CN105462873A

CN105462873A - 一种制造苜蓿根瘤菌剂的方法、由该方法制得的菌剂及其应用

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Publication number: CN105462873A
Application number: CN201510785842.7A
Authority: CN
Inventors: 王跃栋; 王伟; 苏爱莲; 刘自学; 范龙; 刘艺杉; 侯湃; 王圣乾
Original assignee: Beijing Clover Seed & Turf Co
Current assignee: Beijing Clover Seed & Turf Co
Priority date: 2015-11-17
Filing date: 2015-11-17
Publication date: 2016-04-06

Abstract

本发明提供了一种制造苜蓿根瘤菌剂的方法、由该方法制得的菌剂及其应用。本发明的所述方法包括如下步骤：S1：获得苜蓿根瘤菌的菌液；S2：获得包含高岭土粉末和膨润土粉末的粉剂，所述高岭土粉末和所述膨润土粉末的粒度20微米至100微米；S3：将所述菌液与所述粉剂混合、干燥并粉碎，从而获得所述粉剂吸附有苜蓿根瘤菌的所述菌剂。本发明所述的苜蓿根瘤菌剂具有有效活菌数高、保存期长、环境友好、适合于商品化和工业化生产等优点。

Description

一种制造苜蓿根瘤菌剂的方法、由该方法制得的菌剂及其应用

技术领域

本发明属于农业微生物技术领域，具体的说，本发明涉及一种高稳定性的苜蓿根瘤菌剂及其制造方法和应用。

背景技术

根瘤菌能与豆科植物形成共生固氮体已是一个不争的话题，但什么样的根瘤菌能与豆科植物形成共生体则随着根瘤菌范围的扩大及根瘤菌多样性的增加而变得日益复杂。豆科牧草能与根瘤菌共生固氮，只有土壤中存在某一豆科牧草所专有的细菌并达一定数量时，这种根瘤才能形成。这种能使豆科牧草根上形成根瘤的细菌，称为根瘤菌。根瘤菌能从空气中固定游离的氮，转变成豆科牧草便于吸收利用的含氮化合物，供豆科牧草生长之需。对于豆科牧草来说，与根瘤菌的共生固氮作用，是增加草产量、节省氮肥用量的有利特性。而根瘤菌的有无与多少、固氮率的高低，会直接影响草产量的多少。因此在未种植过相应种类的豆科牧草的地区，接种根瘤菌与否是种植豆科牧草成功的关键。即使是种植过豆科牧草的地区，接种高效的根瘤菌种，也是增加草产量的有效措施。因此，在播种前对豆科牧草种子进行根瘤菌接种，能提高牧草产量和品质。

目前我国农牧业生产中每年施用的化肥氮量已达2400多万吨，占我国化肥养分施用总量的60％左右，占世界氮肥总施用量的30％左右，居世界之首。施用氮肥对我国农业生产的发展起到了十分重要的作用。但是，近年来我国氮肥施用的增产效果趋于降低，而环境污染则趋于加重，引起了国内外的广泛关注。

在缺氮土壤中，接种根瘤菌的豆科植物其氮素营养约有2/3来自共生固氮，仅有1/3是从土壤中吸收来的。豆科植物如果接种适合的根瘤菌，每个生长季节每公顷可固氮150kg～200kg甚至更多，接种根瘤菌除能改善豆科植物本身的生长外，还可以为与其共生的非豆科植物提供氮素营养，因此豆科植物接种根瘤菌可以减少氮肥的大量使用，既能减少化学氮肥用量，又能减轻大量使用化学氮肥所造成的土壤结构破坏和地下水污染。因此，豆科植物接种根瘤菌对减少氮肥的投入成本，提高肥料利用率，改善植物生长具有重要意义，也是防止水土流失，改善生态环境的一个重要措施。

近十年来，我国豆科植物接种根瘤菌的面积并没有进一步增加。据估计，接种根瘤菌的仅占豆科植物总播种面积的2～3％，与国外30～50％的接种率相比差距很大，其主要原因是我国生产的根瘤菌剂质量不高。在美国有80％的紫花苜蓿在种植前需要进行根瘤菌接种。接种根瘤菌能提早紫花苜蓿结瘤、提高紫花苜蓿的产量和品质，还能起到增加土壤有机质含量，改良土壤结构和提高土壤肥力等作用。国内根瘤菌剂的应用效果均表明，接种根瘤菌剂能使紫花苜蓿干草产量提高37％以上，结瘤量提高70％。

根瘤菌的特异性很强，不同种族具有专一性。某一族的根瘤菌只能对本族的几个豆科属、种有效，并可以相互接种，而对不同族的豆科植物则表现无效。如苜蓿根瘤菌对三叶草则不起作用，不能形成根瘤。因此对于不同种豆科牧草需选用其专有的根瘤菌接种才能发挥作用。根据牧草和根瘤菌的特异性关系，可将根瘤菌分为3类：

(1)高度特异型：必须要专性根瘤菌接种，这些根瘤菌包括三叶草族、菜豆族、大豆族等，分别只侵染本属植物或其属内的若干种。

(2)特异型：必须用专性根瘤菌接种，但这些根瘤菌不但可侵染本属，而且可以接种于近缘属种，这类根瘤菌包括苜蓿族、豌豆族、羽扇豆族等，如苜蓿族可接种于苜蓿属(Medicago)、草木樨属(Melilotus)和胡卢巴属(Trigonellea)。豌豆族可接种于豌豆属(Pisum)、巢菜属(Vicia)、山黧豆属(Lathyrus)和兵豆属(Lens)。羽扇豆族可接种于羽扇豆属(Lupinus)和乌足豆属(Ornithopus)。

(3)非特异型：其根瘤菌能侵染的植物属种很多。如豇豆族可接种于豇豆属(Vigan)、胡枝子属(Lenspedeza)、花生属(Arachis)、木兰属(Indigofera)等10多个属。

与本发明相关的现有技术的技术方案及工艺流程可以参见图1。现有技术方案可以大致分为如下三种方案。

(一)方案一

(1)培养基的成分

甘露醇10g或甘油5mL+蔗糖5g，K₂HPO₄0.5g，MgSO₄0.2g，NaCl0.1g，酵母膏1g，CaCO₃0.2g，0.5％硼酸溶液4mL，0.5％钼酸钠4mL，琼脂18～20g，pH值为7～7.2.压力灭菌30s，培养温度28～30℃。

(2)摇瓶培养

每升培养基加水500mL，在28～30℃温度条件下培养，转速为20转/分钟。菌种按10％的接种量接种并培养在种子罐中，通气0.4～0.8k·m-3·s-1，搅拌速度120～200转，接种24h后，每隔12h取样检查菌数增加情况，菌数可达20～30亿/mL。

(3)发酵罐培养

将种子罐内培养好的菌种接入到发酵罐中，接种量10％～20％，菌数20亿/mL.混拌吸附将草炭干燥，粉碎过筛.灭菌温度下降到40℃，混拌.菌液∶草炭＝1/3∶4，拌入0.05％钼酸铵，搅拌后含水30％以上。

(4)产品

合格根瘤菌剂细胞＞1.4亿，杂菌＜10％，有效期在5℃以下，工厂储存6个月，销售到户时6个月内菌数达到1亿以上.

(二)方案二

(1)培养基如下

“标准79”培养基：普通糖10克(加入甘油约2毫升)，K₂HPO₄0.5克，MgSO₄·7H₂O0.1克，食盐0.1克，CSO₄0.2克，酵母片10片，冷开水1000毫升。

(2)操作

1.菌种：取得菌种斜面，移植到上述培养基的试管斜面上，保温培养。一切按无菌操作进行，种子菌必须纯净。转移接种时最好多刮一些移到新斜面试管。新长起来的菌管斜面，转移新斜面就比较容易生长，但一般3～5天后才能逐渐看到白色，平滑，边缘齐整，突起的菌苔。

2.培养：将上述培养液注入小口玻璃瓶中，大约1/4满。其大小以约一立升为好。用棉花或多层纱布塞满瓶颈和瓶口并用两层纸包扎瓶口，按规定操作高压灭菌半小时。最好在灭菌后趁温度下降到不烫手时即抢温接种，保温时可把瓶斜卧放以便菌面多接触空气。接种后1-3天应当将瓶振荡得频繁一些，每天3-5次，每次数分钟，以利好气性的根瘤菌生长，不利嫌气性的杂菌生长。如果开始1-2天即呈现混浊，有时还有气泡发生，有酸臭，是杂菌占了上风，培养失败了，应当废弃。如果培养3-5天后液体逐渐由澄倩而混浊这是正常现象，再坚持人工振摇几天即可移放低温处备用。

(三)方案三

目前，国内外大都利用自动化发酵技术来获得制备根瘤菌剂所需的高密度细胞培养液。大致流程为：菌种的斜面活化→一级种子液培养→二级种子液培养→发酵罐内扩大培养→高密度菌剂的获得。在此期间，发酵培养基种类繁多，有较为常用的以甘露醇-酵母粉为主的YMA培养基，以豆芽汁为主要成分的BSE培养基，成分较为简单的YA、TY培养基，较为复杂的AMM、SM培养基，近期诸如以糖废料为底物的一些新型培养基也时有报道，具体采用何种培养基，还需根据不同菌体的生化特性而定。发酵条件通常为：通气0.4～0.8kg·m³·s^-1，搅拌速度120～200r·min^-1，温度28～30℃，接种量1％～10％，种子液的装液量20％～60％。放罐时间则根据各种类型根瘤菌的生长状况而定，经过相应时间的培养，菌数大都超过1010CFU·mL^-1。

现有技术工艺流程所制得的苜蓿根瘤菌剂主要有如下缺点。首先，菌剂含菌数量低，是当前尤其是我国根瘤菌剂生产中存在的一个突出问题。我国豆科牧草菌根瘤菌剂每克含菌数仅3-5亿个(快生型菌剂5亿个/克左右，慢生型菌剂1-3亿个/克)。本发明人认为，为进一步提高菌剂含菌数，一方面要深入研究发酵工艺，提高每毫升菌液的含菌数量；另一方面要改进草炭(目前草炭细度仅80-100目)的粉碎技术，以增加草炭对菌液的吸附量，从而提高菌剂的含菌数。第二个问题是菌剂长途运输，不但会对菌剂质量造成影响，例如我国幅员辽阔，西北、西南一些省区有时甚至还不能在播种前收到菌剂。第三个问题是用手工方法进行丸衣化接种，工效太低，不能适应大面积飞播的需要；如果能够采用包裹种子丸衣的设备，牧草种子接种根瘤菌后再裹上杀虫药及各种肥料，经风干后丸衣种子从丸衣机出来，即可用于飞播。另外，目前不仅需要进一步提高菌剂质量，增加产量和改善菌剂供应工作，而且还需要进一步加强菌剂应用技术推广工作。尽管如此，由于我国根瘤菌剂产业起始阶段发酵水平低、保质期短和技术不成熟、质量不过关等问题，使根瘤菌剂的产业化和大面积推广应用受限制。

发明内容

本发明要解决的是常规苜蓿根瘤菌存在的如下一个或者多个技术问题：(1)根瘤菌固氮效率低；(2)根瘤菌不适合于工业化生产加工；(3)菌剂产品稳定性差；(4)菌剂产品有效性低；(5)菌剂产品保质期短。

为了解决上述一个或者多个技术问题，本发明提供了一种制造苜蓿根瘤菌剂的方法以及由该方法制得的苜蓿根瘤菌剂和该菌剂在种植豆科植物中的应用。

本发明的一方面提供了一种制造苜蓿根瘤菌剂的方法，所述方法包括如下步骤：

S1：获得苜蓿根瘤菌的菌液；

S2：获得包含高岭土粉末和膨润土粉末的粉剂，所述高岭土粉末和所述膨润土粉末的粒度20微米至100微米；

S3：将所述菌液与所述粉剂混合、干燥并粉碎，从而获得所述粉剂吸附有苜蓿根瘤菌的所述菌剂。

本发明在第二方面提供了根据本发明第一方面所述的方法制得的苜蓿根瘤菌剂。

本发明在第三方面提供了本发明的第一或第二方面所述的苜蓿根瘤菌剂在种植豆科植物中的应用。

本发明具有如下特点：A.制剂先进，采用功能独特的高岭土和膨润土组合的载体，载体流动性好，并具有静电吸附功能，能使根瘤菌均匀而牢固地吸附在种子表面；高岭土和膨润土这两种载体的组合在常温下对菌液的吸附效果好，从根本上解决超细载体对菌液吸附缓慢、吸附差的难题；在本发明的一些优选的实施方式中，所制得的苜蓿根瘤菌剂的细度高达125微米，流动性好，并具有静电吸附功能，能使根瘤菌均匀而牢固地吸附在种子表面(国内主要产品细度为180微米，且不具备静电吸附功能。B.有效活菌数高，是国内同类产品3倍以上；通过该项技术所生产的苜蓿根瘤菌，有效活菌数大于5亿个/克，最高含量超过15亿个/克，远远高于国内其他同类产品(国内主要产品有效活菌数一般为大于2亿个/克)。C.产品可以在0～20℃的温度下下保存12个月以上，远远超出了国内保质期为6个月的水平；本发明制得的苜蓿根瘤菌粉剂的含水量在4％～8％之间，而国内其他主要产品含水量为20％～35％，本产品实现了苜蓿根瘤菌在低水分条件下高效存活；通过该项技术所生产的苜蓿根瘤菌可以在常温(0～20℃)条件下保存12个月以上，远远超出了国内保质期为6个月的水平。D.生产过程中进行水的循环利用，无任何废水排放，因此不存在污染环境的问题，其终端产品根瘤菌剂属于微生物菌肥，对人畜无毒害作用，亦不污染环境。

本发明不但可以使我国根瘤菌剂生产技术在短期内接近甚至达到国际先进水平，还能借助本发明的实施，充分利用我国根瘤菌资源丰富的优势，利用已经筛选出来或者已经商品化的根瘤菌株，完成根瘤菌剂生产技术的商品化、工业化生产，培育和完善现有的根瘤菌剂生产和销售体系，推动国产根瘤菌剂的应用和推广。

附图说明

图1是现有技术的工艺流程图。

图2是根据本发明的一个优选的实施方式的工艺流程。

图3是保存期根瘤菌剂含水量与有效活菌数量动态图

具体实施方式

本发明在第一方面提供了一种制造苜蓿根瘤菌剂的方法，所述方法包括如下步骤：

S1：获得苜蓿根瘤菌的菌液；

高岭土和膨润土均为惰性物质，具有很好的稳定性、安全性、粉碎性、粘合性、分散性等特点。而且，更为重要的是，本发明人发现，粒度为100微米以下时，高岭土粉末和膨润土粉末的组合的载体流动性非常好，并具有静电吸附功能，非常适合用于苜蓿根瘤菌的吸收，并且能使根瘤菌均匀而牢固地吸附在种子表面。于是，在一些实施方式中，所述高岭土粉末和/或所述膨润土粉末的粒度为20微米至100微米；例如为96、90、86、80、75、62、61、58、50、48、45、38、25、23或20微米。另外，本发明人发现，如果粒度过低，则对菌液吸附缓慢、吸附较差；如果粒度过大，就无法使菌剂具有令人满意的含菌量。在一些更优选的实施方式中，所述高岭土粉末和/或所述膨润土粉末的粒度为25微米至50微米；进一步优选的是，所述高岭土的粒度为38微米至48微米，所述膨润土的粒度为38微米至45微米。最优选的是，所述高岭土的粒度为48微米，所述膨润土的粒度为45微米，并且所述高岭土和所述膨润土的体积比为2∶1。

在一些优选的实施方式中，所述菌液与所述粉剂的体积比为1∶2至1∶4，例如为1∶2、1∶3或者1∶4。更优选的是，所述所述菌液与所述粉剂的体积比为1∶2.8。

在一些优选的实施方式中，所述粉剂中的高岭土粉末与所述膨润土粉末的质量比为5∶1至1∶1，例如为5∶1、4∶1、3∶1、2∶1或1∶1，更优选为2∶1。

在一些优选的实施方式中，在进行固体吸附(利用固体粉剂吸收液态菌液)时，将所述粉剂放入搅拌机并搅拌均匀，将所述菌液加入发酵罐并且将灌内气压提高到例如1.5MPa，在搅拌机搅拌的同时使发酵罐内的所述菌液流到搅拌机中并且在5分钟内优选在2分钟内完成搅拌。

例如，在固体吸附的一些优选的实施方式中，可以将均已灭菌的300目(约为48微米)高龄土粉末和325目(约为45微米)的膨润土粉末按2∶1比例配比好放入搅拌机，搅拌均匀。菌液与粉剂载体比例为1∶2.8。加入菌液前将管道接通，流量计打开，设置好流量。关闭发酵罐尾气排气阀，灌内气压上升到1.5MPa时，打开出料口，同时开动搅拌机，使发酵罐内菌液尽量在短时间内流出，2分钟内完成搅拌。

在一些优选的实施方式中，所述干燥在30至40℃，优选在35℃，在保持通风的条件下进行干燥，干燥时间为7天至14天，例如干燥7、8、9、10、11、12、13或14天。更优选的是，进行所述干燥直至水分含量在等于或者小于10重量％；进一步优选的是，进行所述干燥直至水分含量在等于或者小于6重量％。

在优选实施方式中，所述方法进一步包括对经干燥的物料进行粉碎步骤，使得经粉碎的物料能够通过孔径为125微米的网筛。例如，可以将经测定水分含量在6％时，对物料进行粉碎，例如用小型晶体粉碎机粉碎物料，选用120目(孔径0.125mm)网筛，粉碎时入料最好不要太快，及时抖落上下两个布袋，保持布袋通气。

在一些可选的实施方式中，所述方法还包括所述菌剂包装的步骤和/或保存的步骤；本发明所述方法制得的苜蓿根瘤菌剂可以在常温下保存，更优选的是在0至20℃保存，保存期可长达12个月以上。

本发明优选使用含菌数量高的菌液，为此，本发明还深入研究了苜蓿根瘤菌的发酵工艺，以提高每毫升菌液的含菌数量。

在一些优选的实施方式中，本发明方法中使用的菌液以菌种培养繁殖方式获得。在这种情况下，本发明的方法可以包括如下步骤：菌种培养；摇瓶培养；一级培养；二级培养；固体吸附；干燥；以及菌剂粉碎。在一些更加优选的实施方式中，本发明的所述方法还可以包括如下可选的步骤：包装；和/或保存，例如图2所示。

在有些优选的实施方式中，本发明方法所使用的菌液采用包括选自由如下步骤中的一个或者多个步骤的方法获得，更优选采用依次包括如下步骤的方法制得：

(i)菌种培养步骤：所述菌种培养步骤采用YMA琼脂斜面培养方法进行；优选的是，所述菌种培养的培养条件为30℃培养5天至7天；更优选的是，所述菌种培养所使用的培养基的配方如下：磷酸二氢钾0.25g；七水合硫酸镁0.1g；氯化钠0.05g；甘露醇5g；酵母粉0.4g；琼脂10g；和水500ml；

(ii)摇瓶培养步骤：所述摇瓶培养步骤采用采用酵母-甘油培养基培养方法进行，培养条件为在30℃以200转/分钟培养48小时；优选的是，所述摇瓶培养使用的酵母-甘油培养基的配方如下：甘油20g；酵母粉2.2g；磷酸氢二钾1.2g；磷酸氢二氨1.0g；七水合硫酸镁0.7g；二水合氯化钙0.16g；三氯化铁0.0083g；七水合硫酸锰0.008g；硼酸0.01g；二水合钼酸钠0.01g；作为消泡剂的磷酸三丁酯0.05ml；和水1000ml；

(iii)一级培养步骤：该一级培养步骤采用甘油培养基进行，培养条件为在30℃以150转/分钟培养，培养罐进气气压为2.0MPa，空气流量为600L/h，PH值为6.5-7.5，培养灌内压力0.5～1.0MPa，培养时间为48小时至72小时；优选的是，所述一级培养采用的所述甘油培养基的配方如下：甘油400g；酵母粉44g；磷酸氢二钾24g；磷酸氢二氨20g；七水合硫酸镁14g；二水合氯化钙3.2g；三氯化铁0.166g；七水合硫酸锰0.16g；硼酸0.2g；钼酸钠0.2g；作为消泡剂的磷酸三丁酯1mL；和水20L；

(iv)二级培养步骤，所述二级培养步骤采用甘油培养基进行，培养条件如下：30℃；150转/分钟；培养罐的进气气压为2.0Mpa；空气流量为600L/hour；PH值为6.5-7.5；培养灌内压力0.5～1.0Mpa；培养时间为48小时至72小时，或者菌液中活菌数大于20亿/mL，杂菌含量小于5％；优选的是，所述二级培养采用的所述甘油培养基的配方如下：甘油2200g；酵母粉242g；磷酸氢二钾132g；磷酸氢二氨110g；七水合硫酸镁77g；二水合氯化钙17.6g；三氯化铁0.913g；七水合硫酸锰0.88；硼酸1.1g；钼酸钠1.1g；作为消泡剂的磷酸三丁酯5mL；和水110L。

优选的是，所述苜蓿根瘤菌(Rhizobiummeliloti)为可以商购获得的“多萌”(Dormal)。

本发明在第二方面提供了根据本发明上述第一方面所述的方法制得的苜蓿根瘤菌剂。优选的是，所述苜蓿根瘤菌剂120目的筛余物小于10重量％；另外优选的是，所述苜蓿根瘤菌剂的含水量为6重量％至10重量％；另外优选的是，所述苜蓿根瘤菌剂的有效活菌数量为5亿/克至15亿/克；另外优选的是，所述苜蓿根瘤菌剂的杂菌率为小于10％。

本发明在第三方面提供了本发明第一或第二方面所述的苜蓿根瘤菌剂在种植豆科植物中的应用，优选的是在种植苜蓿属(Medicago)、草木樨属(Melilotus)和胡卢巴属(Trigonellea)植物中的应用，更优选的是在种植苜蓿属(Medicago)植物尤其是紫花苜蓿中的应用。优选的是，所述豆科植物的种子用量/所述苜蓿根瘤菌剂的用量的质量之比100∶0.4至100∶1.2，更优选为100∶1至100∶1.2；另外优选的是，所述豆科植物的种子播种量为10kg/hm²；另外优选的是，所述苜蓿根瘤菌剂的接种量为0.04kg/hm²至0.12kg/hm²。

下文将通过实施例对本发明进行说明，但是本发明的范围不限于下文所展示的实施例。

实施例

实施例1菌种培养

本实施例采用YMA琼脂斜面培养方法，具体方法及培养基配方如下：

(1)YMA琼脂培养基制作：用天平分别称取磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.25g；七水合硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.1g；氯化钠(NaCl)0.05g；甘露醇(C₆H₁₄O₆)5g；酵母粉0.4g；琼脂10g；加入蒸馏水500ml充分搅拌，加热致沸腾，使培养基充分溶解。通过漏斗趁热将培养基转移到试管中，(装量约占试管高度1/4)。分装完成后用硅胶塞密封，然后将7只试管扎成一捆，试管硅胶塞部用封口膜及牛皮纸包扎。

(2)YMA琼脂培养基灭菌：灭菌锅121.5℃灭菌，半个小时，灭菌时排气口留有小口出气，完成后冷却致90℃以下取出，将培养基摆成斜面状冷却至常温。

(3)接种YMA琼脂培养基：使用苜蓿根瘤菌(Rhizobiummeliloti)接种，接种前提前将菌种取出常温放置两小时，将待接种试管在超净工作台灭菌15分钟，通风10分钟后用挑针挑取菌种管根瘤菌，连续划线接种到YMA培养基上。

(4)培养：将已划线的培养基标明日期，放在光照温湿培养箱培养。培养条件30℃，培养6天(可以为5-7天)。

实施例2摇瓶培养

本实施例采用酵母-甘油培养基培养方法，具体方法及培养基配方如下：

(1)制备酵母-甘油培养基，配方为甘油20g；酵母粉2.2g；磷酸氢二钾(K₂HPO₄)1.2g；磷酸氢二氨[(NH₄)HPO₄]1.0g；七水合硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.7g；二水合氯化钙(CaCl·2H₂O)0.16g；三氯化铁(FeCl₃)0.0083g；七水合硫酸锰(MnSO₄·7H₂O)0.008g；硼酸(H₃BO₅)0.01g；钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O)0.01g；消泡剂(磷酸三丁酯)0.05ml；水1000ml，充分搅拌均匀，用烧杯将溶液转移到500ml三角瓶中，每个三角瓶装200ml，分装完成后用封口膜及牛皮纸包扎。

(2)酵母-甘油培养基灭菌，将酵母-甘油培养基装入三角瓶中灭菌，灭菌锅121.5℃灭菌，半个小时，灭菌时排气口留有小口出气，完成后冷却致90℃以下取出，冷却至常温。

(3)接种酵母-甘油培养基。将实施例1中培养好的带有菌种的YMA斜面培养基接种到装有酵母-甘油培养基的三角瓶中。方法：将待接种甘油培养基、装有10ml蒸馏水和3粒玻璃珠的试管(已湿热灭菌)、移液管(已经湿热灭菌)在超净工作台灭菌15分钟，通风10分钟后开始接种，将试管中10ml蒸馏水和3粒玻璃珠转移到带有菌种的YMA培养基试管内，用旋涡混合器震荡混合，用移液管将带有菌种的菌液转移到酵母-甘油培养基内。

(4)摇床转动培养两天。将装有酵母-甘油培养基的三角瓶在30℃，200转/分钟，培养48小时。

实施例3一级培养

本实施例采用发酵罐进行一级培养，具体步骤如下：

(1)发酵罐空罐灭菌。

(2)准备甘油培养基：用天平分别称取：甘油400g，酵母粉44g，磷酸氢二钾(K₂HPO₄)24g，磷酸氢二氨[(NH₄)HPO₄]20g，七水合硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)14g，二水合氯化钙(CaCl·2H₂O)3.2g，三氯化铁(FeCl₃)0.166g，七水合硫酸锰(MnSO₄·7H₂O)0.16g，硼酸(H₃BO₅)0.2g，钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O)0.2g，消泡剂(磷酸三丁酯)1mL，软化水20L，将以上培养基充分搅拌溶解，加入到30L的发酵罐。

(3)发酵罐培养基灭菌：发酵罐121.5℃灭菌半个小时，然后冷却。

(4)培养基接种：将实施例2中制备的菌种液500ml(可以为400～600ml)转移到发酵罐内。

(5)发酵罐发酵培养：培养条件30℃，150转/分钟，进气气压为2.0MPa，空气流量为10L/min即600L/h，PH值为7.0(可以为6.5-7.5)，灌内压力1.0Mpa(可以为0.5～1.0MPa，1.0MPa左右最好，不能超过1.5Mpa)，培养时间为60小时(可以为48～72小时)。

(6)培养到48小时时取样检测孢子数量，取菌液1ml滴入99ml的水中，搅拌均匀，取少许滴入血球记数板，显微镜下检测。记算公式：80小格内细胞个数/80×4×10⁶×100

实施例4二级培养

本实施例采用发酵罐进行二级培养，具体步骤如下：

(1)发酵罐空罐灭菌

(2)准备甘油培养基：用天平分别称取：甘油2200g，酵母粉242g，磷酸氢二钾(K₂HPO₄)132g，磷酸氢二氨[(NH₄)HPO₄]110g，七水合硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)77g，二水合氯化钙(CaCl·2H₂O)17.6g，三氯化铁(FeCl₃)0.913g，七水合硫酸锰(MnSO₄·7H₂O)0.88，硼酸(H₃BO₅)1.1g，钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O)1.1g，消泡剂(磷酸三丁酯)5mL，软化水110L，将以上培养基充分搅拌溶解，加入到200L发酵罐。

(4)培养基接种：将种子罐中的菌种液4L(可以为3-5L)转移到发酵罐内。

(5)发酵罐发酵培养：培养条件30℃，150转/分钟，进气气压为2.0MPa，空气流量为10L/min即600L/hour，PH值为6.0(可以为6.5-7.5)，灌内压力为1.0Mpa(可以为0.5～1.0Mpa)，1.0MPa左右最好，不能超过1.5MPa，培养时间为60小时(可以为48～72小时，通常60小时下罐)。

(6)培养到48小时时取样检测孢子数量，取菌液1mL滴入99mL的水中，搅拌均匀，取少许滴入血球记数板，显微镜下检测。当菌液中活菌数大于20亿/mL，杂菌含量小于5％即可出罐，由此得到用于固体吸附的菌液。记算公式：80小格内细胞个数/80×4×10⁶×100

实施例5固体吸附

使用由均已灭菌的300目(相当于48微米粒度)高龄土粉末和325目(相当于45微米)膨润土粉末按2∶1比例配比好放入搅拌机，搅拌均匀。使用实施例4中制得的菌液，并且菌液与粉剂载体比例为1∶2.8。加入菌液前将管道接通，流量计打开，设置好流量。关闭发酵罐尾气排气阀，灌内气压上升到1.5MPa时，打开出料口，同时开动搅拌机，使发酵罐内菌液尽量在短时间内流出，2分钟内完成搅拌，得到粉剂吸附有苜蓿根瘤菌的物料。

实施例5干燥和粉碎

将实施例6得到的物料干燥，干燥温度为35℃，保持通风，干燥时间为10天(可以为7～14天)，直到经测定水分含量在6％左右时。然后将经干燥的物料进行粉碎，用小型晶体粉碎机粉碎产品，选用120目(相当于孔径125微米)网筛，粉碎时入料不要太快，及时抖落上下两个布袋，保持布袋通气，得到苜蓿根瘤菌剂。

实施例6包装和保存

将实施例5中得到的苜蓿根瘤菌剂包装在密封的包装袋中，在4℃(一般可以为0～20℃)下保存。

实施例7苜蓿根瘤菌剂的水分含量、有效活菌数、杂菌率及吸附剂颗粒细度等质量指标的检测

首先，对上述实施例5中所制得的根瘤菌粉剂的水分含量进行检测：根瘤菌剂含水量的测定按照NY410-2000标准执行。如图3所示，产品2012年8月5日下罐，凉干温度为20℃-28℃，凉干时间为18天。2012年9月15日粉碎保存，到2013年9月份，共检测11次，粉剂粉碎后，保存于塑料袋中，除前两次检测水分含量略高于6％之外，剩余检测次数的水分含量一直保持在4％左右。产品的水分含量优于国家标准规定(GB20287-2006)及行业标准规定(NY410-2000)。

表1.农用微生物菌剂产品技术指标(GB20287-2006)

表2.根瘤菌技术指标(NY410-2000)

然后，对上述实施例5中所制得的根瘤菌粉剂的有效活菌数进行测定，测定按照NY410中的规定执行。如图3所示，保存期内有效活菌数量最低为6.8亿/g，最高时达到15亿，远高于国标(GB20287-2006)及行业标准(NY410-2000)规定的数量2亿/g，总体上有效活菌数量很多。随这时间的推移，数量有减少的趋势，但数量仍然相当可观。

接着，对上述实施例5中所制得的根瘤菌粉剂的杂菌率及吸附剂颗粒细度进行测定，测定按照NY410中的规定执行。小粒种子用的菌肥通过孔径为0.15mm(100目)标准筛的筛余物≤10％才符合标准，本发明所选用的标准筛为120目，即孔径为125微米，其筛余物＜10％，吸附剂颗粒细度指标明显优于标准规定。在发酵罐二级培养阶段当菌液中活菌数大于20亿/mL，杂菌含量小于5％才可出罐，此项技术指标优于NY410中关于液体根瘤菌的规定，固体吸附、干燥粉碎之后的杂菌率检测结果也显著优于NY410中固体根瘤菌的技术要求(见表3所示)。

表3.实施例5中所制得的苜蓿根瘤菌剂的技术指标检测结果

实施例8苜蓿根瘤菌剂的田间作用效果的检测

田间试验分为两部分，第一部分为紫花苜蓿接种不同重量的实施例5所制得的苜蓿根瘤菌剂，主要目的是研究根瘤菌的实际接种量，确定根瘤菌接种量的科学、合理范围，根据实际生产实践确定根瘤菌用量，减少单位面积根瘤菌用量，降低成本。第二部分是在第一部分试验的基础上，根据已确定的根瘤菌用量，研究接种根瘤菌后不同紫花苜蓿的增产效果。田间试验结果如下：

(一)不同重量根瘤菌的接种效果

在种植紫花苜蓿时，根据紫花苜蓿的播种量，按照种子用量/根瘤菌用量以重量计的比例为100∶0.4、100∶0.6、100∶0.8、100∶1和100∶1.2，确定根瘤菌的接种量。如表4所示，本试验确定紫花苜蓿播量为10kg/hm²，采用本发明实施例5制得的根瘤菌粉剂接种，接种量分别为0.04kg/hm²、0.06kg/hm²、0.08kg/hm²、0.1kg/hm²、0.12kg/hm²。试验结果表明，与没有接种跟刘局的对照相比有效根瘤数量增幅最大的是种子用量/根瘤菌用量比为100∶1的处理，增幅最低的是100∶0.4，与对照相比干草产量增幅最高的也是100∶1的处理，产量增加15％，其次是100∶0.8的处理，产量增加10％。因此，该根瘤菌的最佳接种范围为0.8至1.0重量份菌剂/100份种子。紫花苜蓿接种该根瘤菌后，能促进结瘤，并使干草产量比对照增加2％至15％，实施例5中制得的苜蓿根瘤菌剂对苜蓿具有显著的促进结瘤、促进生长的效果。

表4.不同根瘤菌接种量的产量效应

(二)不同苜蓿品种的接种效果

该试验采用的苜蓿品种为巨能551(Magna551)、巨能804(Magna804)、巨能2(MagnagrazeII)、耐盐之星(Magunm-Salt)、湿地宝(MagnumVI-Wet)、皇冠(Phabulous)、巨能601(Magna601)、巨人201T(Ameristand201T)和维多利亚(Victorian)。使用本发明实施例5制备的苜蓿根瘤菌剂与上述紫花苜蓿种子按1∶100的比例进行混合接种，以不接菌为对照，每处理3次重复，试验地块为首次种植紫花苜蓿，每小区面积15m²。在紫花苜蓿生长期间对田间效果进行调查，以单株根瘤数、有效根瘤数量(粉色根瘤)和产量作为评价指标，其中在第一片真叶期调查单株结瘤数和有效根瘤数量，在初花期进行产量测定。其试验结果如下表5～6。

表5.紫花苜蓿单株结瘤效果对比

注：在第一片真叶期调查结瘤数量。

表6.紫花苜蓿产量对比

表5～6田间试验结果表明，利用本发明制备的根瘤菌剂接种于紫花苜蓿种子，接种后的紫花苜蓿单株结瘤量和有效根瘤数量显著高于对照，与对照相比单株结瘤数增加100％～176％，有效根瘤数比对照增加53％～244％，紫花苜蓿接种后的结瘤效果非常显著。产量方面，结瘤量多、有效根瘤多，产量并不一定高，与对照相比产量最高增加39.9％，最低增加5.4％，接种后的产量显著高于不接种的产量。这些结果充分地说明，本发明的苜蓿根瘤菌对紫花苜蓿具有显著的促进结瘤、增产的效果，是一种高效固氮的紫花苜蓿根瘤菌肥料。

Claims

1.一种制造苜蓿根瘤菌剂的方法，所述方法包括如下步骤：

S1：获得苜蓿根瘤菌的菌液；

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述粉剂包含重量比为5∶1至1∶1的高岭土和膨润土；和/或所述菌液与所述粉剂的体积比为1∶2至1∶4。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述高岭土粉末和/或所述膨润土粉末的粒度为20微米至75微米；更优选的是，所述高岭土粉末和/或所述膨润土粉末的粒度为25微米至50微米；进一步优选的是，所述高岭土的粒度为38微米至48微米，所述膨润土的粒度为38微米至45微米，并且所述高岭土和所述膨润土的体积比为2∶1；更进一步优选的是，所述所述菌液与所述粉剂的体积比为1∶2.8。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，将所述粉剂放入搅拌机并搅拌均匀，将所述菌液加入发酵罐并且将灌内气压提高到1.5MPa，在搅拌机搅拌的同时使发酵罐内的所述菌液流到搅拌机中并且在5分钟内优选在2分钟内完成搅拌。

5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述干燥在30至40℃优选在35℃，在保持通风的条件下进行干燥，干燥时间为7天至14天；更优选的是，进行所述干燥直至水分含量在等于或者小于10重量％；进一步优选的是，进行所述干燥直至水分含量在等于或者小于6重量％。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括对经干燥的物料进行粉碎步骤；优选的是，使用孔径为125微米的标准筛件。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括所述菌剂包装的步骤和/或保存的步骤；优选的是，所述保存在常温下保存或者在0至20℃保存。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，所述菌液采用包括选自由如下步骤中的一个或者多个步骤的方法获得：

(i)菌种培养步骤：所述菌种培养步骤采用YMA琼脂斜面培养方法进行；优选的是，所述菌种培养的培养条件为30℃培养5天至7天；更优选的是，所述菌种培养所使用的培养基的配方如下：磷酸二氢钾0.25g；七水合硫酸镁0.1g；氯化钠0.05g；甘露醇5g；酵母粉0.4g；琼脂10g；和水500m1；

(iii)一级培养步骤：该一级培养步骤采用甘油培养基进行，培养条件为培养条件在30℃以150转/分钟培养，培养罐进气气压为2.0MPa，空气流量为600L/h，PH值为6.5-7.5，培养灌内压力0.5～1.0MPa，培养时间为48小时至72小时；优选的是，所述一级培养采用的所述甘油培养基的配方如下：甘油400g；酵母粉44g；磷酸氢二钾24g；磷酸氢二氨20g；七水合硫酸镁14g；二水合氯化钙3.2g；三氯化铁0.166g；七水合硫酸锰0.16g；硼酸0.2g；钼酸钠0.2g；作为消泡剂的磷酸三丁酯1mL；和水20L；

(iv)二级培养步骤，所述二级培养步骤采用甘油培养基进行，培养条件如下：30℃；150转/分钟；培养罐的进气气压为2.0Mpa；空气流量为600L/hour；PH值为6.5-7.5；培养灌内压力0.5～1.0Mpa；培养时间为48小时至72小时，或者菌液中活菌数大于20亿/mL，杂菌含量小于5％；优选的是，所述二级培养采用的所述甘油培养基的配方如下：甘油2200g；酵母粉242g；磷酸氢二钾132g；磷酸氢二氨110g；七水合硫酸镁77g；二水合氯化钙17.6g；三氯化铁0.913g；七水合硫酸锰0.88；硼酸1.1g；钼酸钠1.1g；作为消泡剂的磷酸三丁酯5mL；和水110L；

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法制得的苜蓿根瘤菌剂；优选的是，所述苜蓿根瘤菌剂120目的筛余物小于10重量％；另外优选的是，所述苜蓿根瘤菌剂的含水量为6重量％至10重量％；另外优选的是，所述苜蓿根瘤菌剂的有效活菌数量为5亿/克至15亿/克；另外优选的是，所述苜蓿根瘤菌剂的杂菌率为小于10％。

10.权利要求9中所述的苜蓿根瘤菌剂在种植豆科植物中的应用，优选的是在种植苜蓿属(Medicago)、草木樨属(Melilotus)和胡卢巴属(Trigonellea)植物中的应用，更优选的是在种植苜蓿属(Medicago)植物中的应用；优选的是，所述豆科植物的种子用量/所述苜蓿根瘤菌剂的用量的质量之比100∶0.4至100∶1.2，更优选为100∶1至100∶1.2；另外优选的是，所述豆科植物的种子播种量为10kg/hm²；另外优选的是，所述苜蓿根瘤菌剂的接种量为0.04kg/hm²至0.12kg/hm²。