CN110684687A - 一株粪肠球菌st5及其在偶氮染料降解中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株粪肠球菌ST5，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2019771，可用于偶氮染料活性黑5、直接蓝2B、刚果红、甲基橙、直接黑38、活性绿19、酸性橙7的降解。本发明的菌株粪肠球菌ST5可对不同结构的偶氮染料进行高效降解，并能耐受高浓度的染料，且能适应相较广泛的环境因子变化范围。为偶氮染料的生物降解提高可能的菌株来源，为印染废水的工业化处理提供发展潜能，也为染料排放后的自我降解和修复提供了研究依据。

Description

一株粪肠球菌ST5及其在偶氮染料降解中的应用

技术领域

本发明涉及粪肠球菌，尤其涉及一株可降解多种偶氮染料的粪肠球菌ST5。

背景技术

在流域常见的污染物中，合成染料是常见的污染物之一。根据染料发色基团的化学结构，可以将染料分为8大类，分别为偶氮染料、蒽醌染料、三苯甲烷染料、靛族染料、杂环染料、菁系染料、硫化染料以及酞菁染料，其中，偶氮类染料是最常用的一大类染料，约占全部染料的50％-70％。染料废水是较难处理的工业废水之一，具有色度深、碱性大、有机污染物含量高和水质变化大的特点。大部分染料结构极其稳定，进入环境水域后难以自然降解，造成受污染水域色度增加，导致入射光线量大大减少，影响水生动植物的正常生命活动，破坏水体生态平衡。更为严重的是，大多数染料为有毒、难降解的有机物，化学稳定性强，具有致癌、致畸、致突变作用，排放到环境中对人类和其他生物的健康构成极大的威胁。

用于印染废水的处理方法，主要有物理法、化学法和生物法。物理法包括吸附法、膜分离法和磁分离法等，化学法包括电化学法和氧化法等。这两类方法成本高，处理效果较差，且受到许多条件的限制。相比之下，利用生物法降解染料，是十分经济，高效和环保的，因此，国内外仍然以生物法处理废水为主，且很多单一的物理化学法联合了生物法，大大提高印染废水的脱色效果。目前，生物法使用的微生物，主要是细菌、丝状真菌、酵母菌和藻类等。这些微生物中，丝状真菌生长周期长；酵母菌对染料的脱色方式主要为吸附，若处理不当，会对环境造成二次污染；藻类需要进行光合作用，且藻体对染料的吸附会产生二次污染。而由于细菌的种类最繁多，繁殖周期短，降解效率高，在染料废水的处理中发挥极为重要的作用。因产品类型及生产工艺流程的不同，印染废水环境复杂多变，包括污染物的成分与含量、pH、温度、有氧/无氧、盐度和金属离子等，都可能影响细菌降解染料的能力。此外，不同微生物对同一种染料的最佳降解条件不同，同一种微生物对不同种染料的最佳降解条件也有所差异。由于河口及近岸生态系统理化环境复杂多变，且沉积物汇集大量的污染物，生存于其中的细菌长期受到环境及各种污染物的胁迫，可能逐渐形成相应的响应机制来适应压力。因此，从河口及近岸海洋沉积物中，寻找可高效降解偶氮染料的功能菌株，以应用于印染废水的处理。

发明内容

本发明的目的在于提供一株粪肠球菌ST5及其在偶氮染料降解中的应用，本发明以8种偶氮染料为底物，从河口沉积物中筛选可高效降解染料的菌株粪肠球菌ST5(Enterococcus faecalis strain ST5)，并对其降解特性进行研究，以解决现有技术存在的问题。

一株粪肠球菌ST5(Enterococcus faecalis strain ST5)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为中国武汉大学，保藏日期为2019年9月30日，其保藏编号为CCTCC M 2019771。

上述粪肠球菌ST5的培养方法，培养基的组成为：蛋白胨10.0g、酵母粉5.0g、NaCl10.0g、去离子水1.0L、pH＝7.4。

优选的，培养的条件为温度设为35℃、pH值为8，NaCl的浓度为0。

上述粪肠球菌ST5的应用，用于偶氮染料的降解。

优选的，所述偶氮染料包括活性黑5、直接蓝2B、刚果红、甲基橙、直接黑38、活性绿19、酸性橙7。

与现有技术相比，本发明的菌株粪肠球菌ST5可对不同结构的偶氮染料进行高效降解，并能耐受高浓度的染料，且能适应相较广泛的环境因子变化范围。为偶氮染料的生物降解提高可能的菌株来源，为印染废水的工业化处理提供发展潜能，也为染料排放后的自我降解和修复提供了研究依据。

附图说明

图1是本发明的菌株筛选采样站点分布图；

图2是本发明的粪肠球菌ST5菌株形态电镜图；

图3是本发明的粪肠球菌ST5的系统进化树；

图4是本发明的粪肠球菌ST5对8种偶氮染料的脱色效果图；

图5是染料初始浓度对本发明的粪肠球菌ST5的染料脱色率的影响；

图6是温度对本发明的粪肠球菌ST5的生长与脱色的影响；

图7是pH对本发明的粪肠球菌ST5的生长与脱色的影响；

图8是盐度对本发明的粪肠球菌ST5的脱色率的影响；

图9是金属离子对本发明的粪肠球菌ST5的脱色率的影响；

图10是本发明的粪肠球菌ST5对酸性橙7的降解途径。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。

实施例1

粪肠球菌ST5(Enterococcus faecalis strain ST5)的筛选与培养

(1)、筛选和培养所用的的培养基

2216E液体培养基：蛋白胨5.0g、酵母粉1.0g、NaCl19.45g、柠檬酸铁0.1g、氯化镁5.98g、硫酸钠3.24g、氯化钙1.8g、氯化钾0.55g、碳酸钠0.16g、溴化钾0.08g、氯化锶0.034g、硼酸0.022g、硅酸钠0.004g、硝酸钠0.0016g、磷酸氢二钠0.008g、去离子水1.0L，pH7.4；

2216E固体培养基：蛋白胨5.0g、酵母粉1.0g、NaCl19.45g、柠檬酸铁0.1g、氯化镁5.98g、硫酸钠3.24g、氯化钙1.8g、氯化钾0.55g、碳酸钠0.16g、溴化钾0.08g、氯化锶0.034g、硼酸0.022g、硅酸钠0.004g、硝酸钠0.0016g、磷酸氢二钠0.008g、20.0g琼脂、去离子水1.0L，pH7.4；

LB液体培养基(筛选、分离、富集与脱色用，g.L^-1):蛋白胨10.0g、酵母粉5.0g、NaCl10.0g、去离子水1.0L、pH＝7.4；

LB固体培养基：蛋白胨10.0g、酵母粉5.0g、NaCl10.0g、20.0g琼脂、去离子水1.0L、pH＝7.4。

(2)、粪肠球菌ST5的筛选分离过程

按照图1的菌株筛选采样站点标注所示，每个点取约5g近岸沉积物样品于无菌离心管中，加入20ml无菌水，充分震荡，使无菌水与沉积物样品充分混合，将震荡后的悬浊液静置，使颗粒物沉淀，取1ml上清悬液于装有25ml 2216E液体培养基(含20mg/L偶氮染料)的50ml试管中，用灭菌封口膜封口(所有操作于超净工作台中完成)，于30℃的恒温培养箱中培养24h。

选取脱色明显的实验管，将10ml培养液转接于新的含染料的2216E培养基中培养，如此反复3-5次，染料浓度逐步提高致100mg/L，驯化培养结束。取反应液梯度稀释后，均匀涂布于含有染料的2216E固体培养基上，30℃恒温培养，待菌落长出后，挑取其中有无色透明圈的单菌落，用接种环挑取至2216E液体培养基中培养。于不同时间段测其脱色率，选取脱色率大于85％的菌株在LB固体培养基上划线，挑单菌落，进行多次纯化。获得单菌株后加20％(v:v)甘油，于-86℃冰箱保存备用。

(3)环境条件影响实验脱色菌培养方法和条件

接种脱色菌株种子液于5mL含有100mg/L染料的LB液体培养基中，分别放置在不同的环境条件下，静置培养6或12h，测定脱色率与OD₆₀₀值。温度梯度分别设置为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃和50℃。pH值梯度设置为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0，用盐酸和氢氧化钠调节培养基初始pH值。盐度影响实验则是往培养基中添加NaCl，浓度梯度设置为0g/L、10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、70g/L、80g/L、90g/L、100g/L和110g/L。染料初始浓度梯度设置为100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L、1000mg/L、1500mg/L和2000mg/L。金属离子的影响实验，则是在含染料的LB培养基中分别加入Mn²⁺、Pb²⁺、Fe³⁺、Ca²⁺、Ba²⁺、Ag⁺、Cd²⁺、Ni⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Mg²⁺和Co²⁺，调节各离子浓度为1mmol/L。

成功分离培养出一株对多种偶氮染料具有较高脱色率的菌株，命名为粪肠球菌ST5(Enterococcus faecalis strain ST5)，其部分16S rDNA序列成功上传至美国国立生物技术信息中心(NCBI)，accession number为MK894863。E.faecalis strain ST5可对不同结构的偶氮染料进行降解，并能耐受高浓度的染料，且能适应相较广泛的环境因子变化范围。菌株形态电镜图如图2所示，革兰氏阳性菌，卵球形，多以成对的方式存在，无芽孢。在LB培养基平板上形成的菌落呈圆形、乳白色，表面凸起湿润，有光泽，边缘整齐。粪肠球菌ST5的系统进化树如图3所示。

在静置缺氧培养条件下，发现E.faecalis strain ST5(Enterococcus faecalisstrain ST5)难以利用染料为单一营养源，在LB培养基中，对活性黑5(RB5)、直接蓝2B(DB2)、刚果红(CR)、甲基橙(MO)、活性黄84(RY84)、直接黑38(DB38)、活性绿19(RG19)、酸性橙7(AO7)8种偶氮染料有较高的脱色效率。粪肠球菌ST5对8种偶氮染料的脱色效果图，如图4所示。在30℃静置培养的条件下，除RY84外，E.faecalis strain ST5对其余7种染料(100mg/L)12h内的脱色率均大于60％。

理化因子(温度、盐度、pH、染料初始浓度、金属离子)对菌株的影响研究如图5-9所示，随着温度的上升，E.faecalis strain ST5脱色菌株的OD₆₀₀值持续上升，在35℃处达到最大，培养12h后，OD₆₀₀达到最大值。当温度继续升高，OD₆₀₀值下降。当温度升至50℃度时，E.faecalis strain ST5菌株对的脱色率约为90％。E.faecalis strain ST5的最适合pH为8，此时脱色率为96.42％，在pH为5时也能生长和脱色。E.faecalis strain ST5在含盐量为0g/L的培养基中有最大的OD₆₀₀值。当含盐量为70g/L时，脱色菌株对酸性橙7的脱色率仍高达90％。酸性橙7的浓度为2000mg/L时，E.faecalis strain ST5在30℃静止培养24h时的脱色率约为30％。金属离子Mn²⁺、Pb²⁺、Fe³⁺、Fe²⁺、Ca²⁺、Ba²⁺、Ag⁺、Cd²⁺、Ni⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Mg²⁺和Co²⁺对E.faecalis strain ST5的影响效果各异，其中Cd²⁺和Cu²⁺离子对E.faecalis strainST5的抑制效果较强，E.faecalis strain ST5对Pb²⁺、Ag⁺和Co²⁺的耐受性较好，而其他离子对E.faecalis strain ST5的影响较小。E.faecalis strain ST5对酸性橙7脱色后，酸性橙7的最大吸收峰消失，在200-400nm之间有新的吸收峰产生。通过高效液相色谱和气相色谱-质谱联用仪等手段，对酸性橙7的降解产物进行分析，推测出E.faecalis strain ST5对酸性橙7的降解通路。根据已报道的偶氮还原酶(AzoR)基因设计引物，成功从E.faecalisstrain ST5克隆出一段与偶氮还原酶基因(AzoR)相似大于99％的基因，命名为AzoR-1。

SEQUENCE LISTING

<110> 汕头大学

<120> 一株粪肠球菌ST5及其在偶氮染料降解中的应用

<130> 2019

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 275

<212> DNA

<213> 未知

<400> 1

aagaattatt atctgcttgg ggtgcacttc gcgctggcgc agcatttgaa cattaagcga 60

aaaccaacaa caaaaagtgg ctcgttttaa tgaattaact gatcaatttt tatctgcaga 120

caaagtagta attgctaatc caatgtggaa cttaaacgta ccgacacgct taaaagcttg 180

ggtagataca atcaacgttg ctggaaaaac attccaatat actgcagaag gaccaaaacc 240

tctaacaagt ggtaaaaaag ccttacacat ccaat 275

Claims (5)

1.一株粪肠球菌ST5，其特征在于，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2019771。

2.根据权利要求1所述粪肠球菌ST5的培养方法，其特征在于，培养基的组成为：蛋白胨10.0g、酵母粉5.0g、NaCl 10.0g、去离子水1.0L、pH＝7.4。

3.根据权利要求2所述培养方法，其特征在于，培养的条件为温度设为35℃、pH值为8，NaCl的浓度为0。

4.根据权利要求1所述粪肠球菌ST5的应用，其特征在于，用于偶氮染料的降解。

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述偶氮染料包括活性黑5、直接蓝2B、刚果红、甲基橙、直接黑38、活性绿19、酸性橙7。

Images