CN1285401A

CN1285401A - 固氮菌及其菌剂、菌剂组合物和它们的应用

Info

Publication number: CN1285401A
Application number: CN 99111599
Authority: CN
Inventors: 崔宗均; 程又明; 谢光辉; 曾飞
Original assignee: CHINA HUALIAN International SERVICE INTEGRATED CORP
Current assignee: CHINA HUALIAN International SERVICE INTEGRATED CORP
Priority date: 1999-08-20
Filing date: 1999-08-20
Publication date: 2001-02-28

Abstract

本发明公开了两株新的有芽孢固氮菌,它们耐干、耐热、耐盐,并有很高的固氮酶活性,可用于制备生物活性菌剂及其组合物和生物活性肥制品等。

Description

固氮菌及其菌剂、菌剂组合物和它们的应用

本发明涉及固氮菌的分离、纯化及其发酵制品。具体地讲，本发明涉及芽孢固氮菌的分离、纯化及其发酵制品，以及由所述芽孢固氮菌及其组合物用于制备生物活性肥制品的应用。

众所周知，氮是一种重要的生命元素，如何给植物尤其是经济农作物提供安全有效的氮肥一直是人们所关心的问题。

含氮化肥在给农业带来巨大益处的同时，也带来造成土地板结、生态破坏、产品质量下降的缺陷。1972年，有机农业联盟就发出了“停止使用含氮化肥”的呼吁。

自1895年出现了第一种生物肥料一根瘤菌接种剂以来，国内外已开发出很多种基于固氮菌的生物肥料。这些肥料中的固氮菌根据其与植物的生长关系，可分成以下三类：

1.共生固氮菌，其代表性的例子是根瘤菌。该类微生物与豆科植物构成共生关系，根瘤菌侵入豆科植物的根部，并使植物在被侵入部位生成根瘤。根瘤菌将空气中游离态的氮固定并转化为植物可利用的氮，而植物也为固氮菌提供了生长繁殖的环境与营养。

2.联合固氮菌，其代表性的例子是巴西固氮螺菌。这类菌可以进入植物根部细胞，但并不致瘤。

3.自生固氮菌，其代表性的例子是圆褐固氮菌。这类菌不侵入植物细胞，而与植物成相互独立的关系。这种菌可将空气中的氮固定转化为植物可利用的氮，并将之富集在土壤中。

目前开发出的基于以上三类固氮菌的生物肥料却各自存在着不足之处。例如，基于根瘤菌的生物肥料其应用范围受到了根瘤菌宿主范围的限制，这类生物肥料一般只适用于豆科植物，而对非豆科植物是无效的。而且，由于现有的自生固氮菌、联合固氮菌和根瘤菌均没有芽孢，因此它们不耐热、不耐干，使基于这三类固氮菌的生物肥料存在着有效菌易死亡、易生杂菌、保存时间短和不便运输的缺点。

为克服现有技术中存在的缺陷，本发明的发明人致力于分离、筛选和纯化有芽孢的固氮菌；经过数年的努力他们终于得到了两株耐热、耐干、耐盐、有芽孢的固氮菌。基于这两株固氮菌，还分别开发出了菌剂、菌剂组合物和生物活性肥制品。

本发明的目的在于提供一种能耐热、耐干、耐盐、有芽孢的固氮菌。本发明的另一目的是提供一种由上述本发明固氮菌经发酵制成的菌剂。本发明的又一目的是提供一种含有上述本发明固氮菌剂的菌剂组合物。本发明的再一目的在于提供一种含有上述本发明固氮菌和/或本发明固氮菌剂的生物活性肥制品。

本发明包括如下几个方面：

1.本发明的固氮菌

本发明的固氮菌是于1999年月日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)的ND1和ND2。ND1和ND2的保藏编号分别为CGMCC--和CGMCC--。ND1是一种球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)。ND2是一种巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)。这两种固氮菌的最适生长温度为28-32℃，并可耐受80℃的高温达1-3小时；可耐受20％的(NH₄)₂SO₄；最适pH为6.8-7.2。保存培养基为Dǒbereiner低氮培养基。

本发明的上述两株固氮菌不但具有很强的固氮酶活性，还具有较强的解析金属元素如磷、钾的能力和分泌激素的能力。

2.本发明的固氮菌液剂和粉剂

本发明的固氮菌菌剂是通过将本发明固氮菌依次经斜面培养、种子瓶培养、发酵培养制成的。一种固氮菌剂是本发明的ND1的发酵培养液，其中含有约1.0×10⁸-2.0×10⁹个ND1/毫升。向该固氮菌剂中添加载体，再经过滤/离心、干燥、粉碎、过筛，可制得粉状的含ND1的固氮菌剂(下文称之为ND1粉剂)，该固氮菌剂中的有效活菌总数为约5.0～7.0×10⁸-1.0～1.4×10¹⁰个ND1的细胞/克，优选含有至少约7.0×10⁹个ND1的细胞/克。

本发明的另一种固氮菌剂是本发明的ND2的发酵培养液，其中含有1.0×10⁷-4.0×10⁸个ND2/毫升。向该固氮菌剂中添加载体，再经过滤/离心、干燥、粉碎、过筛，可制得粉状的含ND2的固氮菌剂(下文称之为ND2粉剂)，该固氮菌剂中的有效活菌总数为约5.0～7.0×10⁷-2.0～2.8×10⁹个ND2的细胞/克，优选含有至少约2.0×10⁸个ND2的细胞/克。

对所述的过滤/离心、干燥、粉碎、过筛等步骤没有特殊的要求，可使用本领域已知的任何适当的方法和设备，只要能达到所需的目的即可。

所述粉剂的粒径大小为60-100目，优选80-100目。

所述的载体为碳酸钙、高岭土、膨润土中的一种或多种的混合物。优选采用碳酸钙作载体。

本发明的固氮菌剂除了可以用来制备本发明的活性菌剂组合物，进而制备生物活性拌种剂、生物活性菌粒、生物活性复混肥或颗粒掺混肥外，很显然的是，它们亦可作为肥料而直接应用于农业生产。

3.本发明的活性菌剂的组合物

本发明还提供一种生物活性菌剂的组合物，该组合物含有下面四种菌粉剂中的至少两种：上述ND1的粉剂、上述ND2的粉剂、有芽孢解磷菌如由中国农业大学提供的ND3的粉剂和有芽孢解钾菌如由中国农业大学提供的ND4的粉剂，其中，上述有芽孢解磷菌的粉剂和有芽孢解钾菌的粉剂的制备和本发明固氮菌菌剂的制备方法类似，即在经发酵培养后加载体、制成滤饼或离心得沉淀，然后烘干和粉碎过筛制成。其他各粉剂与上述ND1粉剂的配合比例为0.5～1∶1，优选按1∶1配合。例如，可将ND1的粉剂、ND2的粉剂按1∶(0.5～1)的比例混合。如果本发明的生物活性菌剂的组合物包含上述四种活性菌，则其中ND1∶ND2∶解磷菌∶解钾菌的比例为1∶(0.5～1)∶(0.5～1)∶(0.5～1)，优选按1∶1∶1∶1的等比混合。同时含有ND1的粉剂和ND2的粉剂的本发明混合菌剂是优选的。

本发明对上述菌剂的混合次序、混合方式没有限制，只要能将个组分混合均匀即可。

当然，可以想见，可将各菌先单独发酵，然后将各发酵液按预定比例混合，再经添加或不添加载体，而制成所需的混合菌剂；也可将各菌首先混合发酵培养，然后加载体制成混合菌剂。例如，可将本发明的两种固氮菌按比例混合培养发酵，再采用与制备单一固氮菌粉剂同样的方法来制备本发明两种固氮菌的混合粉剂。

在本发明的上述生物活性菌剂的组合物中，有效活菌的总数为3.0×10⁹～1.2×10¹⁰/克，其中优选有效活菌总数大于或等于7.0×10⁹/克。

本发明的上述生物活性菌剂的组合物，粒径一般为60-100目，优选为80-100目。

上述菌剂组合物可作为肥料直接使用，但是优选将所述菌剂组合物经一定比例的稀释后再施用，如加水制成混悬液后喷洒、浇灌，或与其他有机质、中微量元素、和/或化肥的粉末掺混后施用。

4.本发明固氮菌剂或其组合物用于制备生物活性肥料

a.用于制备生物活性拌种剂

可选用工业、农业、生活废弃的和自然的有机物(如污泥、垃圾、粪便、秸杆，以及河湖塘泥、草炭等)为载体，并采用磷酸二氢钾、腐植酸钾、中微量元素等为营养成分，以300-500℃对载体、营养成分进行高温灭菌：细粉碎达到60-100目，优选80-100目；然后进行二次灭菌；在无菌条件下按照配方，即，按活性菌粉剂：(载体+营养成分)为1∶10～30的比例进行掺混。成品为松散粉末状固体，粒径大小为60-100目，优选为80-100目，有效活菌数至少为4.0×10⁸/克，含水分5％以下，所含有机质以C.计至少为30wt％，杂菌率为不高于15％。该组合物产品可用于拌种。

b.用于制备生物活性菌粒

也可将本发明的活性菌粉剂进一步配制成制备生物活性肥制品用的生物活性菌粒。选用工业、农业、生活废弃的和自然的有机物(如污泥、垃圾、粪便、秸杆，以及河湖塘泥、草炭等)为载体，按下述基本工序生产：对载体以300-500℃进行高温烘干灭菌，时间10-30分钟左右；对灭菌烘干后的载体进行细粉碎，要求粒度为60-100目，优选80-100目；按照活性菌粉剂：载体=1∶30～40的比例，将本发明活性菌粉剂组合物和有机载体，经机械式搅拌均匀；使用圆盘、转鼓或挤压造粒机，加水造粒，制成直径为2.5～4.5mm的颗粒或直径为5～8mm的圆柱体；接着进行烘干；经冷却处理，降低产品温度、水份，增强硬度。所得产品的含水量为5％以下，粒径为2.5-4.5毫米，颗粒抗压强度6N以上，有效活菌数至少为1.0×10⁸/克，所含有机质以C计至少为20wt％，杂菌率为不高于20％。

很显然，本发明的生物菌粒本身也可作为肥料直接使用，优选在使用时与一定量的化肥或有机质和/或一定量的大、中、微量元素配合。

c.用于制备生物活性复混肥

按上文4b.所述制备本发明的生物菌粒，按传统的复混肥生产工艺，制备出无机颗粒。例如，将N、P、K、Mn、Zn按一定比例称料，再向其中加入草炭等，然后造粒。可根据不同地区、不同作物、作物不同生长阶段对肥料的具体需要，将所制得的生物菌粒和无机颗粒按30～50∶50～70的比例掺混，即可得到本发明的生物活性复混肥。其中，所得产物的总养分含量以(N+P₂O₅+K₂O)计，至少为20％，水溶性磷占有效磷含量至少为40％，游离水含量不超过5％，颗粒平均抗压碎力至少为6N，有效活菌总数至少为2.0×10⁷/克，杂菌率不超过20％，粒径在2.5～4.5之间，pH为6.0～7.5。

d.用于制备生物活性颗粒掺混肥

分别生产生物活性菌粒和无机氮、磷、钾肥的三种单质颗粒，颗粒直径为2-4毫米，含水分3％以下，颗粒强度大于18N。生物菌粒按上文4.(b)所述工艺生产；选用粉状钾肥，添加粘接剂如污泥、微量元素，按复混肥生产工艺生产钾肥颗粒，或直接使用符合要求的钾肥颗粒；选用符合粒度、强度、含水率、含养量等标准的氨肥、磷肥颗粒。根据不同需要，按配方将生物菌粒与三种颗粒中的一种或多种进行掺混，优选将四种颗粒按1∶1∶1∶1的比例掺混均匀，制得生物活性颗粒掺混肥。所得产品为四种不同颜色，比重、体积相近的颗粒状产品。其中，总养分含量以(N+P₂O₅+K₂O)计，至少为20％，水溶性磷占有效磷含量至少为40％，游离水含量不超过5％，颗粒平均抗压碎力至少为6N，有效活菌总数至少为2.0×10⁷/克，杂菌率不超过20％，粒径在2.0～4.0之间，pH为6.0～7.5。

附图的简要说明

图1是本发明ND1的显微照片。

图2是本发明ND2的显微照片。

图3是本发明固氮菌ND1和ND2的生长曲线。

图4是本发明固氮菌的ND1和ND2的生孢曲线。

下面利用本发明的固氮菌ND1、ND2、以及由中国农业大学微生物室提供的两种巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)--解磷菌ND3和解钾菌ND4，以实施例的方式对本发明进一步说明如下。这些实施例只是用于说明本发明的，本发明不应受这些实施例的限制。实施例1

本发明ND1的分离、纯化

采用稀释平板法并采用改良Dǒbereiner培养基从土壤中分离纯化本发明的固氮菌。将采回的根际土混匀，称取10克根与土的混合物，在研钵中研碎，加无菌水至100ml，按10倍稀释法稀释至10^-5，共三个重复，取10^-4和10^-5两个浓度的土壤悬液各0.1ml，均匀涂于无氮培养基平皿中，30℃下培养3天后，并将不同菌落标号接出，在改良Dǒ氏LN培养基上测其乙炔还原活性(ARA)。然后，选乙炔还原活性高于20nmol C₂H₄/hr/ml的菌株，淘汰无活性和活性低的菌株，以低氮/无氮平板划线法进行分离提纯，又选出不同形态的单菌落接出，选ARA值显著的菌落继续分离，直到选出ARA较高的纯菌株。其中，所用改良Dǒbereiner培养基的配方如下表1所示：表1

原料	用量	原料	用量
蔗糖	10.0g	苹果酸	5.0g
K₂HPO₄·H₂O	0.1g	KH₂PO₄·H₂O	0.4g
MgSO₄·7H₂O	0.2g	NaCl	0.1g
CaCl·2H₂O	0.02g	FeCl₃	0.01g
Na₂Mo₄O·H₂O	0.002g	H₂O	1000ml

用NaOH调pH为7.2。

其中不加蛋白胨，则为无氮培养基(NN)；加蛋白胨0.2g，则为低氮培养基(LN)；加蛋白胨5g，则为高氮培养基(HN)。NN和LN用于筛选固氮菌和测定固氮菌的乙炔还原活性(ARA)；HN则用于固氮菌的生长繁殖。

固氮菌的乙炔还原活性(ARA)测定

在15×150mm试管中加入4.5ml的改良的Dǒ氏LN固体培养基，121℃高压灭菌15分钟，做成斜面。接种后在30℃下培养18-24小时，将棉塞换为橡皮塞密封，抽取1.8ml的空气，注入1.6ml的C₂H₂，继续培养24-36小时后，取100μl气样在SQ-204型气相色谱仪上测定乙烯峰值，标准气C₂H₂的浓度为138mg·ml^-1。气相色谱仪的工作条件设置为：检测室温度100℃，柱温60℃，进样口温度60℃，柱长为1m，表头载气压力氮气为0.95kg·cm^-2，氢气为0.8kg·cm^-2，空气为0.6kg·cm^-2。

乙炔还原活性计算方法为：

乙炔还原后测得ND1和ND2的酶活性分别为210-330n molC₂H₄／hr/ml、160-190nmol C₂H₄／hr/ml。混合培养时的固氮酶活性为2500-2800n mol C₂H₄/hr/ml，说明这两株菌具有联合增效作用。实施例2

本发明固氮菌特征的鉴定

分别对按实施例1分离纯化得到的ND1和ND2进行显微镜检查，并对它们进行微生物的常规生理生化反应的测定。其结果分别为：

ND1为G⁺、杆状，大小为0.4-0.5×0.9-1.5μ。芽孢中性到亚中性。孢囊膨大。芽孢大多数为圆球形，也有椭圆形的。生化实验的结果为：VP-，培养液pH8.5。淀粉水解-。吲哚-。脲酶-。接触酶+。氧化酶+。柠檬酸盐利用+。丙酸盐利用-。乙酸盐利用-。苹果酸盐利用-。鼠李糖利用-。葡萄糖产酸-。阿拉伯糖产酸-。木糖产酸-。甘露醇产酸-。硝酸盐还原-。在厌氧培养基上不生长，在7％NaCl中不生长。根据微生物形态学、生理生化特性，查对《系统细菌学伯杰氏手册》，将该新菌株定名为球状芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)ND1。

ND2为G⁺、杆状，大小为1.0-1.2×2.5-4.0μ。芽孢中性到亚中性。孢囊不膨大。芽孢一般呈椭圆形大芽孢。孢内有pHB颗粒。VP-，淀粉水解-。柠檬酸盐利用+。丙酸盐利用-。卵磷脂酶-。葡萄糖、木糖、甘露醇产酸。阿拉伯糖不产酸或弱产酸。能在7％NaCl中生长。不能在厌氧培养基上生长。根据微生物形态学、生理生化特性，查对《系统细菌学伯杰氏手册》，将该新菌株定名为巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)ND2。实施例3

本发明固氮菌固氮功能的测定

A.乙炔还原法

(1)测定方法：按照实施例1中分离纯化固氮菌时测固氮酶活性的同样步骤进行。

(2)测定结果。ND1的乙烯还原活性(ARA)为210-330nmolC₂H₄/hr/ml；ND2的乙烯还原活性(ARA)为160--190nmol C₂H₄/hr/ml；菌株ND1和ND2混合培养有固氮增效作用，混合培养的乙炔还原活性为2500-2800nmol C₂H₄/hr/ml培养基。

B.¹⁵N标记法

(1)测定方法。A：以Dǒ氏培养基配方，每1000ml加5g琼脂及0.2g蛋白胨，配成改良Dǒ氏低氮半固体培养基，在25ml的三角瓶中注入10ml，121℃高压灭菌20分钟。然后，垂直穿刺接种，以橡皮塞密封三角瓶。B：根据用量的计算，在塑料瓶加适量(¹⁵NH₂)₄SO₄，抽气，又加氩气，抽气3次，然后注入适量LiBrO，生成¹⁵N₂备用。(¹⁵NH₂)₄SO₄由上海化工研究院生产，其¹⁵N丰度为10.12％。C：抽出已接种三角瓶中的空气，加氩气，重复3次，然后加8％的氧气，其中空加¹⁵N₂，30℃培养箱中培养2天后，将培养物小心倒入硝煮管中，80℃下烘干。D：在中国农业科学院原子能利用研究所电镜质谱试验室的MU-1305型质谱仪上，测样品中¹⁵N同位素的丰度，质谱仪的精度为0.5％。试验条件为向样品中加浓硫酸5ml，催化剂混合物(K₂SO₄∶Se=500∶1)2ml，消化后用H₂SO₄吸收。

(2)测定结果。ND1的¹⁵N原子百分超为0.311％，ND2的¹⁵N原子百分超为0.103％。实施例4

耐盐性能的测定

以20％和30％的(NH₄)₂SO₄溶液10ml，浸泡NDl和ND2两个菌株的菌粉5-10天，每个菌株菌粉量各1克，蒸馏水浸泡为对照。然后，把浸泡液加入有玻璃珠的90ml无菌水三角瓶中，以30-50rpm速度摇0.5小时，取1ml加于9ml的无菌水试管中摇匀，依次重复稀释至10⁸倍，取10⁶、10⁷、10⁸倍菌悬液各0.1ml于平板中，以三角刮刀均匀涂开，30℃培养1-2天计数，存活率％结果见下表2，可看出ND2菌株的耐盐性较好。表2

	浸泡7天		浸泡14天
菌株	浸泡7天		浸泡14天		浓度20％	浓度30％	浓度20％	浓度30％
ND1	75.6	45.8	85.5	90.2
ND2	82.4	47.1	88.2	94.0

测定ND1在不同浓度(NH₄)₂SO₄培养基中生长情况下，结果如下表3所示。

表3

培养时间	5％	10％	20％	30％
24小时	++	++	+	-
48小时	++	++	+	-

+表示可生长，++表示生长较好，-表示未见生长。实施例5

耐高温性能的测定

以80℃和100℃为处理温度，以1、3、5小时为处理时间，以自然保存温度为对照，对ND1和ND2两个菌株的菌粉进行耐高温处理后，称量1克菌粉放入有玻璃珠的99ml无菌水三角瓶中，以30-50rpm速度摇0.5小时，取1ml加于9ml的无菌水试管中摇匀，依次重复稀释至10⁸倍；各取10⁶、10⁷、10⁸倍菌悬液0.1ml于平板中，以三角刮刀均匀涂开，30℃下培养1-2天计数。根据计数结果把芽孢存活率的影响见下表4。表4

	80℃			100℃
	80℃			100℃	1小时	3小时	5小时	1小时	3小时	5小时
	ND1	90.5	83.3	66.6
ND2	92.0	99.2	60.8

可以看出，本发明新分离出的两菌株均可以耐受较高的温度，在80℃温度-3个小时的处理下菌粉中芽孢存活率基本为80-90％，但看得出处理5小时时ND1和ND2死亡较多。实施例6

本发明固氮菌的其他功能的测定

1.解析磷的能力的测定

所用培养基配方如下表5所示。

表5

原料	用量	原料	用量	原料	用量
葡萄糖	10.0g	(NH₄)₂SO₄	0.5g	NaCl	0.3g
KCl	0.3g	MgSO₄	0.3g	FeSO₄	0.03g
MnSO₄	0.03g	酵母粉	0.5g	CaCO₃	0.1g
卵磷脂	0.02g	蒸馏水	1000ml	磷矿粉	0.1％

按上述配方制备用于测定解磷能力的培养基，用盐酸或NaOH调pH至7.0-7.5。取100ml分装分装于250ml的三角瓶中进行灭菌，按1％接种量接种被测定菌，30℃振荡培养4天，离心，用等离子辐射光谱法测定解析的磷。结果列于下表8中。2.解析钾的能力的测定所用培养基配方如下表6所示。

表6

原料	用量	原料	用量
蔗糖	5.0g	长石粉	0.1％
FeCl₃	0.05g	MgSO₄	0.5g
Na₂HPO₄	2.0g	蒸馏水	1000ml
CaCO₃	0.1g

按上述配方制备用于测定解钾能力的培养基，用盐酸或NaOH调pH至7.0。取100ml分装于250ml的三角瓶中进行灭菌，按1％接种量接种被测定菌，30℃振荡培养4天，离心，取上清夜，用原子吸收光谱法测定解析的钾。结果列于下表8中。3.测定植物激素分泌的培养基所用培养基配方如下表7所示。

表7

原料	用量	原料	用量
葡萄糖	2.0g	酵母粉	0.4％
淀粉	3.0g	MgSO₄	0.5g
KH₂PO₄	2.0g	(NH₄)₂SO₄	0.3g
CaCO₃	0.1g	1％FeCl₃	1.5ml

按上述配方制备测定分泌植物激素用的培养基。取100ml分装于250ml的三角瓶中进行灭菌，按1％接种量接种被测定菌，30℃振荡培养5天，离心，取上清液，用液相色谱法测定本发明的固氮菌分泌出的植物激素。重复三次，取其平均值。结果列于下表8中。

表8

实施例7

本发明固氮菌菌剂的制备

将保存的本发明ND1的试管种，在改良的Dǒ氏低氮平板培养基上划线，在30±1℃温箱中培养24-48小时，至长出单菌落。将典型的单菌落接入试管斜面，在30±1℃温箱中培养48小时。将ND1再由该试管接入装有5ml的液体培养基的试管中，在30±1℃摇床上继续培养24小时。将5ml液体培养基中的ND1按一管对一瓶接入瓶装量为40ml的500ml三角瓶中；在30±1℃、200rpm摇床上培养48小时。接着，将500ml三角瓶中的种子一对一地接入瓶装量为400ml的2000ml三角瓶中，在30±1℃、200rpm摇床上继续培养48小时。然后将种子菌以3％的接种量接入种子罐，以30±1℃的温度和1∶1.5的空气流量进行培养，至生孢率达约95％时停止培养，以10％的接种量将种子菌接入发酵罐，同样以30±1℃的温度和1∶1.5的空气流量进行培养，至生孢率达约95％时停止，即得含本发明ND1的液体菌剂。以平板计数法测发酵液中有效活菌的数量，结果为约1.6×10⁹个ND1/克。

向上述发酵液中按照3-5wt％比例加入载体CaCO₃，离心以制得沉淀物，于70℃烘干，粉碎过80目筛，即得含本发明ND1的粉剂，其中的有效活菌总数为约9.6×10⁹个ND1/克。

制备含本发明ND2的液体菌剂或固体粉剂的工艺与ND1的类似，其中所不同的是，对于本发明ND2来讲，不用经过由试管斜面接入5ml液体培养基的步骤，可由试管斜面直接接入500ml三角瓶中进行种子培养，培养24小时，在2000ml培养瓶中的培养时间为16-18小时，由种子瓶接入发酵罐的接种量为1.5wt％。发酵后，进行平板计数，结果为约2.0×10⁸个ND2/毫升。

如本实施例中关于ND1所述，向上述ND2发酵液中加入载体，然后依次经离心、烘干、粉碎、过筛后制得粉末，经测定含有约1.2×10⁹个ND2/克。实施例8

本发明固氮菌混合菌剂的制备

将实施例7中制备的固氮菌液体菌剂或固体粉剂按照ND1∶ND2=1∶1的比例混合，分别制成液体菌剂混合产品和固体粉剂混合产品，其中有效活菌总数分别为约9.0×10⁸/克和5.4×10⁹/克。实施例9

活性菌剂组合物的制备

按照实施例7中制备ND2菌剂的步骤，分别使用由中国农业大学(中国，北京)提供的有芽孢解磷菌ND3和有芽孢解钾菌ND4，制备解磷菌ND3发酵液或粉剂以及解钾菌ND4发酵液或粉剂；其中在接入试管斜面后在30±1℃的温箱中的培养时间分别为：ND3，12小时；ND4，24-36小时。在种子瓶中的培养时间为：ND3，18小时；ND4，18小时。由种子瓶接入发酵罐的接种量为：ND3，1％；ND4，1.5％。

以平板计数测定有效活菌总数，结果为：

ND3发酵液，含有约8.0×10⁸个ND3/毫升；

ND3粉剂，含有4.8×10⁹个ND3/克；

ND4发酵液，含有约3.6×10⁸个ND4/毫升；

ND4粉剂，含有2.1×10⁹个ND4/克；

将实施例7中制备的ND1粉剂、ND2粉剂和本实施例中制得的ND3粉剂和ND4粉剂按等比混合均匀，制得一种粒度为80-100目的白色粉末状的活性菌剂组合物，其中有效活菌总数的含量为约9.4×10⁹/克。实施例10

生物活性拌种剂的制备

使用实施例9制得的组合物，用草炭(内蒙古，吴川县)为载体，并添加磷酸二氢钾、腐植酸钾，按以下工序生产。以400±20℃对载体高温灭菌：细粉碎达到80-100目；二次灭菌；在无菌间按照1∶12∶0.05∶0.005配方将上述原料掺混。对所得产品用肉眼测外观，按NY/T302-1995测含水量，按NY-227标准测有机质含量，按GB15063-94标准测粒度，有效活菌数和杂菌含量按照NY-227-9标准测定。按NY-227-94pH测定法测pH。所测结果列于下表9中。实施例11

生物活性菌粒的制备

选用草炭(内蒙古，吴川县)为载体，选用污泥作粘合剂，按下述基本工序生产：对载体以400±20℃进行高温烘干灭菌，时间为12分钟；对灭菌烘干后的载体进行细粉碎，要求60目；将实施例9制得的活性菌剂组合物、有机载体、污泥按1∶15∶13的比例，经机械式搅拌均匀：使用圆盘造粒机，加水20％造粒。将成品于料温温度70℃烘干；经自然冷却处理，降低产品温度、水份，增强硬度。对所得产品用肉眼测外观，按NY/T302-1995测含水量，按NY-227-94标准测有机质含量，按GB15063-94标准测粒度和抗压碎力，有效活菌数、杂菌含量和pH按照NY-227-94标准测定。所测结果列于下表9中。

表9

项目	生物活性拌种剂	生物活性菌粒
项目	生物活性拌种剂	生物活性菌粒	外观	黑色粉状松散固体	黑褐色颗粒
有效活菌数	5.1×10⁸	1.2×10⁸	外观	黑色粉状松散固体	黑褐色颗粒
有效活菌数	5.1×10⁸	1.2×10⁸	含水量(％)	5.0	6.0
粒度(mm)	0.18	2.5-4.5	含水量(％)	5.0	6.0
粒度(mm)	0.18	2.5-4.5	有机质(以C计，％)	59	35
杂菌率(％)	15	18	有机质(以C计，％)	59	35
杂菌率(％)	15	18	PH	7.0	7.0
抗压碎力，N		8	PH	7.0	7.0

实施例12

生物活性复混肥的制备

按照与实施例11同样的方法制备生物菌粒，只是将实施例9的活性菌剂组合物、有机载体和污泥按3∶13∶15的比例掺混后造粒，制得制备生物活性复混肥的生物菌粒。将尿素、过磷酸钙、硫酸钾、硼砂、硫酸锰和硫酸锌按1∶0.71∶1.92∶0.006∶0.016∶0.02的比例称料660Kg，加草炭340Kg，按一般复混肥生产工艺制备无机颗粒。将所制得的无机颗粒和生物颗粒按70∶30的比例掺混，制成生物活性复混肥。对所得产品用肉眼测外观，按GB8576-885复混肥料中游离水含量测定(真空烘箱法)测游离水量，按NY-227-94标准测有效活菌总数、杂菌率、pH和有机质含量，按GB15063-94标准测粒度及N、P、K和微量元素的含量。所测结果列于下表10中。实施例13

生物活性颗粒掺混肥的制备

分别生产生物菌粒和无机氮、磷、钾三种单质肥的颗粒，颗粒直径为2-4毫米。生物菌粒按实施例11的方法生产；选用国产粉状钾肥(KCl，中国青海省制造)，将KCl、硼砂、硫酸锰、硫酸锌按70∶10∶10∶10的比例称料，按复混肥生产工艺生产钾肥颗粒；选用粒度、强度、含水率、含养量等符合标准的氮肥(中国海南化肥厂生产的大颗粒尿素)、磷肥颗粒(美国生产的磷酸二铵)；按1∶1∶1∶1将四种颗粒掺混。对所得产品用肉眼测外观，按GB8576-885复混肥料中游离水含量测定(真空烘箱法)测游离水量，按NY-227-94标准测有效活菌总数、杂菌率、pH和有机质含量，按GB15063-94标准测粒度及N、P、K和微量元素的含量。所测结果列于下表10中。表10

项目	生物活性复混肥	生物活性颗粒掺混肥
项目	生物活性复混肥	生物活性颗粒掺混肥	总养分含量(N+P₂O₅+K₂O),％	20	25
水溶性磷占有效磷百分率，％	50	45	总养分含量(N+P₂O₅+K₂O),％	20	25
水溶性磷占有效磷百分率，％	50	45	游离水含量，％	6.6	3
颗粒平均抗压碎力	8N	12N	游离水含量，％	6.6	3
颗粒平均抗压碎力	8N	12N	粒度为球状(2.5～4.5mm),％	98	99
有机质含量，％	26	15	粒度为球状(2.5～4.5mm),％	98	99
有机质含量，％	26	15	有效活菌数(亿/克)	3.6×10⁷	2.1×10⁷
杂菌率，％	18	15	有效活菌数(亿/克)	3.6×10⁷	2.1×10⁷
杂菌率，％	18	15	粒径(mm)	2.5～4.5mm	2.5～4.5mm
PH	7.0	7.0	粒径(mm)	2.5～4.5mm	2.5～4.5mm

实施例14

本发明生物活性菌剂组合物的效果

盆载及大田试验显示，本发明实施例9的生物活性菌剂组合物的增产幅度为9.95-53.5％。我们设计了严格的盆载试验、三角瓶试验、大田试验，对试验材料的光合面积和光合强度、根系吸收面积及根系活力、土壤固氮酶活性变化等进行了测定。具体的测定步骤和结果如下：

1.增大叶面积、增加叶绿素含量。

取相应位置叶片称取1-2g，乙醇提取，分光光度计比色，读取消光值，按公式计算出叶绿素含量(mg/g鲜叶)=(C×25)/G。C=D₆₅₂/34.5。结果如下：表11增加叶绿素含量(mg/g)

	小麦	玉米	油菜
对照	1.188	0.555	0.918
试验	1.796	0.808	1.569
增加值(％)	51.2	45.6	70.9

表12增加叶面积(cm²)

	小麦	玉米	油菜
对照	65.91	72.09	39.23
试验	77.59	146.29	66.87
增加值(％)	17.7	102.9	70.5

作物的产量，不管是子粒还是茎叶，都是光合作物的产物，没有光合作用就没有产量可言。光合作用的强弱取决于叶面积大小和光合强度。叶绿素是吸收光能的物质。从上表可以看出所试作物叶绿素含量普遍增加，增幅达45-70％。叶面积增幅达17-100％。这就大大提高了光能利用率，增加了光合产物的合成。

2.扩大根系吸收面积、增强根系活力

称取根1-2g，用α-奈胺氧化法测定根系活力。根据光密度值查对标准曲线得相应的α-奈胺浓度。根系氧化的α-奈胺量=试验开始时的α-奈胺量-自动氧化值-结束时α-奈胺量。被氧化的α-奈胺量以μg/单位根重/小时表达。结果如下表13所列：

表13

从上表可知，根重和根系活力均有增加，增幅分别为23-29％、48-57％。由于养分吸收面积和吸收强度的增加，这就保证提供给植物更多的养分和水分，使作物合成更多的蛋白、脂肪、糖类等物质，促进植物生长、代谢，进而提高作物产量。

3.增强土壤固氮酶活性

在水稻盆载和田间试验中，在不同生育期取根际土样测定固氮酶活性。具体方法是：每隔17天用原位法取样测定ARA，取样时用直径4cm、高11cm的铜管取根际原柱土样连同土管放入广口瓶中，密封，抽出10％的气体，再换入10％的乙炔气体，30℃培养24小时，测ARA，每个处理三次重复，并设不加乙炔对照。

试验田的土壤的ARA值一直比对照高，抽穗时出现高峰，试验的ARA值明显高于对照。

通过以上的说明可以看出本发明的固氮菌是一种耐热、耐干的有芽孢的固氮菌。与单一菌剂的效果相比，本发明混合菌剂的固氮作用更强，效果更好。本发明的生物活性肥制品耐热、耐干，所以易于储存、运输和施用。

Claims

1．一种固氮菌ND1，是一种球型芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)，其保藏编号为CGMCC-----。

2．一种固氮菌剂，该菌剂是权利要求1的固氮菌ND1的发酵培养液，其中含有1.0×10⁸-2.0×10⁹个ND1/毫升。

3．一种固氮菌剂，所述菌剂为粉末或颗粒状固体，由权利要求2的固氮菌剂经进一步加入载体、干燥、粉碎制得，其中含有5.0～7.0×10⁸-1.0～1.4×10¹⁰个ND1/克。

4．按照权利要求3的固氮菌剂，其中的载体为碳酸钙、高岭土、膨润土中的一种或多种，该载体的添加量为3-5wt％。。

5．权利要求4的固氮菌剂，其中的载体为碳酸钙，该菌剂至少含有7.0×10⁹个ND1/克。

6．权利要求3、4或5的固氮菌剂，其中的颗粒大小为80-100目。

7．一种固氮菌ND2，是一种巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，其保藏编号为CGMCC-----。

8．一种固氮菌剂，该菌剂是权利要求7的固氮菌ND2的发酵培养液，其中含有1.0×10⁷-4.0×10⁸个ND2/毫升。

9．一种固氮菌剂，所述菌剂为粉末或颗粒状固体，由权利要求8的固氮菌剂经进一步加入载体、干燥、粉碎制得，其中含有5.0～7.0×10⁷-2.0～2.8×10⁹个ND2/克。

10．按照权利要求9的固氮菌剂，其中的载体为碳酸钙、高岭土、膨润土中的一种或多种，该载体的添加量为3-5％。

11．权利要求10的固氮菌剂，其中的载体为碳酸钙，该菌剂至少含有2.0×10⁸个ND2/克。

12．权利要求9、10或11的固氮菌剂，其中的颗粒大小为80-100目。

13．一种生物活性菌剂的组合物，含有按0.5～1∶0.5～1的比例配合的如权利要求4和10所述的固氮菌剂，其中的有效活菌总数为3.0×10⁹～1.2×10¹⁰／克。

14．权利要求13的生物活性菌剂的组合物，还含有相当于ND1的孢粉量0.5～1倍的解磷菌的孢粉，其中，有效活菌总数为3.0×10⁹～1.2×10¹⁰/克。

15．权利要求13的生物活性菌剂的组合物，还含有相当于ND1的孢粉量0.5～1倍的解钾菌的孢粉，其中，有效活菌总数为3.0×10⁹～1.2×10¹⁰/克。

16．权利要求13的生物活性菌剂的组合物，还含有分别相当于ND1的孢粉量0.5～1倍的解钾菌的孢粉和解磷菌的孢粉，其中，有效活菌总数为3.0×10⁹～1.2×10¹⁰/克。

17．权利要求13～16中任一项所述的生物活性菌剂的组合物，其中的载体为碳酸钙，有效活菌总数至少为7.0×10⁹/克。

18．权利要求13～16中任一项所述的生物活性菌剂的组合物，其中的颗粒大小为80-100目。

19．权利要求17的生物活性菌剂的组合物，其中的颗粒大小为80-100目。

20．权利要求13～16中任一项所述的生物活性菌剂的组合物，还含有与所述活性菌剂按1∶10～30的比例配合的有机质，其中，有效活菌总数为1.0×10⁸～1.2×10⁹/克。

21．权利要求20的生物活性菌剂的组合物，其中所述的有机质为选自污泥、垃圾、粪便、秸杆、草炭等中的一种或多种的混合物，该组合物中的颗粒大小为80-100目，其中，有效活菌总数至少为4.0×10⁸/克。

22．权利要求21的生物活性菌剂的组合物，其中所述的有机质为草炭。

23．权利要求13～16中任一项所述的生物活性菌剂的组合物，还含有与所述活性菌剂按1∶30～40的比例配合的有机质，其中有效活菌总数为1.0×10⁷～6.0×10⁷/克。

24．权利要求23的生物活性菌剂的组合物，其中所述的有机质为选自污泥、垃圾、粪便、秸杆、草炭等中的一种或多种的混合物，该组合物是颗粒大小为2.5-4.5毫米的颗粒，其中，有效活菌总数至少为2.5×10⁷/克。

25．权利要求24的生物活性菌剂组合物，其中所述的有机质为草炭。

26．权利要求24的生物活性菌剂组合物，其中所述的有机质为动物粪便。

27．权利要求1或7所述的固氮菌、权利要求2-6、8-12中任一项所述的固氮菌剂或权利要求13-26中任一项所述的生物活性菌剂的组合物用于制备生物活性肥制品的应用。