CN106148231A

CN106148231A - 一株粪肠球菌y17及其筛选培养与应用

Info

Publication number: CN106148231A
Application number: CN201610547932.7A
Authority: CN
Inventors: 李升康; 吕永玲; 李忠贞; 刘文华; 胡忠; 温小波
Original assignee: Shantou University
Current assignee: Shantou University
Priority date: 2016-07-12
Filing date: 2016-07-12
Publication date: 2016-11-23
Anticipated expiration: 2036-07-12
Also published as: CN106148231B

Abstract

本发明涉及一株粪肠球菌Y17及其筛选培养与应用，其保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2016249。粪肠球菌Y17最佳培养条件：温度为28 ˚C，转速为180 r/min，接种量为1%。初始pH 分别为7.0，最佳培养基分别为MRS；该粪肠球菌Y17对副溶血弧菌有显著抑菌效果，具备一定的抗逆性、拮抗致病菌能力和产酶能力，无血细胞溶解性，对绝大多数抗生素无耐药性，经浸浴试验验证对宿主无害,经过养殖试验验证它还能够提高机体的免疫力，其应用前景广泛，可以将其应用于益生菌制剂，也可以将其制成菌粉，作为饲料添加剂添加到饲料中，用来抑制动物体内致病菌生长，降低动物尤其是青蟹的死亡率，是一株值得开发的益生菌株。

Description

一株粪肠球菌Y17及其筛选培养与应用

技术领域

本发明涉及一株粪肠球菌，尤其涉及一株对拟穴青蟹具有益生活性的粪肠球菌Y17及其筛选培养与应用。

背景技术

拟穴青蟹(Scylla paramamosain) ，简称青蟹，属广盐广温性的海水经济甲壳动物, 主要分布于我国东南沿海地区, 是粤东特别是汕头主要的海水养殖品种，具有生长快、个体大、适应性和抗病能力强、耐干露、易运输、肉味鲜美独特、营养丰富等特点, 颇受国内外生产者和消费者的青睐。近年来青蟹病害特别是病毒性病（如青蟹杆状病毒病，呼肠孤样病毒病）、细菌性病和寄生虫病等给我省乃至全国青蟹养殖业造成了严重的经济损失。如自2004年秋冬以来，广东青蟹养殖发生了前所未有的突发性病害，尤其是育肥过程中，膏蟹的死亡率在70 %以上。2005～2006年广东南水青蟹育肥死亡率在90 %以上。2006、2007年的病害仍然严重，发病情况和发病时间与前2年基本相同。4年来，仅汕头牛田洋围垦区群众青蟹养殖就减产了60％，估计每年经济损失达5000万元以上。汕头市青蟹养殖面积10万余亩；其中牛田洋围垦区3万多亩。青蟹病害发病迅速、范围广，主要爆发于每年的9-11月份。

一般认为，青蟹属甲壳类无脊椎动物，不具备特异性免疫系统，其免疫以非特异性免疫为主，故运用疫苗防治青蟹病害的可靠性和广泛性目前尚存在争论。迄今为止，国内外许多学者从青蟹病原、青蟹免疫防御机制和养殖环境等多方面进行了大量的研究和探索，在青蟹病害治疗方面取得了许多进展，但是这些研究很难从根本上解决青蟹的病害问题。因此，寻找“以防为主”的生态学防治方法，被认为是解决目前青蟹养殖疾病，提高青蟹品质的一条有效途径。

使用益生菌进行青蟹的生态健康养殖，是提高青蟹免疫力，预防青蟹病害特别是细菌性病害的有效途径之一。目前已有报道的水产益生茵有乳酸茵属、双歧杆菌属、弧茵属、假单胞茵属、芽孢杆菌、硝化茵、光合茵等。乳酸茵、芽孢杆菌、酵母茵等已作为饵料添加剂应用于水产动物，起到很好的防治疾病和增进健康的作用。为陆生生物设计的微生态制剂应用于水产养殖中，不一定能尽快成为优势菌而进行微生态调节，而且，这些微生物很容易随着时间而逐渐消亡。益生菌目前已应用在对虾、贝类及其他海洋水产养殖动物上，但是适用于虾贝的益生菌并不一定在青蟹养殖中起作用或作用效果不明显。开发针对青蟹的益生菌种，对青蟹高密度及健康生态养殖模式意义重大。

发明内容

本发明实施例所要解决的技术问题在于，提供一株粪肠球菌Y17及其筛选培养与应用解决现有技术存在的问题。

为了实现上述的目的，采用如下的技术方案：

一株粪肠球菌Y17 Enterococcus faecalis Y17，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为中国武汉大学，保藏日期为2016年5月5日，其保藏编号为CCTCC NO：M2016249，分类命名为粪肠球菌Y17 Enterococcus faecalis Y17。

进一步的，所述粪肠球菌Y17对绝大多数抗生素均没有耐受性；所述粪肠球菌Y17对副溶血弧菌有显著抑菌效果。嗜水气单胞菌、溶藻弧菌、金黄色葡萄球菌均有抑菌活性。具备一定的抗逆性、拮抗致病菌能力，无血细胞溶解性，安全性高，分泌卵黄卵磷脂酶及酸性物质（有机酸），革兰氏阳性，pH耐受性高，在pH=2时仍有17%的活菌率。对绝大多数抗生素无耐药性，经浸浴试验验证对宿主无害,经过养殖试验验证它还能够提高机体的免疫力。Y17对复方新诺明、丁胺卡那霉素、新霉素、麦迪霉素、多粘菌素B、头孢呋辛、庆大霉素、苯唑青霉素和头孢他啶耐受性高。

一种粪肠球菌Y17的筛选方法，主要包括以下步骤：

（1）在包含粪肠球菌Y17的剪碎的肠道加入含有无菌玻璃珠的0.85%NaCl中，置于摇床，28℃恒温2~4h，摇床转速为180rpm；

（2）取上清液涂布MRS 平板，于MRS液体培养基28℃恒温培养48h；

（3）摇菌液并保种，将保种菌液划线，待长出菌落后，用无菌牙签挑取单菌落，接种于已经涂布致病菌Vp的MRS平板，28℃恒温培养48h；

（4）重新划平板，分离纯化，加甘油后保种于-80℃。

MRS平板是乳酸菌专用筛选平板，和其他平板比更有利于乳酸菌的生长。无菌玻璃珠有利于肠道研磨得更充分，这样液体中的菌浓度更高，有利于筛选到更多有利微生物。重新划板有利于挑选活性更好的菌落，优化菌种。

进一步的，所述粪肠球菌Y17接种量为1%，pH 值为7.0。

一种粪肠球菌Y17在抑制副溶血弧菌生长中的用途。

一种粪肠球菌Y17在制备益生菌制剂中的用途。

一种益生菌制剂，含有上述的粪肠球菌Y17。

一种菌粉，采用上述粪肠球菌Y17制备的。

上述菌粉作为饲料添加剂的用途。

一种青蟹饲料，含有上述粪肠球菌Y17，所述粪肠球菌Y17的活菌数为1×10⁸ - 1×10⁹cfu/g。

与现有技术相比，本发明提供了一株粪肠球菌Y17，该粪肠球菌Y17对复方新诺明、丁胺卡那霉素、新霉素、麦迪霉素、多粘菌素B、头孢呋辛、庆大霉素、苯唑青霉素和头孢他啶具有较高的耐受性，对副溶血弧菌有显著抑菌效果，而且还能够提高机体的免疫力，其应用前景广泛，可以将其应用于益生菌制剂，也可以将其制成菌粉，作为饲料添加剂添加到饲料中，用来抑制动物体内致病菌生长，降低动物尤其是青蟹的死亡率，是一株值得开发的益生菌株。

附图说明

图1为本发明菌株Y17的扫描电镜照片；

图2为本发明菌株Y17的系统进化树；

图3为本发明菌株Y17对青蟹病原菌副溶血弧菌的抑菌效果图片；

图4为Y17对嗜水气单胞菌，溶藻弧菌，金黄色葡萄球菌牛津杯抑菌实验图；

图5为本发明菌株Y17在青蟹副溶血弧菌刺激时血液中ALF基因的表达情况；

图6为本发明菌株Y17在青蟹副溶血弧菌刺激时血液中CAT基因的表达情况；

图7为饲料中添加本发明菌株Y17接受副溶血弧菌刺激后3天内的累积成活率。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。

实施例

1、粪肠球菌Y17的分离筛选和鉴定。

菌株分离于养殖的拟穴青蟹肠道，养殖青蟹为病害爆发后幸存的“耐病蟹”。蒸馏水冲洗拟穴青蟹表面的污泥等杂物，酒精喷洒之后，于超净台下解剖并取肠道内容物，完成青蟹肠道内容物样品的采集。剪碎的肠道加入0.85%NaCl中，其中含有无菌玻璃珠，28℃，摇床转速180rpm，2~4h后，取上清液涂布MRS 平板，28℃恒温培养48h，后挑单菌落。摇菌液并保种，将保种菌液划线，待长出菌落后，用无菌牙签挑取单菌落，接种于已经涂布致病菌Vp的MRS平板，28℃恒温培养48h 后，选择其中具有抑菌活性的菌种进行牛津杯实验，挑选抑菌圈最大的几株菌，进行消化酶，溶血性检测，发现Y17效果最好且无溶血性，将其重新划平板，分离纯化，并加甘油后保种于-80℃。

为鉴定菌株，先采用扫描电镜观察细胞形态以及测试菌株的部分生理生化反应，扫描电镜图如图1所示，可以初步判断该菌株为粪肠球菌。

再通过16SrDNA序列分析，采用的引物为通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') 和1492R(5'-TACCTTGTTACGACTT-3')进行PCR，克隆并测序。NCBI网站中Blast比对发现，该菌株与Enterococcus faecalis ATCC19433同源性最高（99.97%），确定为Enterococcus faecalis Y17（以下简称Y17）。其系统进化树如图2所示。

2、菌株的抑菌试验。

抑菌实验：将菌株用MRS培养基培养，采用牛津杯法，检测对拟穴青蟹养殖的常见弧菌的抗菌效果。按照抑菌圈的大小评估其抑菌效果。如图3所示，Y17对副溶血弧菌有抑菌效果。

粪肠球菌Y17对嗜水气单胞菌、溶藻弧菌、金黄色葡萄球菌进行牛津杯抑菌实验，实验结果如图4所示，Y17对嗜水气单胞菌、溶藻弧菌、金黄色葡萄球菌均有抑菌活性。

药敏性试验：所选的抗生素包含阿莫西林、青霉素、四环素、奥格门汀、恩诺沙星、万古霉素、头孢唑啉、米洛环素、多粘菌素B、头孢苄氨、新霉素、复方新诺明、氯霉素、头孢他啶、丁胺卡那霉素、头孢呋辛、麦迪霉素、氨苄西林、庆大霉素、红霉素、苯唑西林。实验发现Y17对复方新诺明、丁胺卡那霉素、新霉素、麦迪霉素、多粘菌素B、头孢呋辛、庆大霉素、苯唑青霉素和对头孢他啶耐受性高。

3、饲料中添加Y17饲养幼蟹实验。

青蟹养殖选用25±1g的幼蟹240只，暂养一段时间后，将青蟹分为三类（一类为喂养添加粪肠球菌Y17 约1×10⁸ - 1×10⁹cfu/g的饲料，一类为添加粪肠球菌Y17和芽孢杆菌E8的饲料，另一类为无菌添加的饲料），每类设4组，每组20只幼蟹。分别饲喂饲料14天后，投喂添加了副溶血弧菌的饲料（浓度为1.99×10¹⁰ cfu/g；从牛田洋青蟹养殖区分离，本实验室保存）3天。（添加粪肠球菌Y17和芽孢杆菌E8的饲料组简称Y17+ E8）

1)利用实时荧光PCR(real time PCR)方法检测饲喂添加益生菌14天后受副溶血弧菌刺激的免疫应激情况，如图5和图6所示，发现Y17+ E8处理组免疫基因抗脂多糖因子(anti-lipopolysaccharide factor Precursor, ALF, FJ013272.1)、过氧化氢酶（catalase,CAT, FJ774660.1）的表达显著高于对照组。

2)记录3天内的死亡情况，结果如图7所示，与对照组（正常饲料组）相比，Y17+E8饲料的青蟹组的3天内的累积存活率高于对照组（比对照组高11.11%）。

上述结果显示，粪肠球菌Y17在拟穴青蟹的养殖中具有显著的益生效应，对青蟹养殖常见的副溶血弧菌预防效果显著，是一株值得开发的益生菌株。

以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

<120> 一株粪肠球菌Y17及其筛选培养与应用

<130> 2016

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1651

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggaggtacga cgccagtgat tcgagctcgg tacccgggga tcctctagag attagagttt 60

gatcctggct caggacgaac gctggcggcg tgcctaatac atgcaagtcg aacgcttctt 120

tcctcccgag tgcttgcact caattggaaa gaggagtggc ggacgggtga gtaacacgtg 180

ggtaacctac ccatcagagg gggataacac ttggaaacag gtgctaatac cgcataacag 240

tttatgccgc atggcataag agtgaaaggc gctttcgggt gtcgctgatg gatggacccg 300

cggtgcatta gctagttggt gaggtaacgg ctcaccaagg ccacgatgca tagccgacct 360

gagagggtga tcggccacac tgggactgag acacggccca gactcctacg ggaggcagca 420

gtagggaatc ttcggcaatg gacgaaagtc tgaccgagca acgccgcgtg agtgaagaag 480

gttttcggat cgtaaaactc tgttgttaga gaagaacaag gacgttagta actgaacgtc 540

ccctgacggt atctaaccag aaagccacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac 600

gtaggtggca agcgttgtcc ggatttattg ggcgtaaagc gagcgcaggc ggtttcttaa 660

gtctgatgtg aaagcccccg gctcaaccgg ggagggtcat tggaaactgg gagacttgag 720

tgcagaagag gagagtggaa ttccatgtgt agcggtgaaa tgcgtagata tatggaggaa 780

caccagtggc gaaggcggct ctctggtctg taactgacgc tgaggctcga aagcgtgggg 840

agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgagtgc taagtgttgg 900

agggtttccg cccttcagtg ctgcagcaaa cgcattaagc actccgcctg gggagtacga 960

ccgcaaggtt gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt 1020

ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac atcctttgac cactctagag 1080

atagagcttt cccttcgggg acaaagtgac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt 1140

cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tattgttagt tgccatcatt 1200

tagttgggca ctctagcgag actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca 1260

aatcatcatg ccccttatga cctgggctac acacgtgcta caatgggaag tacaacgagt 1320

cgctagaccg cgaggtcatg caaatctctt aaagcttctc tcagttcgga ttgcaggctg 1380

caactcgcct gcatgaagcc ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcacgc cgcggtgaat 1440

acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccacga gagtttgtaa cacccgaagt 1500

cggtgaggta acctttttgg agccagccgc ctaaggtggg atagatgatt ggggtgaagt 1560

cgtaacaagg tagccgtatc ggaaggtgcg gctggatcac ctccttaatc gtcgacctgc 1620

aggcatgcaa gctggcgtaa tcatgtcacg c 1651

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

taccttgtta cgactt 16

Claims

1.一株粪肠球菌Y17，其特征在于，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2016249。

2.在根据权利要求1所述粪肠球菌Y17，其特征在于，所述粪肠球菌Y17对副溶血弧菌、嗜水气单胞菌、溶藻弧菌、金黄色葡萄球菌均有抑菌活性；具备一定的抗逆性、拮抗致病菌能力，无血细胞溶解性，革兰氏阳性，pH耐受性高；所述粪肠球菌Y17分泌卵黄卵磷脂酶及酸性物质，对宿主无害，还能够提高机体的免疫力。

3.根据权利要求1所述粪肠球菌Y17的筛选培养方法，其特征在于，主要包括以下步骤：

（4）重新划平板，分离纯化，加甘油后保种于-80℃。

4.根据权利要求3所述筛选培养方法，其特征在于，所述粪肠球菌Y17的接种量为1%，初始pH 值为7.0。

5.根据权利要求1 所述粪肠球菌Y17在抑制副溶血弧菌生长的用途。

6.根据权利要求1 所述粪肠球菌Y17在制备益生菌制剂的用途。

7.一种益生菌制剂，其特征在于，所述益生菌制剂含有如权利要求1 所述粪肠球菌Y17。

8.一种菌粉，其特征在于，所述菌粉是采用如权利要求1 所述粪肠球菌Y17制备的。

9.根据权利要求8所述的菌粉作为饲料添加剂的用途。

10.一种青蟹饲料，其特征在于，所述青蟹饲料含有如权利要求1 所述粪肠球菌Y17，所述粪肠球菌Y17的活菌数为1×10⁸ - 1×10⁹cfu/g。