CN109220521B - 一种丛枝菌根真菌的培育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物培育领域，为解决现有的用以大量快速地培育丛枝菌根真菌的方法成本高、培养基质制备成本同样较高，其效果也不尽人意等问题，本发明提供了一种丛枝菌根真菌的培育方法。其包括：1)苗床准备：在大棚内的苗床铺设可透气渗水的塑料膜，然后填充丛枝菌根真菌培养基质；2)接种菌种：将菌种接种到苗床内部的丛枝菌根真菌培养基质中；3)作物种植：将已发芽后的宿主植物种植到苗床中，对其进行灌溉、施肥，使得丛枝菌根菌定植到宿主植物根部；4)收获交付：当宿主植物成熟后，停止灌溉，使得丛枝菌根真菌培养基质自然干燥，并将根系从丛枝菌根真菌培养基质中清理，再对丛枝菌根真菌培养基质进行干燥，包装交付市场。
Description
技术领域
本发明涉及微生物培育领域，尤其涉及一种丛枝菌根真菌的培育方法。
背景技术
“菌根”是在1885年德国植物生理学和森林学家Frank首创的一个术语，自然界中存在着一种普遍的植物共生现象，菌根即是指土壤中某些真菌与植物根产生共生后形成的共生体，是由土壤中的菌根真菌菌丝与高等植物营养根系形成的一种联合体。丛枝菌根真菌即是这种能够与高等植物营养根系形成联合体的菌根真菌。丛枝菌根真菌从植物体内获取必要的碳水化合物及其他营养物质，而植物也从真菌那里得到所需的营养及水分等，从而达到一种互利互助、互通有无的高度统一。它既具有一般植物根系的特征，又具有专性真菌的特性。
早在1900年，就研究调查结果就已经表明分布最广、与农业生产关系最为密切的一种内生菌根真菌，它们能在植物根细胞内产生“泡囊”和“丛枝”两大典型结构，名为“泡囊-丛枝菌根”(Vesicular-Arbuscular mycorrhiza,VAM)，但由于部分真菌不再跟内产生泡囊结构，但都形成丛枝，因此称之为丛枝菌根真菌。
现有的培育丛枝菌根真菌的方法包括有盆栽培养法(Pot culture)、培养基培养法(Medium culture)、静止营养液培养法(Resting hydroponic culture)、营养流动液培养法(Nutrition flow culture)、汽雾培养法(Aeroponic culture)、玻璃珠分室培养法(Glass beads split-compartment culture)、离体无菌纯培养(In vitro axenicculture)、AM真菌与植物根气管的双重无菌培养法(Dual axenic culture)、AM真菌与RiT-DNA转型根的双重单胞无菌培养法(Dual monoaxrnic culture of AM fungi with RiT-DNA transformed root)和AM真菌与Ri T-DNA转型根双重培养的改良分室单胞培养系统(Improved the split-plate monoaxenic culture system of AM fungi with Ri T-DNAtransformed root)等，其培育过程中大多都对培养基质的要求较高，现有的用以大量快速地培育丛枝菌根真菌的培养基质制备成本较高，其效果也并无突出的地方，且上述方法中大多不利于工厂化生产，制备繁琐、成本过高，因此，研究一种低成本高效的培育方法和制备一种普适性强且效果优异的培养基质是进一步提高所培育丛枝菌根真菌产量与质量的关键。
中国专利局于2012年5月30日公开了一种丛枝菌根真菌孢子的高密度纯种生产方法的发明专利授权，授权公告号为CN101565689B，其中公开了一种改进合成培养基，所述改进合成培养基中含有：硫酸镁720-740mg/L、硝酸钾70-90mg/L、氯化钾55-75mg/L、硝酸钙270-290mg/L、EDTA铁钠盐5-12mg/L、肌醇40-60mg/L、硫酸锰0.01-0.08mg/L、硫酸铜0.01-0.03mg/L、硼酸0.3-0.6mg/L、硫酸锌0.1-0.4mg/L、碘化钾0.01-0.03mg/L、钼酸钠0.01-0.03mg/L、氯化钴0.01-0.04mg/L、维生素B0.1-0.3mg/L、咇哆醇0.1-0.3mg/L、烟酸0.2-0.8mg/L、蔗糖7500-8500mg/L、葡萄糖4500-5500mg/L和植物胶3500-4500mg/L，并且其所用的RT培养基为在改进合成培养基中减少蔗糖和葡萄糖两个组分，并加入培养基重量0.1-0.2％的酒石酸氨和培养基体积2-5％的根浸出液。其是一种液态培养基质，而丛枝菌根真菌是一种需氧型真菌，其氧气浓度较低导致丛枝菌根真菌繁殖速度较慢，虽提供了大量养分，但氧气供给不足是一大缺陷。此外，该专利所公开的培育方法虽能够培育出高纯度且高密度的丛枝菌根真菌，但其操作较为复杂，对工作环境要求较高，成本较大，同样也不利于工厂化培育生产丛枝菌根真菌。
发明内容
为解决现有的用以大量快速地培育丛枝菌根真菌的方法成本高、培养基质制备成本同样较高，其效果也不尽人意等问题，本发明提供了一种丛枝菌根真菌的培育方法。其主要目的是降低培育丛枝菌根真菌的成本，并在此基础上提高对丛枝菌根真菌的培育效果。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种丛枝菌根真菌的培育方法，所述方法包括以下步骤：
1)苗床准备：在大棚内的苗床底部以及边缘铺设可透气渗水的塑料膜，然后向其内部填充丛枝菌根真菌培养基质；
2)接种菌种：将菌种接种到苗床内部的丛枝菌根真菌培养基质中；
3)作物种植：将已发芽后的宿主植物种植到苗床中，对其进行灌溉、施肥，使得丛枝菌根菌定植到宿主植物根部；
4)收获交付：当宿主植物成熟后，停止灌溉，使得丛枝菌根真菌培养基质自然干燥，并将根系从丛枝菌根真菌培养基质中清理，再对丛枝菌根真菌培养基质进行干燥，包装交付市场。
本发明培育方法操作简便，可在现有苗床上直接进行改进培育并可进行工厂化大规模生产培育，且培育成本较低，在培育的同时丛枝菌根真菌的同时可以对选择经济型宿主植物进行同时培育，既能够降低成本又能够实现效益最大化。此外本发明方法所培育出的丛枝菌根真菌的孢子密度更是远大于普通的培育方法。
作为优选，所述所述丛枝菌根真菌培养基质为膨润土陶砂。
膨润土陶砂由膨润土通过热胀研磨等工艺制程方便地制得，具有低成本和加工方便的优点，其使用的膨润土是以蒙脱石为主要矿物成分的非金属矿产，蒙脱石结构是由两个硅氧四面体夹一层铝氧八面体组成的2：1型晶体结构，由于蒙脱石晶胞形成的层状结构存在某些阳离子，如Cu、Mg、Na、K等，且这些阳离子与蒙脱石晶胞的作用很不稳定，在作为培养基质培育丛枝菌根真菌时，加水后可在膨润土陶砂表面形成含合适浓度游离离子的富集层作为营养成分供给给丛枝菌根真菌发育、繁殖所需，极大地降低了向培养基质中添加金属盐成分所需的成本，另一方面，游离离子能够持续性地游离产生，使得整体培育环境中游离金属离子成分处于一个合适范围内，并可持续较长时间，而非通常的液态培养基质中离子浓度相对固定，并在开始培育丛枝菌根真菌后逐步下降，使得培育效果更佳。除此以外，由膨润土热胀后形成的膨润土陶砂具有丰富的多孔结构，由于其多孔结构的存在其内部含有丰富的氧气，所形成的有氧环境也十分有利于丛枝菌根真菌的培育，极大程度地提升了培育丛枝菌根真菌的效果，而膨润土陶砂中随着Cu、Mg、Na和K等元素的流失，其多孔结构更加丰富，形成了更大的比表面积，为丛枝菌根真菌的生长和繁殖提供了更多的载体，形成更有利于生长和繁殖的环境。实现了降低成本和提高丛枝菌根真菌培育效果的目的。
作为优选，所述膨润土陶砂为0.5～4.5mm粒径的球形颗粒。
膨润土陶砂粒径可根据条件进行调节，粒径越细则比表面积越大，粒径越粗则其中含氧量也会相应提升。可根据如大量培育或快速培育丛枝菌根真菌等目的进行调节。球形颗粒的膨润土陶砂相较于其余异形或不规则颗粒膨润土陶砂，其中所培育出的活性孢子数跟高，且球形颗粒的膨润土陶砂在机械化填充苗床的过程中，在管道中输送更加方便，不会产生卡料等问题，容易进行施用的机械化操作。
作为优选，所述膨润土陶砂基底经过改性处理，所述改性处理步骤为：将膨润土陶砂浸渍于改性液中，对其在低压条件下进行超声震荡，随后取出置于75～85℃条件下干燥2～3h。
对膨润土陶砂进行改性处理可利用膨润土陶砂多孔结构产生的优异吸附性能，对更多种类丛枝菌根真菌生长所需的营养成分进行吸收，以提高其培育丛枝菌根真菌的效果。低压和超声震荡能够进一步提高其吸附吸收的效率。
作为优选，所述改性处理中所用的改性液中包含以下浓度物质：硫酸亚铁70～80mg/L、硫酸锰0.1～0.15mg/L、硝酸铜0.03～0.05mg/L、硝酸锌0.03～0.08mg/L、维生素B210～12mg/L、维生素B30.8～1.2mg/L、维生素B60.5～0.9mg/L、蔗糖9500～11000mg/L、葡萄糖2200～2800mg/L、赖氨酸135～170mg/L、乙二胺四乙酸二钠150～180mg/L、钼酸钠0.001～0.002mg/L和氯化钴0.0001～0.0002mg/L。
以上各成分均是丛枝菌根真菌生长繁殖所需的营养成分，有利于提高培育效果。
作为优选，所述改性处理中所用的改性液中包含以下浓度物质：硫酸亚铁75～77.5mg/L、硫酸锰0.12～0.14mg/L、硝酸铜0.035～0.04mg/L、硝酸锌0.05～0.065mg/L、维生素B2 10.5～11mg/L、维生素B3 1.05～1.1mg/L、维生素B60.65～0.8mg/L、蔗糖9800～10300mg/L、葡萄糖2350～2500mg/L、赖氨酸150～160mg/L、乙二胺四乙酸二钠155～165mg/L、钼酸钠0.0015～0.0018mg/L和氯化钴0.00013～0.00018mg/L。
以膨润土陶砂的吸收吸附能力吸收以上浓度的各组分，其在培育过程中所释放、产生的营养成分最有利与丛枝菌根真菌的生长和繁殖。
作为优选，所述低压条件为环境气压≤0.3atm。
在该压力条件下能够大幅度加快膨润土陶砂对改性液中营养成分的吸收吸附。
作为优选，所述超声震荡频率为20～30kHz。
该频率的超声震荡既能够有效提高膨润土陶砂吸附吸收营养成分的效率，又能够避免超声震荡频率过高对膨润土陶砂的结构造成损坏。
作为优选，所述超声震荡时间为20～30min。
超声时间过长则会使膨润土陶砂的多孔结构变得松散、对多孔结构造成损坏，时间过短则对营养成分的吸附吸收不完全，在该时间范围内最为合适。
作为优选，步骤2)所述菌种中丛枝菌根真菌为根内球囊霉、苏格兰球囊霉、地表球囊霉或摩西球囊霉中的任一种。
可培育的丛枝菌根真菌种类较多，适用性较强。
本发明的有益效果是：
1)显著降低了丛枝菌根真菌培养基质的制备成本；
2)相较于现有的培育方法和培养基质，本发明的培育方法和培养基质能够产生更加优秀的培育效果；
3)能够自由实现快速培育和大量培育丛枝菌根真菌等效果。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作出进一步清楚详细的描述说明。本领域普通技术人员在基于这些说明的情况下将能够实现本发明。此外，下述说明中涉及到的本发明的实施例通常仅是本发明一分部的实施例，而不是全部的实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1
丛枝菌根真菌培养基质的制备，所述丛枝菌根真菌培养基质为粒径0.5mm的膨润土陶砂，并且膨润土陶砂经过改性处理，所述改性处理步骤为：将膨润土陶砂浸渍于改性液中，对其在0.3atm的低压条件下进行超声震荡20min，超声震荡频率为30kHz，随后取出置于75℃条件下干燥3h；
上述的改性液中含有：硫酸亚铁70mg/L、硫酸锰0.1mg/L、硝酸铜0.03mg/L、硝酸锌0.03mg/L、维生素B2 10mg/L、维生素B30.8mg/L、维生素B60.5mg/L、蔗糖9500mg/L、葡萄糖2200mg/L、赖氨酸135mg/L、乙二胺四乙酸二钠150mg/L、钼酸钠0.001mg/L和氯化钴0.0001mg/L。
实施例2
丛枝菌根真菌培养基质的制备，所述丛枝菌根真菌培养基质为粒径4.5mm的膨润土陶砂，并且膨润土陶砂经过改性处理，所述改性处理步骤为：将膨润土陶砂浸渍于改性液中，对其在0.3atm的低压条件下进行超声震荡30min，超声震荡频率为20kHz，随后取出置于85℃条件下干燥2h；
上述的改性液中含有：硫酸亚铁80mg/L、硫酸锰0.15mg/L、硝酸铜0.05mg/L、硝酸锌0.08mg/L、维生素B2 12mg/L、维生素B3 1.2mg/L、维生素B60.9mg/L、蔗糖11000mg/L、葡萄糖2800mg/L、赖氨酸170mg/L、乙二胺四乙酸二钠180mg/L、钼酸钠0.002mg/L和氯化钴0.0002mg/L。
实施例3
丛枝菌根真菌培养基质的制备，所述丛枝菌根真菌培养基质为粒径2.0mm的膨润土陶砂，并且膨润土陶砂经过改性处理，所述改性处理步骤为：将膨润土陶砂浸渍于改性液中，对其在0.3atm的低压条件下进行超声震荡25min，超声震荡频率为25kHz，随后取出置于80℃条件下干燥2.5h；
上述的改性液中含有：硫酸亚铁75mg/L、硫酸锰0.12mg/L、硝酸铜0.035mg/L、硝酸锌0.05mg/L、维生素B2 10.5mg/L、维生素B31.05mg/L、维生素B60.65mg/L、蔗糖9800mg/L、葡萄糖2350mg/L、赖氨酸150mg/L、乙二胺四乙酸二钠155mg/L、钼酸钠0.0015mg/L和氯化钴0.00013mg/L。
实施例4
丛枝菌根真菌培养基质的制备，所述丛枝菌根真菌培养基质为粒径4.0mm的膨润土陶砂，并且膨润土陶砂经过改性处理，所述改性处理步骤为：将膨润土陶砂浸渍于改性液中，对其在0.3atm的低压条件下进行超声震荡25min，超声震荡频率为25kHz，随后取出置于80℃条件下干燥2.5h；
上述的改性液中含有：硫酸亚铁77.5mg/L、硫酸锰0.14mg/L、硝酸铜0.04mg/L、硝酸锌0.065mg/L、维生素B2 11mg/L、维生素B3 1.1mg/L、维生素B60.8mg/L、蔗糖10300mg/L、葡萄糖2500mg/L、赖氨酸160mg/L、乙二胺四乙酸二钠165mg/L、钼酸钠0.0018mg/L和氯化钴0.00018mg/L。
实施例5
丛枝菌根真菌培养基质的制备，所述丛枝菌根真菌培养基质为粒径4.0mm的膨润土陶砂，并且膨润土陶砂经过改性处理，所述改性处理步骤为：将膨润土陶砂浸渍于改性液中，对其在0.3atm的低压条件下进行超声震荡25min，超声震荡频率为25kHz，随后取出置于80℃条件下干燥2.5h；
上述的改性液中含有：硫酸亚铁76.5mg/L、硫酸锰0.125mg/L、硝酸铜0.035mg/L、硝酸锌0.055mg/L、维生素B2 10.5mg/L、维生素B3 1.1mg/L、维生素B60.7mg/L、蔗糖9800mg/L、葡萄糖2400mg/L、赖氨酸155mg/L、乙二胺四乙酸二钠160mg/L、钼酸钠0.0016mg/L和氯化钴0.00015mg/L。
实施例6～10
一种丛枝菌根真菌的培育方法，利用实施例1～5所制得的丛枝菌根真菌培养基质进行丛枝菌根真菌培育，其培育方法包括以下步骤：
1)苗床准备：在大棚温室中使用石材围砌成3米宽，30厘米高的苗床，苗床底部以及边缘铺设可透气渗水的塑料膜，然后向其内部填充丛枝菌根真菌培养基质；
2)接种菌种：将菌种接种到苗床内部的丛枝菌根真菌培养基质中；
3)作物种植：将已发芽后的宿主植物种植到苗床中，以无氯化处理的水进行灌溉，对其施肥及时补充NPK以及其他微量元素，使得丛枝菌根菌定植到宿主植物根部，同时当宿主植物开花后及时彻底剪除花蕊以及花蕾并清理出大棚温室；
4)收获交付：当宿主植物成熟后，停止灌溉，使得丛枝菌根真菌培养基质自然干燥，宿主植物死亡后保持其原始状态2个月，然后剪去地上秸秆部分并清理丢弃，并将根系从丛枝菌根真菌培养基质里挖出后清理出暖房，再将丛枝菌根真菌培养基质进行干燥直到含水量降低到15％，包装交付市场。
以上步骤的具体参数如下表表1所示。
表1丛枝菌根真菌培育步骤具体参数
以上实施例6～10培育方法所得结果如下表表2所示。
表2实施例6～10培育方法所得结果
从表2可明显看出，本发明丛枝菌根真菌的培育方法具有优秀的培育丛枝菌根真菌的效果。
Claims (7)
1.一种丛枝菌根真菌的培育方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)苗床准备：在大棚内的苗床底部以及边缘铺设可透气渗水的塑料膜，然后向其内部填充丛枝菌根真菌培养基质；
2)接种菌种：将菌种接种到苗床内部的丛枝菌根真菌培养基质中；
3)作物种植：将已发芽后的宿主植物种植到苗床中，对其进行灌溉、施肥，使得丛枝菌根菌定植到宿主植物根部；
4)收获交付：当宿主植物成熟后，停止灌溉，使得丛枝菌根真菌培养基质自然干燥，并将根系从丛枝菌根真菌培养基质中清理，再对丛枝菌根真菌培养基质进行干燥，包装交付市场；
所述丛枝菌根真菌培养基质为膨润土陶砂；
所述膨润土陶砂基底经过改性处理，所述改性处理步骤为：将膨润土陶砂浸渍于改性液中，对其在低压条件下进行超声震荡，随后取出置于75～85℃条件下干燥2～3h；
所述改性处理中所用的改性液中包含以下浓度物质：硫酸亚铁70～80mg/L、硫酸锰0.1～0.15mg/L、硝酸铜0.03～0.05mg/L、硝酸锌0.03～0.08mg/L、维生素B210～12mg/L、维生素B30.8～1.2mg/L、维生素B60.5～0.9mg/L、蔗糖9500～11000mg/L、葡萄糖2200～2800mg/L、赖氨酸135～170mg/L、乙二胺四乙酸二钠150～180mg/L、钼酸钠0.001～0.002mg/L和氯化钴0.0001～0.0002mg/L。
2.根据权利要求1所述的一种丛枝菌根真菌的培育方法，其特征在于，所述膨润土陶砂为0.5～4.5mm粒径的球形颗粒。
3.根据权利要求1所述的一种丛枝菌根真菌的培育方法，其特征在于，所述改性处理中所用的改性液中包含以下浓度物质：硫酸亚铁75～77.5mg/L、硫酸锰0.12～0.14mg/L、硝酸铜0.035～0.04mg/L、硝酸锌0.05～0.065mg/L、维生素B2 10.5～11mg/L、维生素B3 1.05～1.1mg/L、维生素B6 0.65～0.8mg/L、蔗糖9800～10300mg/L、葡萄糖2350～2500mg/L、赖氨酸150～160mg/L、乙二胺四乙酸二钠155～165mg/L、钼酸钠0.0015～0.0018mg/L和氯化钴0.00013～0.00018mg/L。
4.根据权利要求1所述的一种丛枝菌根真菌的培育方法，其特征在于，所述低压条件为环境气压≤0.3atm。
5.根据权利要求1所述的一种丛枝菌根真菌的培育方法，其特征在于，所述超声震荡频率为20～30kHz。
6.根据权利要求1所述的一种丛枝菌根真菌的培育方法，其特征在于，所述超声震荡时间为20～30min。
7.根据权利要求1所述的一种丛枝菌根真菌的培育方法，其特征在于，步骤2)所述菌种中丛枝菌根真菌为根内球囊霉、苏格兰球囊霉、地表球囊霉或摩西球囊霉中的任一种。
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