现状

我国土传病害、连作障碍日趋严重，造成大面积减产，土传病害防治是保障粮食安全的必然途径。土传病害、连作障碍发生严重已经成为我国粮食持续增产的威胁因素。尽管我国对土传病害进行了长期研究，但是土传病害、连作障碍防治技术没有得到有效的解决，尤其是防治土传病害、连作障碍的微生物防治技术依然缺乏。发展多功能微生物菌剂，是解决土传病害、连作障碍防治，确保粮食安全的重大需求。

由于人口急剧增长和耕地数量的限制，以及人类对高产出、高收入的追求，连作栽培成为我国农业生产中的常用措施。连作种植出现作物生长发育不良、土传病害频繁加重、产量和品质下降等问题，给我国农业生产造成巨大的经济损失，是农业可持续发展急需解决的重大课题。

农业生产正在朝着无公害、有机农业方向发展，微生物制剂及其应用技术对于发展绿色农业、建立有机食品安全工程体系具有重要作用。我国蔬菜、果树、花卉已经发展到4亿亩，其中，蔬菜播种面积2.82亿亩，总产量6.37万吨。保护地蔬菜超过5000多万亩，总产量1.68亿吨，而且有机蔬菜出口基地面积急剧增加；西瓜种植约500-1000万亩，西瓜连作障碍是世界上长期存在的难题，产量和品质下降。研究表明，黄瓜、番茄、西葫芦、甜椒等作物连作3年以上，每年产量降低10%-20%,连作4-5年的作物减产40%甚至一半以上。土传病害、连作障碍对粮食作物发展造成了严重危害，我国大豆种植面积大约有1.45亿亩，由于连年种植、病害频繁且发生面积大，引发作物减产甚至绝收。连作障碍已经成为农业生产发展的瓶颈，研究开发高效防治土传病害、消除连作障碍的微生物菌剂迫在眉睫。利用微生物菌剂可提高作物产量、改善作物品质、防治线虫病害、节约化肥，在提高土壤的持续增产潜力中发挥着重要作用。

各国非常重视防治土传病害的微生物菌剂的产品研发，己经商品化的产品如澳大利亚的K84，放射形农杆菌菌株K84(Agrobacteriumradiobacterstrain k84)在1973年就被大规模生产，用来防治由根癌病土壤(Agrobacterium tumefaciens)引起的感染(Kerr,A,1980);1988年Gustafson公司在美国注册生产A13的PGPR产品Kodiak，成为作物促生菌商业化生产的拓疆者，商业化最成功的产品是Agrobacteriumradiobacter K84。美国研制的Topshield(哈茨木霉T22)和以色列研制的Trichodex(哈茨木霉T39)均是用于防治真菌病害如灰霉病以及以色列Mycontrol公司开发的商品制剂Trichoderma2000主要用于防治立枯丝核菌、齐整小核菌、疫霉等；盾壳霉也是研究较多的一种生防菌，盾壳霉对核盘菌属及葱白腐小菌核菌引起的多种植物病害均有很强的抑制作用。现在国外已有商品化产品出现，如前苏联开发的商品制剂Coniothyrin可以用于防治向日葵的菌核病，德国开发的商品制剂ContansWG可以用于防治莴苣的核盘菌菌核病等。此外还有针对粘帚霉的，由美国研制成功的SoilGard，用于防治猝倒病和根腐等，意大利研制的BiofoxC专用于防治镰刀菌属病害等。我国商品化的木霉菌杀菌剂（生菌消，又名灭菌灵)，主要用于防治各种作物的霜霉病（沈寅初，2000），我国开发的5406抗生菌为链霉菌属，定名为泾阳链霉菌，对黄萎病菌、枯萎病菌、立枯病菌、猝倒病菌等多种植物病害具有抗性，并且可促进植物生长(包建中,1998)。江苏省农科院植保所防治水稻病害的拮抗细菌(Bacillus subtilis)，大面积示范推广试验证明，拮抗菌在水稻植株上定植能力较强，繁殖较快，纹枯病防效达75%～85%，稻曲病防效63.8%～85.7%（陈志谊，2001）。沈阳农业大学生物农药工程中心利用拮抗木霉和拮抗细菌混合发酵制成粉剂，成功防治了保护地蔬菜和甜瓜的苗期病害，其它报道的细菌杀菌剂还有用来防治黄瓜及烟草炭疽病菌的地衣芽孢杆菌，防治甘蔗黑腐病的枯草芽孢杆菌、荧光假单孢杆菌(Pseudomonas radiobacter)防治小麦全蚀病等。

微生物菌剂防治土传病害、连作障碍是当前主要发展方向。大棚蔬菜土壤、大豆连作农田、棉花产区农田、西瓜生产基地农田等是我国土传病害、连作障碍最为严重的地区，研制、开发和生产防治主要作物土传病害以及连作障碍，对于我国粮食增产、减少农药使用量、保障农产品品安全作用巨大。

广适应性(土壤、作物)的溶磷微生物菌种资源为世界范围内稀缺，且未见有关广适应性的溶磷微生物菌剂的报道。

发明内容

本发明主要针对我国缺磷和磷肥利用率低、土传病害严重、增产潜力下降的农田现状，提供一种新的高效溶磷促生菌以及由其制备的微生物菌剂。

本发明还通过上述微生物菌剂在防治作物病害及提高产量中的应用。

为了实现本发明目的，本发明提供一种高效溶磷促生菌--菠萝泛菌(Pantoea ananatis)P21，其分离自我国湖南省浏阳磷矿区的土壤中，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期2012年2月9日，保藏号CGMCC NO.5749。

菠萝泛菌P21菌落形态为：在牛肉膏培养基上菌落为圆形，表面光滑，颜色为黄色，菌落边缘整齐，中心隆起。革兰氏染色为阴性，细胞呈杆状，端圆，周生鞭毛，呈运动性。

菠萝泛菌P21的微生物学特性为：不能利用丙二酸，可以利用柠檬酸，发酵葡萄糖不产气；利用阿拉伯糖、甘露醇、肌醇、半乳糖、鼠李糖、山梨醇产酸，不能利用卫矛醇；明胶液化、吲哚、H₂S产生试验为阳性反应；脲酶、苯丙氨酸脱氨酶、硝酸盐还原试验为阴性反应。

本发明还提供含有菠萝泛菌(Pantoea ananatis)P21的微生物菌剂。

本发明还提供菠萝泛菌(Pantoea ananatis)P21及其微生物菌剂在防治作物病害中的应用。

本发明还提供一种复合微生物菌剂，其有效成分为菠萝泛菌(Pantoea ananatis)P21和明尼苏达被毛孢(Hirsutella minnesotensis)。

优选地，其有效成分为菠萝泛菌(Pantoea ananatis)P21和明尼苏达被毛孢，保藏号ATCC MYA-31。

前述复合微生物菌剂中还含有添加剂、粘结剂和保护剂；其中，所述的添加剂为二氧化硅（200目）、高岭土、钾长石粉（200目）、沸石粉（200目）、稻壳粉、麦壳粉、秸秆粉等中的一种或多种；所述粘结剂为膨润土或水溶性微生物多糖等；所述保护剂为甘油、脱脂奶、植物油、动物油、海藻酸钠、壳聚糖等中的一种或多种。

前述复合微生物菌剂由如下重量份的组分组成：

菠萝泛菌P21菌剂     1份；

明尼苏达被毛孢菌剂  1份；

添加剂              6～12份；

粘结剂              0.05-0.1份；

保护剂              0.01-0.1份。

优选地，前述复合微生物菌剂由如下重量份的组分组成：

菠萝泛菌P21菌剂       1份；

明尼苏达被毛孢菌菌剂  1份；

添加剂                8～10份；

粘结剂                0.05-0.1份；

保护剂                0.01-0.1份。

其中，菠萝泛菌P21菌剂中活菌数为2×10⁸-3×10⁸cfu/g，明尼苏达被毛孢菌菌剂中活菌数为1×10⁷-1×10⁸cfu/g。

本发明还提供前述复合微生物菌剂在防治作物病害中的应用，所述作物病害为线虫病、根腐病、枯萎病，疫病、立枯病、猝倒病、纹枯病、白绢病和/或白粉病。

本发明还提供前述复合微生物菌剂在提高作物产量中的应用，其是将所述复合微生物菌剂与氮肥、磷肥、钾肥或复合肥混合施用。所述作物优选为水稻、大豆、玉米、小麦、棉花、油菜等。

本发明还提供前述复合微生物菌剂在活化土壤难溶磷以及降低化肥用量中的应用。适宜的土壤为黑土、黑钙土、沙姜黑土、白浆土、褐土、潮土、盐潮土、红壤、水稻土、灰钙土、灰漠土等。

此外，本发明还提供了上述复合微生物菌剂的不同造粒类型，以满足菌剂与不同作物种子播种的应用，包括与大豆、玉米、小麦等机械化播种匹配的颗粒菌剂。

本发明还提供上述复合微生物菌剂与尿素、二铵、红色钾肥、复合肥料等颗粒肥料在机械化施肥中的应用。

本发明的菠萝泛菌P21，是一株高效溶磷促生菌，在使用化肥的土壤条件下，它对我国主要土壤和主要作物都表现出显著的增产作用，一般增产10～20%，甚至达到50%以上。以黑土增产最为显著。适用于大豆、蔬菜、玉米、小麦、棉花、油菜、水稻等主要作物。

本发明的溶磷复合微生物菌剂中明尼苏达被毛孢(Hirsutellaminnesotensis)MYA-31防治作物线虫病害效果显著。

本发明以我国主要土壤为研究对象，进行了广谱高效溶磷微生物菌种的筛选，获得了大量溶磷菌株，经过研究比较这些溶磷菌株与我国主要土壤、主要作物的适应性、溶磷能力及增产效果，获得了一株广泛适用于我国主要土壤类型、主要作物的高效溶磷的菠萝泛菌P21菌剂，特别适合我国南方、北方、西北、东北、西南等地区的典型土壤，为溶磷微生物在土壤磷转化、磷肥高效利用和节约磷肥资源等方面提供了菌种资源和技术支撑。

本发明将广泛适应性的高效溶磷细菌菠萝泛菌P21与高效防治线虫病害的真菌有机地结合起来，通过施用本发明的复合菌剂，在高效利用土壤磷素、提高磷肥利用率的同时，充分发挥微生物防治线虫病害的作用，达到了溶磷增产、防病增产的效果，对我国粮食持续增产、节约磷肥资源、减少线虫病害和保护农田生态环境具有重要意义，特别对于东北大豆产区孢囊线虫以及全国蔬菜产区的线虫防治，具有巨大的应用价值。

本发明的复合微生物菌剂具有高效溶解难溶磷、防治线虫病害和促进作物增产的作用，是一种可有效降低化肥用量、节约化肥资源、防治线虫病害、提高作物产量的复合微生物菌剂，其有益效果为：

（一）溶解难溶磷、促进作物生长效果显著；

（二）防治作物线虫病害；

（三）该菌剂溶磷效果不受化学肥料影响，使用化肥条件下作物持续增产；

（四）使用地域范围广，适用于我国黑土、黑钙土、沙姜黑土、白浆土、褐土、潮土、盐潮土、红壤、水稻土、灰钙土、灰漠土等；

（五）适合提高玉米、大豆、小麦、水稻、棉花、油菜和蔬菜等主要作物的产量；

（六）使用简便，颗粒菌剂可以与大豆、玉米、棉花、小麦播种机一起使用，也可以与多元复合肥、尿素、磷酸二铵、红色钾肥等颗粒肥一起机械施用。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1菠萝泛菌P21菌株的分离、培养以及溶磷菌剂P21的制备

菠萝泛菌P21分离自我国云南昆阳(Kunyang RP)磷矿区的土壤中，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期2012年2月9日，保藏号CGMCC NO.5749。

溶磷促生菠萝泛菌P21的培养及溶磷菌剂P21的制备：

（1）菠萝泛菌P21的培养基

发酵液配方（kg/t发酵液）：磷酸氢二钾0.1，磷酸二氢钾0.1，氯化钠4.3，硫酸镁0.1，淀粉8.6，牛肉膏4.3，蛋白胨4.3，酵母粉4.3，蔗糖8.6，硫酸铵2.6，碳酸钙10，硫酸亚铁0.001，豆油6.8，以水配制。

（2）培养过程

将菠萝泛菌P21菌株接种于牛肉汁蛋白胨培养基上，28～30℃培养48h，然后接入1000mL三角瓶，在30℃，220r/min下，培养36h。按5v/v%接种量接入到50L种子罐中，在220r/min，pH7.5，通气量0.5vvm下，培养2d后，再按10v/v%接种量装入到500L的发酵罐中，在200r/min，pH7.5，通气量0.7vvm下，培养3d。发酵完成后，以1:3～6倍的高岭土吸附，即得溶磷菌剂P21。

实施例2高效溶磷抗病增产复合微生物菌剂的制备

1．明尼苏达被毛孢MYA-31菌的培养

（1）培养基的组成（kg/t发酵液）

可溶性淀粉10kg，黄豆饼粉10kg，玉米粉5kg，葡萄糖1kg，蔗糖10kg，酵母粉5kg，(NH₄)₂SO₄3kg，K₂HPO₄0.2kg，NaCl2.5kg，MgSO₄·7H₂O0.1kg，CaCO₃0.5kg，FeSO₄0.001kg，硼酸（1%）1L，pH7.0，以水配制。

（2）发酵培养过程

将明尼苏达被毛孢MYA-31接种于土豆蔗糖（PDA）培养基上，25～28℃培养3d。将明尼苏达被毛孢菌的孢子接入1000mL三角瓶，26～28℃，220r/min下液体培养36h。然后按1v/v%接种量接入到50L种子罐中，在200r/min，pH7.0，通气量0.7vvm下，培养36h后，再按10v/v%接种量装入到500L的发酵罐中，在220r/min，pH7.0，通气量0.7～1.0vvm下，培养3d。发酵完成后加入保护剂海藻酸钠，以1:3～6倍的二氧化硅吸附。

2．高效溶磷防病增产复合微生物菌剂的制备

向菠萝泛菌P21、明尼苏达被毛孢MYA-31中分别加入保护剂海藻酸钠。菠萝泛菌P21以高岭土吸附，活菌数2×10⁸～3×10⁸cfu/g。明尼苏达被毛孢MYA-31以二氧化硅吸附，该真菌的活菌数为1×10⁷～1×10⁸cfu/g。然后，按照菠萝泛菌P21、明尼苏达被毛孢菌MYA-31菌剂的体积比1:1混合均匀。

3．高效溶磷防病增产复合微生物菌剂造粒

向以上吸附、混合好的菌体中加入适量稻壳粉、秸秆粉和膨润土粘结造粒，根据生产需要形成不同的颗粒粒径菌剂，用于与大豆、玉米、棉花种子一起机械播种施入土壤，或者与尿素、磷酸二铵、钾肥、复合肥等颗粒肥料一起机械施入土壤。

实施例3菠萝泛菌P21培养皿条件下溶磷效果

1．从我国云昆阳磷矿区植物根际土壤样品中，分离筛选了溶磷菠萝泛菌P21，同时，从其他地区土壤样品分离筛选了溶磷菌株P40和P40-2。在室内固体培养皿培养、液体培养基培养条件下，测定了它们的溶磷能力。

溶磷菌株P21溶磷圈与菌落直径比值达到了5.43，溶磷圈内溶解的水溶性溶(P₂O₅)为4.25mg；菌株P40和P40-2的溶磷圈与与菌落直径比值分别为4.00和1.56，溶磷圈内的溶磷量（P₂O₅）分别为3.13和1.22mg，菌株P40和P40-2的溶磷量都低于菌株P21（表1）。

表1溶磷菌株在含Ca₃(PO4)₂培养基上的溶磷圈与菌落的直径比值（d/D）

注：a、b、c表示处理组之间差异显著。

2.在液体培养条件下，进行了菌株P21、P40和P40-2的溶磷试验。结果显示，3株溶磷菌中，以菌株P21从磷酸三钙中溶解出来的有效磷最多，溶磷率最高。经过7天液体条件下培养，接种菌株P21的液体培养基中有效磷达到1485.24mg/L，溶磷率为32.46%；接种菌株P40有效磷达到566.30mg/L，溶磷率12.38%；接种菌株P40-2有效磷达到264.33mg/L，溶磷率仅5.78%（表2）。

表2液体摇瓶体条件下（7d）溶磷菌磷酸三钙的效果（磷酸三钙10.0g/L）

注：a、b、c、d表示处理组之间差异显著。

3.在固体培养基培养条件下，菌株P21能够溶解羟基磷灰石、磷酸锌、磷酸铁三种难溶磷，溶磷圈与菌落的直径比值（d/D）在三种难溶磷培养基上分别达到了5.20、4.30和4.0；菌株P40、P40-2能够溶解羟基磷灰石、磷酸锌两种难溶磷，其中，菌株P40溶磷圈与菌落的直径比值（d/D）在羟基磷灰石、磷酸锌培养基上分别为3.00和5.00，

菌株P40-2分别为3.80和3.68（表3）。

表3溶磷菌在三种难溶磷酸盐固体平板上的溶解圈直径（d/D）

注：a、b、c表示处理组之间差异显著，bc表示该处理组与b、c处理组间差异不显著。

4.高效溶磷菌对土壤难溶磷的溶解效果

培养时间对菌株P21溶解土壤磷有显著影响。菌株P21在灭菌土和不灭菌土中均能够转化土壤难溶磷，提高土壤有效磷的含量，不灭菌土壤溶磷效果好于灭菌土壤。在不灭菌土壤中接种菌株P21培养56d有效磷达到39.70mg/kg，是不接菌处理（9.06mg/kg）的4.38倍；在灭菌土中接种P21菌株56d有效磷达32.36mg/kg，比不接菌对照（10.63mg/kg）提高了3.04倍（表4）。

表4溶磷菌P21在土壤中的溶磷能力（有效磷mg/kg）

5.接种溶磷菌P21对玉米植株全磷含量的影响

在施用4种磷矿石的土壤中，接种溶磷菌P21的玉米植株全磷含量明显高于不接菌处理（表5）。施用菌株P21的晋宁磷矿石、开阳磷矿石、昆阳磷矿石和锦屏磷矿石土壤中种植的植株比对照（CK，不使用菌剂）植株全磷分别提高了1.19倍、3.02倍、0.93倍和4.97倍。表明溶磷菌P21具有提高磷矿石生物有效性的作用。

表5接种高效溶磷菌对植株全磷的影响（mg/盆）

实施例4溶磷菌剂P21在不同土壤上对玉米的促生效果

采用5种土壤分别为黑土、黑钙土、白浆土、潮土、褐土，作物为玉米。试验包括两个处理：（1）对照（CK）不使用菌剂；（2）溶磷菌剂处理，每公斤土壤使用5g溶磷菌剂P21（活菌数为3×10⁸cfu/g），每个处理重复3次。每盆装土（不灭菌）1kg，所有处理都使用尿素、磷酸二氢钠、氯化钾氮磷钾化学肥料，使用量分别为100mg/kg土壤、120mg/kg土壤和80mg/kg土壤(即N-P₂O₅-K₂O:60-55-50mg/kg土壤)。化学肥料、溶磷菌剂与土壤混合均匀，播种5粒发芽一致的玉米种子。第一次浇水250mL/盆，以后保持60～70%的田间持水量，出苗后一周追施0.2%钼酸铵2mL/盆。60d后收获，测定植株生物量。

试验结果表明，使用氮磷钾化学肥料条件下，溶磷菌剂P21菌株仍表现显著的增产效果（表6）。褐土、潮土、白浆土上玉米鲜重生物量分别增加27.18%、10.24%和7.77%，而黑土和黑钙土增加效果较低，仅为2.9%和5.63%；褐土、潮土、白浆土、黑土、黑钙土干重生物量分别增加22.22%、9.09%、10.00%、11.11%和12.50%。溶磷菌剂适合褐土、黑钙土、白浆土、黑土与玉米作物的配合使用，增产效果高于潮土。溶磷菌剂P21可以在正常使用化肥条件下使用。

表6不同土壤条件下溶磷菌剂P21对玉米生物量的作用效果

注：<0.05表示处理间差异显著性达5%标准。

实施例5溶磷菌剂P21在不同土壤上对冬小麦的促生效果

试验土壤为潮土和褐土，作物为小麦。试验包括两个处理：（1）对照（CK）不使用菌剂；（2）溶磷菌剂处理，每公斤土壤使用5g溶磷菌剂P21（活菌数为3×10⁸cfu/g），每个处理重复3次。每盆装土1kg，所有处理都使用尿素、磷酸二氢钠、氯化钾化学肥料，使用量分别为100mg/kg土壤、120mg/kg土壤和80mg/kg土壤(即N-P₂O₅-K₂O:60-55-50mg/kg土壤)。化学肥料、溶磷菌剂与土壤混合均匀，播种8粒发芽一致的小麦种子。第一次浇水250mL/盆，以后保持60～70%的田间持水量，出苗后一周追施0.2%钼酸铵2mL/盆。60d后收获，测定植株生物量。

试验结果表明，在施用化肥条件下，潮土和褐土使用溶磷菌剂P21能够显著提高小麦的生物量（表7）。褐土使用溶磷菌剂P21，小麦鲜重和干重增分别增加43.43%和54.90%；潮土接种溶磷菌剂P21增产略低于褐土，小麦鲜重和干重增加为17.67%和19.64%。溶磷菌剂P21在潮土和褐土上都能够增加小麦生物量，使用化学肥料不影响其增产作用效果。因此，溶磷菌剂P21适合在正常使用化肥条件下使用。

表7不同土壤条件下溶磷菌剂P21对小麦生物量的作用效果

注：<0.05表示处理间差异显著性达5%标准。

实施例6溶磷菌剂P21在不同土壤上对大豆的促生效果

试验土壤为潮土和褐土，作物为大豆。试验包括两个处理：（1）对照（CK）不使用菌剂；（2）溶磷菌剂处理，每公斤土壤使用5g溶磷菌剂P21（活菌数为3×10⁸cfu/g），每个处理重复3次。每盆装土1kg，所有处理都使用尿素、磷酸二氢钠、氯化钾化学肥料，使用量分别为100mg/kg土壤、120mg/kg土壤和80mg/kg土壤(即N-P₂O₅-K₂O:60-55-50mg/kg土壤)。化学肥料、溶磷菌剂与土壤混合均匀，播种6粒发芽一致的大豆种子。第一次浇水250mL/盆，以后保持60～70%的田间持水量，出苗后一周追施0.2%钼酸铵2mL/盆。60d后收获。测定植株生物量。

试验结果表明，在施用化肥条件下，使用溶磷菌剂P21在潮土、黑土2种土壤上都能够提高大豆作物的生物量。黑土上使用溶磷菌剂P21的大豆生物量最高，大豆鲜重和干重分别增加44.44%和61.11%；潮土接种溶磷菌剂P21增产最少，大豆鲜重和干重增加仅为14.9%和23.5%。溶磷菌剂P21在黑土-大豆组合上使用可以获得更高的产量，溶磷菌剂在化学肥料使用条件下提高生物量的效果显著（表8）。

表8不同土壤条件下溶磷菌剂P21对大豆生物量的作用效果

注：<0.05表示处理间差异显著性达5%标准，<0.01表示处理间差异显著性达1%标准。

实施例7使用化学肥料条件下溶磷菌剂P21的增产效果

采用我国9种典型土壤、5种主要栽培作物，土壤盆栽条件下进行了溶磷微生物P21的溶磷促生效果研究。试验包括两个处理：（1）对照（CK）不使用菌剂；（2）溶磷菌剂处理，每公斤土壤使用5g溶磷菌剂P21（3×10⁸cfu/g），每个处理重复3次。每盆装土1kg，所有处理都使用尿素、磷酸二氢钠、氯化钾氮磷钾化学肥料，N、P₂O₅、K₂O用量分别为60mg/kg土壤、55mg/kg土壤、50mg/kg土壤。生长40天收获。

作物生物量鲜重数据结果表明，使用溶磷菌剂P21，所有9中土壤和5种作物都能够增产，增产幅度为增产幅度为18.23%～212.65%。沙姜黑土增产小麦112.06%、盐潮土增产油菜107.22%、潮土增产玉米113.31%、灰漠土增产棉花212.65%；水稻土增产油菜65.16%、黑土增产大豆48.13%、黑土增产玉米62.03%、褐土增产大豆47.67%；灰钙土、白浆土、褐土、黑钙土上玉米和潮土小麦的资产率低于50%(表9)。

作物生物量干重数据显示，使用溶磷菌剂P21，所有9中土壤和5种作物都能够增产，增产幅度为15.35～182.56%。灰漠土增产棉花182.56%，褐土增产大豆108.33%；水稻土增产油菜47.54%、潮土增产玉米56.36%、黑土增产大豆56.52%、黑土增产玉米41.44%、盐潮土增产油菜30.2%；溶磷菌剂P21在灰钙土-玉米、沙姜黑土-小麦、白浆土-玉米、潮土-小麦、褐土-玉米、黑钙土-玉米等组合的增产效果小于30%。

接种溶磷菌剂P21，不同土壤、不同作物效果差异较大，应该将其使用于增产效果最大的土壤类型和作物种类。

表9溶磷菌剂P21在不同土壤条件下对作物生物量的影响（g/盆）

注：<0.05表示处理间差异显著性达5%标准，<0.01表示处理间差异显著性达1%标准。

实施例8溶磷菌剂P21田间施用对玉米的增产作用

田间试验条件下使用溶磷菌剂P21，显著提高春玉米产量。石家庄褐土试验结果显示，与不使用菌剂的对照相比，使用菌剂P21每亩增加玉米255.2kg/亩，增产50.4%（表10）。

表10溶磷菌剂P21田间使用对春玉米的增产效果(石灰型褐土，石家庄)

注：<0.01表示处理间差异显著性达1%标准。

保定市田间条件下褐土试验结果显示，使用溶磷菌剂P21，显著提高夏玉米产量。与不使用菌剂的对照相比，菌剂P21每亩增加玉米71.9kg/亩，增产14.08%（表11）。

表11溶磷菌剂P21田间使用对夏玉米的增产效果

注：<0.01表示处理间差异显著性达1%标准。

实施例9溶磷抗病复合微生物菌剂增产防病效果

在温室条件下进行了青椒、黄瓜、番茄接种复合微生物菌剂试验，结果显示，复合微生物菌剂（实施例2中制备）增产防病效果显著（表12）。青椒接种复合微生物菌剂的植株鲜重31.20g/盆，对照（CK）植株鲜重14.53g/盆，复合菌剂生物量提高53.43%。对照（CK）因疫病死苗率达50%，而接种复合微生物菌剂的植株未染病。

黄瓜接种复合微生物菌剂的植株鲜重16.43g/盆，对照（CK）植株鲜重10.85g/盆，接种复合菌剂生物量比对照提高33.96%。对照（CK）因枯萎病死苗率达33.3%，而接种复合微生物菌剂的黄瓜植株未受病害。

番茄接种复合微生物菌剂的植株鲜重23.67g/盆，对照（CK）植株鲜重11.21g/盆，接种复合菌剂的番茄生物量提高52.64%。对照（CK）因青枯病死苗率达33.3%，而接种复合微生物菌剂的植株没有发生死亡。

表12实施例2中制备的复合微生物菌剂对不同蔬菜增产防病效果

注：<0.05表示处理间差异显著性达5%标准，<0.01表示处理间差异显著性达1%标准。

实施例10溶磷复合菌剂大棚施用对蔬菜的增产作用

在北京市大兴区、北京市昌平区、河北省廊坊市，对实施例2中制备的复合微生物菌剂进行了大棚田间示范，取得了良好的增产抗病效果。

（1）示范地点：河北省廊坊市

大棚面积0.7亩，溶磷抗病生物肥料示范面积0.4亩，重复3次。施用生物菌剂30公斤，撒施后翻地，与表层土壤混匀，对照不使用生物菌剂。对照和菌剂示范田都使用同量复合肥作底肥，每亩地使用复合肥80公斤、腐熟羊粪有机肥1000公斤，冲施肥用量一致。复合肥氮磷钾含量为1:1:1，示范作物为番茄。

结果显示，使用复合微生物菌剂的番茄产量10800kg/亩，使用菌剂番茄生育期间线虫、黑斑病、灰霉病、霜霉病、炭疽病、白粉病没有发生，而对照的白粉病轻微发生，导致减产，番茄产量平均13000kg/亩。使用微生物复合菌剂提高番茄产量2700公斤/亩，增产20.4%。

（2）示范地点：北京市大兴区

大棚面积0.9亩，生物菌剂示范面积0.7亩，施用量每亩75公斤，撒施后翻地，与表层土壤混匀，对照不使用生物菌剂。对照和菌剂示范田都使用同量复合肥和腐熟羊粪，每亩地使用氮磷钾复合肥80公斤、羊粪有机肥1000公斤，冲施肥用量一致。示范作物为黄瓜。

结果显示，使用复合微生物菌剂的黄瓜产量16800kg/亩，黄瓜生育期发没有线虫、白粉病、枯萎病等病害发生，而对照的黄瓜枯萎病、白粉病轻微发生，黄瓜产量平均14100kg/亩。使用微生物菌剂能够提高黄瓜产量2700公斤/亩，增产19.15%。

（3）示范地点：河北省廊坊市

大棚面积0.8亩，溶磷抗病复合肥示范面积0.5亩，每亩生物菌剂施用量40公斤，撒施翻入耕层作为底肥，对照不使用生物菌剂。对照和菌剂示范田都使用同量复合肥作底肥，每亩使用氮磷钾复合肥60公斤、腐熟羊粪有机肥1000公斤，冲施肥用量一致。示范作物为香瓜。

示范结果显示，使用复合菌剂香瓜产量1750公斤/亩，没有发生白粉病、叶霉病、蔓枯病、疫病等病害，不使用微生物菌剂的香瓜白粉病严重发生，香瓜产量仅为1520公斤/亩，使用生物菌剂的香瓜比对照增产18.7%。

表13实施例2中制备的复合微生物菌剂大棚示范结果

注：<0.05表示处理间差异显著性达5%标准，<0.01表示处理间差异显著性达1%标准。

实验例4～8中使用的溶磷菌剂为实施例1中制备的溶磷菌剂P21。

本发明将广泛适应性的高效溶磷增产细菌与高效拮抗土传病害的真菌有机地结合起来，通过施用本发明的复合菌剂，在高效利用土壤磷素、提高磷肥利用率的同时，充分发挥微生物防治土传病害的作用，达到了溶磷增产、抗病增产的效果，具有良好的应用价值。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种复合微生物菌剂，其有效成分为菠萝泛菌(Pantoeaananatis)P21和明尼苏达被毛孢(Hirsutella minnesotensis)；所述菠萝泛菌P21的保藏号为CGMCC NO.5749。

2.根据权利要求1所述的复合微生物菌剂，其特征在于，所述复合微生物菌剂中还含有添加剂、粘结剂和保护剂；

其中，所述的添加剂为二氧化硅、高岭土、稻壳粉、麦壳粉、秸秆粉中的一种或多种；

所述粘结剂为膨润土或水溶性微生物多糖；

所述保护剂为甘油、脱脂奶、植物油、海藻酸钠、壳聚糖中的一种或多种。

3.根据权利要求2所述的复合微生物菌剂，其特征在于，由如下重量份的组分组成：

其中，菠萝泛菌P21菌剂中活菌数为2×10⁸-3×10⁸cfu/g，明尼苏达被毛孢菌菌剂中活菌数为1×10⁷-1×10⁸cfu/g。

4.根据权利要求3所述的复合微生物菌剂，其特征在于，由如下重量份的组分组成：

5.权利要求1-4任一项所述的复合微生物菌剂在防治作物病害中的应用，所述作物病害为线虫病、枯萎病和/或白粉病。

6.权利要求1-4任一项所述的复合微生物菌剂在提高作物产量中的应用，其是将所述复合微生物菌剂与氮肥、磷肥、钾肥或复合肥混合施用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述作物为水稻、大豆、玉米、小麦、棉花、油菜。