CN109988737A - 一种慢生根瘤菌液体培养基及其制备、培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种慢生根瘤菌液体培养基及其制备、培养方法，其原料包括黄腐酸、甘露醇、酵母提取物、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、NaCl、CaCl2、FeCl3、H3BO3、Na2MnO4和生物素。制备方法为将原料与水混合配置成溶液。本发明制备的培养基培养慢生根瘤菌的发明原料来源广泛，制备方法简单易行，只需一次发酵，中途无需补料；在此基础上利用本发明所制备的培养基培养慢生根瘤菌比普通培养基培养效果更好，该方法包括：菌种的活化、种子培养和发酵培养。本申请在相同时间内利用本发明的培养基培养的慢生根瘤菌的菌体密度更大，同时在满足一定菌体量的前提下可以缩短发酵时间；因此本发明制备的培养基对慢生根瘤菌的生长效率方面有明显的提高。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种慢生根瘤菌液体培养基及其制备、培养方法。
背景技术
根瘤菌与豆科植物共生固氮体系是自然界中固氮率最高、固氮量最多的生物固氮体系。接种根瘤剂已经成为世界各国豆科作物增产的一项技术措施。该技术能提高土壤中氮含量，有效供给豆科植物对氮素的需求，促进豆科植物增产。生产中根瘤菌的培养常选用YEM培养基，其组成成分为：甘露醇10g/L、酵母提取物1.0g/L、K2HPO40.5g/L、MgSO40.5g/L、NaCl 0.2g/L，但慢生根瘤菌在上述培养基中生长缓慢，这不仅增加了发酵时间，提高了发酵经济成本，还制约了其在大田生产中的应用。因此，如何缩短慢生根瘤菌发酵时间，降低生产成本，适应大量工业发酵的培养基成为当前亟需解决的问题。
专利CN2014101814187公开了一种慢生根瘤菌培养基的配置方法及其配制的培养基，其培养基组成为：大豆粉10g、K2HPO40.25g、KH2PO40.25g、MgSO4·7H2O0.2g、NaCl 0.1g、CaCO30.2g、1wt％的柠檬酸铁1ml、1wt％的MnSO41ml、蒸馏水1000ml。该培养基具有效提高了活菌数高，降低了生产成本。陈守文等公开的“紫云英根瘤菌高密度发酵工艺”通过向YM培养基(其YM培养基组成为：甘露醇10.0g/L、酵母粉1.0g/L、K2HPO4·3H2O 0.5g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、NaCl 0.1g/L、CaCO3 5g/L)补加葡萄糖、酵母粉和蛋白胨达到高密度发酵的目的，其发酵液中菌含量为130亿/ml以上，但上述发明需要多次进行发酵，中途进行补料，发酵时间较长。
发明内容
本发明的目的是提供一种慢生根瘤菌液体培养基及其制备、培养方法，解决培养过程中多次发酵、中途补料、发酵时间长的问题。
为了解决上述问题，本发明采用如下技术方案：
一种提高慢生根瘤菌生长速率的培养基，包括以下原料：黄腐酸、甘露醇、酵母提取物、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、NaCl、CaCl2、FeCl3、H3BO3、Na2MnO4和生物素。
优选的，所述慢生根瘤菌为大豆慢生根瘤菌或花生慢生根瘤菌或豇豆慢生根瘤菌。
一种提高慢生根瘤菌生长速率培养基的制备方法，包括以下步骤：将上述原料按照相应的比例加入到纯水中，混合均匀。
优选的，黄腐酸、甘露醇、酵母提取物、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、NaCl、CaCl2、FeCl3、H3BO3、Na2MnO4和生物素的质量浓度为0.01～1g/L、5～15g/L、0.5～1.5g/L、0.1～0.8g/L、0.1～0.8g/L、0.02～0.4g/L、0.05～0.15g/L、0.01～0.08g/L、0.01～0.05g/L、0.01～0.04g/L、0.05～0.15g/L。
优选的，所述溶液pH为6.8～7.5。
进一步优选的，所述溶液的pH用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl进行调节。
根据上述培养基的慢生根瘤菌培养方法，包括以下步骤：
(1)菌种的活化：接种慢生根瘤菌至斜面培养基，在温度28℃下培养72小时；
(2)种子培养：将活化菌种转接至灭菌液体的种子培养基中，在温度28℃于160～180r/min条件下摇床培养48～72小时；
(3)发酵培养：以体积分数5～10％接种量将步骤(2)得到的种子液转入到发酵培养基中，在温度28℃于160～180r/min条件下摇床培养48～72小时，得到所述液体慢生根瘤菌菌剂。
进一步优选的，所述步骤(1)中斜面培养基的制备方法为，在上述制备的慢生根瘤菌液体培养基中加入15～20g/L的琼脂，在121℃下高压灭菌30分钟后，趁热将试管斜放。
进一步优选的，所述步骤(2)中种子培养基制备方法为，将上述制备的慢生根瘤菌液体培养基在121℃下高压灭菌30分钟即可制得种子培养基。
进一步优选的，其特征在于，所述步骤(3)中发酵培养基的制备方法为，将上述制备的慢生根瘤菌液体培养基在121℃下高压灭菌30分钟即可制得种子培养基。
与现有技术相比，本发明的有益技术效果：本发明制备的培养基原料来源广泛，成本较低；制备方法简单，只需一次发酵，中途无需补料；在此基础上利用本发明所制备的培养基培养慢生根瘤菌比普通培养基培养效果更好，在相同时间内利用本发明的培养基培养的慢生根瘤菌的菌体密度更大，同时在满足一定菌体量的前提下可以缩短发酵时间；因此本发明制备的培养基对慢生根瘤菌的生长效率方面有明显的提高。
具体实施方式
下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更容易被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界点。
实施例1慢生根瘤菌培养基
本实施例所述的慢生根瘤菌培养基是由黄腐酸、甘露醇、酵母提取物、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、NaCl、CaCl2、FeCl3、H3BO3、Na2MnO4和生物素溶于水混合均匀得到，其中所述成分的质量浓度分别为0.1g/L、10g/L、1g/L、0.5g/L、0.5g/L、0.2g/L、0.1g/L、0.04g/L、0.03g/L、0.025g/L、0.025g/L、0.1g/L，所配置的溶液pH为6.8。
实施例2慢生根瘤菌培养基
本实施例所述的慢生根瘤菌培养基是由黄腐酸、甘露醇、酵母提取物、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、NaCl、CaCl2、FeCl3、H3BO3、Na2MnO4和生物素溶于水混合均匀得到，其中所述成分的质量浓度分别为0.1g/L、10g/L、1g/L、0.5g/L、0.5g/L、0.2g/L、0.1g/L、0.04g/L、0.03g/L、0.025g/L、0.025g/L、0.1g/L，所配置的溶液pH为7.0。
实施例3慢生根瘤菌培养基
本实施例所述的慢生根瘤菌培养基是由黄腐酸、甘露醇、酵母提取物、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、NaCl、CaCl2、FeCl3、H3BO3、Na2MnO4和生物素溶于水混合均匀得到，其中所述成分的质量浓度分别为0.1g/L、10g/L、1g/L、0.5g/L、0.5g/L、0.2g/L、0.1g/L、0.04g/L、0.03g/L、0.025g/L、0.025g/L、0.1g/L，所配置的溶液pH为7.5。
实施例4慢生根瘤菌培养基
本实施例所述的慢生根瘤菌培养基是由黄腐酸、甘露醇、酵母提取物、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、NaCl、CaCl2、FeCl3、H3BO3、Na2MnO4和生物素溶于水混合均匀得到，其中所述成分的质量浓度分别为0.01g/L、5g/L、0.5g/L、0.1g/L、0.1g/L、0.02g/L、0.05g/L、0.01g/L、0.01g/L、0.01g/L、0.05g/L，所配置的溶液pH为6.8。
实施例5慢生根瘤菌培养基
本实施例所述的慢生根瘤菌培养基是由黄腐酸、甘露醇、酵母提取物、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、NaCl、CaCl2、FeCl3、H3BO3、Na2MnO4和生物素溶于水混合均匀得到，其中所述成分的质量浓度分别为1g/L、15g/L、1.5g/L、0.8g/L、0.8g/L、0.4g/L、0.15g/L、0.08g/L、0.05g/L、0.04g/L、0.15g/L，所配置的溶液pH为6.8。
实施例6大豆慢生根瘤菌的培养
(1)菌种的活化：接种大豆慢生根瘤菌至斜面培养基，在温度28℃下培养72小时；
(2)种子培养：将活化菌种转接至所制备的种子培养基中，在温度28℃于180r/min条件下摇床培养72小时；
(3)发酵培养：以体积分数10％接种量将前面步骤得到的种子液转入到上述制备的发酵培养基中，在温度28℃于180r/min条件下摇床培养72小时，得到所述液体大豆慢生根瘤菌菌剂。
制备斜面培养基：按照具体实施例1～5中的培养基组成之一，加入15g/L琼脂，在121℃下高压灭菌30分钟后，趁热将试管斜放，制成斜面培养基。
制备种子培养基和发酵培养基：按照具体实施例1～5中的培养基组成之一，分别配置种子培养基和发酵培养基，在121℃下高压灭菌30分钟。
经检测，该培养方法得到的大豆根瘤菌数量是同等培养条件与时间下YEM培养基的8倍；同时该培养方法得到50亿的大豆根瘤菌数量所花费的时间与普通培养基相比缩短3天。
实施例7花生慢生根瘤菌的培养
(1)菌种的活化：接种花生慢生根瘤菌至斜面培养基，在温度28℃下培养96小时；
(2)种子培养：将活化菌种转接至所制备的种子培养基中，在温度28℃于160r/min条件下摇床培养96小时；
(3)发酵培养：以体积分数5％接种量将步骤(2)得到的种子液转入到所制备的发酵培养基中，在温度28℃于160r/min条件下摇床培养96小时，得到所述液体花生慢生根瘤菌菌剂。
制备斜面培养基：按照具体实施例1～5中的培养基组成之一，加入18g/L琼脂，在121℃下高压灭菌30分钟后，趁热将试管斜放，制成斜面培养基。
制备种子培养基和发酵培养基：按照具体实施例1～5中的培养基组成之一，分别配置种子培养基和发酵培养基，在121℃下高压灭菌30分钟。
经检测，该培养方法得到的花生根瘤菌数量是同等培养条件与时间下YEM培养基的3倍，同时该培养方法得到50亿的花生根瘤菌数量所花费的时间与普通培养基相比缩短1天。
实施例8豇豆慢生根瘤菌的培养
(1)菌种的活化：接种豇豆慢生根瘤菌至斜面培养基，在温度28℃下培养96小时；
(2)种子培养：将活化菌种转移至所制备的种子培养基中，在温度28℃160r/min条件下摇床培养96小时；
(3)发酵培养：以体积分数5％接种量将步骤(2)得到的种子液转入到所制备的发酵培养基中，在温度28℃于160r/min条件下摇床培养96小时，得到所述液体豇豆慢生根瘤菌菌剂。
制备斜面培养基：按照具体实施例1～5中的培养基组成之一，加入20g/L琼脂，在121℃下高压灭菌30分钟后，趁热将试管斜放，制成斜面培养基。
制备种子培养基和发酵培养基：按照具体实施例1～5中的培养基组成之一，分别配置种子培养基和发酵培养基，在121℃下高压灭菌30分钟。
经检测，该培养方法所得到的豇豆根瘤菌数量是同等培养条件与时间上YEM培养基的5倍，同时该培养方法得到50亿的豇豆慢生根瘤菌数量所花费时间比普通培养基缩短两天。
综上所述，使用本发明制备的培养基培养慢生根瘤菌在数量与时间上都有所提高。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种慢生根瘤菌液体培养基，其特征在于，包括以下原料：黄腐酸、甘露醇、酵母提取物、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、NaCl、CaCl2、FeCl3、H3BO3、Na2MnO4和生物素。
2.根据权利要求1所述的慢生根瘤菌，其特征在于，所述慢生根瘤菌为大豆慢生根瘤菌或花生慢生根瘤菌或豇豆慢生根瘤菌。
3.一种慢生根瘤菌液体培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将上述原料按照相应的比例加入到纯水中，混合均匀。
4.根据权利要求3所述的培养基，其特征在于，所述培养基中黄腐酸、甘露醇、酵母提取物、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、NaCl、CaCl2、FeCl3、H3BO3、Na2MnO4和生物素的质量浓度分别为0.01～1g/L、5～15g/L、0.5～1.5g/L、0.1～0.8g/L、0.1～0.8g/L、0.02～0.4g/L、0.05～0.15g/L、0.01～0.08g/L、0.01～0.05g/L、0.01～0.04g/L、0.05～0.15g/L。
5.根据权利要求3所述的培养基，其特征在于，所述溶液pH为6.8～7.5。
6.根据权利要求5所述的培养基，其特征在于，所述溶液的pH用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl进行调节。
7.根据1～6所述培养基的慢生根瘤菌培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)菌种的活化：接种慢生根瘤菌至斜面培养基，在温度28℃下培养72小时；
(2)种子培养：将活化菌种转接至灭菌液体的种子培养基中，在温度28℃于160～180r/min条件下摇床培养48～72小时；
(3)发酵培养：以体积分数5～10％接种量将步骤(2)得到的种子液转入到发酵培养基中，在温度28℃于160～180r/min条件下摇床培养48～72小时，得到所述液体慢生根瘤菌菌剂。
8.根据权利要求7所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(1)中斜面培养基的制备方法为，在上述制备的慢生根瘤菌液体培养基中加入15～20g/L的琼脂，在121℃下高压灭菌30分钟后，趁热将试管斜放。
9.根据权利要求7所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(2)中种子培养基制备方法为，将上述制备的慢生根瘤菌液体培养基在121℃下高压灭菌30分钟即可制得种子培养基。
10.根据权利要求7所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(3)中发酵培养基的制备方法为，将上述制备的慢生根瘤菌液体培养基在121℃下高压灭菌30分钟即可制得种子培养基。
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