CN116042453B - 耐高温高效降解聚乙烯塑料的苍白空气芽孢杆菌m及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物及堆肥领域，具体是涉及一株耐高温高效降解聚乙烯塑料的苍白空气芽孢杆菌及其应用。本发明从粪污中筛选到一株能够耐受50℃且高效降解聚乙烯塑料的苍白空气芽孢杆菌(Aeribacillus composti)，该菌属于噬热菌，可以用于生物降解聚乙烯塑料。在堆肥试验中加入苍白空气芽孢杆菌M，傅里叶红外光谱结果表明聚乙烯塑料含氧官能团显著增加，且在扫描电镜下观察到聚乙烯塑料表面有明显的微生物侵蚀孔洞。本发明为聚乙烯塑料的生物降解提供了新资源，对于保护生态环境、人体的健康具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及微生物及堆肥领域，具体涉及一株耐高温高效降解聚乙烯塑料的苍白空气芽孢杆菌M及应用。
背景技术
塑料具有较好的热电性能、机械性能和冲击性能，已经广泛应用到了养殖场，例如塑料袋、运输饲料的管道以及储存消毒剂或抗生素的塑料瓶等。其中，塑料制品中产量和用量占比最高的是聚乙烯塑料，而聚乙烯塑料在自然条件下的降解速度非常缓慢。通常情况下，大型塑料受光催化、机械破碎以及生物降解等环境影响，易破碎成微小的塑料进入畜禽养殖的各个环节，最终通过饲料、空气进入畜禽体内并随粪便排出。最新研究表明，猪粪、鸡粪和牛粪中塑料的丰度分别为9.02×102±1.29×103、6.67×102±9.90×102、7.40×101±1.29×102个/千克。
当前，我国对于畜禽粪便的处理方式主要包括好氧堆肥、沼气生产和直接还田等。值得注意的是，在以上畜禽粪便的处理过程中并没有针对塑料的去除步骤，这也导致畜禽粪便中的塑料可能通过多种途径在土壤富集，最终对食物链、人体健康以及地球陆地生态系统造成威胁。
作为畜禽粪便无害化处理和资源化利用的重要手段，好氧堆肥在微生物的作用下将畜禽粪便转化为植物可利用的有机肥，促进了种养结合，实现了养殖业和种植业的可持续发展。然而，当前对于畜禽粪便堆肥中的聚乙烯塑料降解菌的筛选及应用研究相当匮乏。因此，针对畜禽粪便堆肥开发筛选相应的聚乙烯塑料降解菌，丰富微生物种质资源，将有助于推动畜禽养殖的可持续发展。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一株耐高温高效降解聚乙烯塑料的苍白空气芽孢杆菌M及应用。
为实现上述目的，本发明所设计一株耐高温高效降解聚乙烯塑料的苍白空气芽孢杆菌(Aeribacillus composti)M，其保藏编号为CCTCC NO：M2022349。
上述菌株筛选源于粪污，于50℃环境下以聚乙烯为唯一碳源的培养基中培养筛选，进而获得一株能够耐高温且利用聚乙烯为碳源的降解菌。经过16S rDNA比对，其与苍白空气芽孢杆菌(Aeribacillus composti)高度相似，因此命名为苍白空气芽孢杆菌M，所述菌株已于2022年3月30日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：苍白空气芽孢杆菌(Aeribacillus composti)M，保藏编号为CCTCC NO：M2022349，地址：中国武汉武汉大学，邮编：430072。
上述耐高温聚乙烯塑料高效降解菌的16S rDNA基因序列如SEQ ID NO:1所示。
经过革兰氏染色表明，其属于革兰氏阳性菌，杆状或柱状，菌落呈乳白色不透明，形状为圆形，表面光滑湿润，边缘整齐，轮廓清晰。可用LB培养基在50～60℃环境震荡培养制成菌液。
本发明还提供了一种上述苍白空气芽孢杆菌在降解聚乙烯塑料中的应用。
本发明还提供了一种上述苍白空气芽孢杆菌在堆肥中的应用。
本发明的有益效果：
1.本发明的菌株对聚乙烯塑料具有良好的降解效果，并且可以耐受50℃的高温。堆肥中添加本发明的菌株，可以提升堆肥温度的峰值，促进堆肥中聚乙烯塑料的降解，该降解绿色环保，成本低。
2.本发明为聚乙烯塑料的生物降解提供了新资源，对于保护生态环境、人体的身体健康具有重要意义。
附图说明
图1为聚乙烯降解菌M的菌落形态特征图；
图2为聚乙烯降解菌M的系统发育树。
图3为聚乙烯降解菌降解PE粉末后的失重率图。
图4为聚乙烯降解菌降解PE粉末后的OD600图。
图5为聚乙烯降解菌降解60天后聚乙烯塑料膜的水接触角变化图；
图中，A为对照组图；B为处理组图。
图6为堆肥运行过程的温度变化示意图；
图7为堆肥中聚乙烯塑料的红外光谱分析特征图；
图中，0d为堆肥第0天；CK40为对照组堆肥第40天；M40为处理组堆肥第40天；
图8为堆肥中聚乙烯塑料的扫描电子显微镜特征图；
图中，0d为堆肥第0天；CK40为对照组堆肥第40天；M40为处理组堆肥第40天)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。
实施例1耐高温聚乙烯降解菌的分离筛选和鉴定
1.把粪污作为待分离样品进行分离筛选
将采集到的粪污加入到无菌水中，放置于无菌的锥形瓶中，于恒温摇床中50℃、180r/min振荡培养2h，制备成菌悬液。将菌悬液以1％接种量(v/v)转接至无碳源矿物盐液体培养基中，加入已紫外灭菌的聚乙烯粉末(5g/L)，50℃、180r/min振荡培养10d，设置3个平行组。培养体系变浑浊后,取少量液体用稀释涂布平板法分离菌株，并多次划线纯化分离到的菌株。将分离到的单菌落菌株保存后，在无碳源矿物盐固体培养基上验证对聚乙烯的利用能力。无碳源固体平板表面涂布已灭菌的聚乙烯粉末，将获得的菌株在表面划线于50℃培养，挑选单菌落于LB平板上培养保存。
1L无碳源矿物盐液体培养基组成成分为：K2HPO4·3H2O 0.7g，KH2PO4 0.7g，NH4SO40.5g，NaNO3 0.5g，NaCl 0.5g，MgCl2 0.5g，1mL的微量元素液。1L微量元素的液组成成分为ZnSO4·7H2O 0.1g，CoCl2·6H2O 0.16g，CuSO4·5H2O 0.15g，MnSO4·H2O 0.1g，H3BO30.02g，NaMoO4·2H2O 0.02g，NiCl2·6H2O 0.05g，FeCl3·6H2O 0.16g。无碳源矿物盐培养基灭菌前用1mol/L NaOH调节pH至7.0，配置无碳源矿物盐固体培养基则需再加入1.5％的琼脂。
通过上述的分离与筛选工作，获得一株的耐高温(50℃)的聚乙烯塑料高效降解菌M。该降解菌在LB平板上菌落呈白色，形状为圆形，表面光滑湿润，边缘整齐(图1)。
2.菌株的分子生物学鉴定
使用细菌DNA基因组提取试剂盒提取M菌的DNA(购买于武汉三倍体生物科技有限公司)，采用细菌通用引物27F/1492R进行PCR扩增M菌的16S rDNA(由武汉擎科新业科技有限公司合成)。
引物序列：正向引物F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；反向引物R：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’。
PCR扩增反应体系：总体系50μL，包括1.1×T3 Super PCR Mix 44μL(购买于武汉擎科新业科技有限公司)，上下游引物各2μL，DNA模板2μL。PCR反应条件见表1。
表1 PCR反应条件
对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，委托武汉擎科新业科技有限公司测序。待测序结果返回后，将结果输入NCBI数据库进行BLAST序列比对，结果表明，该菌株与苍白空气芽孢杆菌(Aeribacillus composti)相似度达99％，并选取同源性相近的菌株，采用MEGA11软件构建系统发育树(图2)。
经过16S rDNA比对，其与苍白空气芽孢杆菌(Aeribacillus composti)高度相似，耐高温聚乙烯塑料高效降解菌的16S rDNA基因序列如SEQ ID NO:1所示：
因此命名为苍白空气芽孢杆菌M，所述菌株已于2022年3月30日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：苍白空气芽孢杆菌(Aeribacillus composti)M，保藏编号为CCTCC NO：M2022349，地址：中国武汉武汉大学，邮编：430072。
实施例2
耐高温聚乙烯降解菌对聚乙烯塑料粉末(30目)的降解实验按照以下步骤进行：
挑取单个M菌菌落，在LB培养基中培养至对数期。100ml锥形瓶中加入30ml无碳源矿物盐液体培养基，加入已在无菌洁净工作台上紫外灭菌3h聚乙烯塑料粉末(30目)0.5g，以3％(v/v)的接种量接种上述菌液，并以不接菌处理为对照组，每种处理设置3个平行。将锥形瓶放置于恒温摇床中50℃、150rpm/min培养，3天后观察聚乙烯塑料粉末的形态并称量聚乙烯塑料粉末的重量以及培养基OD600值。
培养3天后，聚乙烯塑料粉末的称重前按照下述流程处理：用2％SDS溶液振荡洗涤聚丙烯颗粒4h，再用无菌水洗涤粉末3次，将洗涤后的聚乙烯颗粒放置在干燥器中干燥48h后称重。
聚乙烯塑料粉末的失重率(％)＝(聚乙烯初始质量-降解后质量)/初始质量×100％
聚乙烯塑料粉末失重率结果见图3，培养基OD600值见图4，其中CK为不添加M菌的对照组，M为添加M菌的处理组。
从图3和图4中可以看到，添加M菌的处理组的失重率和OD600值显著高于不添加M菌对照组,表明M菌可以把聚乙烯塑料当作碳源，进而有效降解聚乙烯塑料。
实施例3
耐高温聚乙烯降解菌对聚乙烯塑料膜片的水接触角实验按照以下步骤进行：
将聚乙烯塑料膜剪成3×5cm的方片，准确称量后置于无菌50mL离心管中进行无菌处理，依次用2％ SDS、75％乙醇、95％乙醇分别浸泡4个小时及以上，期间旋涡振荡清洗30min，浸泡完毕后用无菌水冲洗3次，在超净工作台上用无菌滤纸吸去粘在塑料膜表面上的水分后，紫外灯照射灭菌15min。
挑M菌在LB培养基中培养12小时。试管中加入8ml无碳源矿物盐液体培养基，加入上述处理后的聚乙烯塑料膜，以10％(v/v)的接种量接种上述菌液，并以不接菌处理为对照组，每种处理设置3个平行。将试管放置于恒温摇床中50℃、150rpm/min培养，60天后用接触角测量仪测定接触角表征膜片表面疏水性变化。
由图5可见，经接触角测量仪结果显示，接菌处理的聚乙烯塑料水接触角为53.8±1.3°，远低于对照处理的75.5±2.4°，表明接菌处理显著降低了聚乙烯塑料的疏水性，更容易被微生物附着侵蚀。
实施例4
苍白空气芽孢杆菌M对堆肥中聚乙烯塑料(30目)的降解试验：
取1400g已经粉碎的玉米秸秆(1cm筛)，加入新鲜猪粪6500g，41g聚乙烯塑料(30目)，对照组(CK组)不添加任何菌剂，处理组(M组)加入苍白空气芽孢杆菌M，调节含水率在60％左右，充分混匀。CK组和M组均设置三个重复。
堆肥持续时间为40d，在第5、10、20天进行翻堆。
堆体温度变化如图6所示，CK组和M组温度都是先升高后降低的趋势，CK组温度在第2天达到峰值63.33℃，而CK组在第2天达到峰值66.16℃，这说明接种M菌可以提高猪粪堆肥过程中的堆体的最高温度。
提取第0天和第40天堆体中的聚乙烯塑料，进行后续实验。
为了知晓聚乙烯塑料官能团的变化，取上述清洗干净的聚乙烯塑料使用压片法测定傅里叶红外光谱，扫描波长范围为500-4000cm-1。如图7所示，经过40天的堆肥，40d的聚乙烯塑料相较于0d的聚乙烯塑料引入了不稳定的含氧官能团，如1081cm-1处的醚键(C-O-C)，1715cm-1处的羰基(-C＝O)和3435cm-1处的醇羟基(C-OH)，且在堆肥中加入苍白空气芽孢杆菌M更是显著增加了这些含氧官能团的丰度，说明添加苍白空气芽孢杆菌M可以促进堆肥中聚乙烯塑料的降解。
将清洗干净的聚乙烯塑料干燥，固定喷金后在扫描电子显微镜(SEM)下观察其微观形貌特征，结果图8所示，经过40d的堆肥，在扫描电镜下观察到M组的聚乙烯塑料与CK组相比表面更加粗糙，出现更加明显的微生物侵蚀孔洞，进一步说明添加苍白空气芽孢杆菌M可以促进堆肥中聚乙烯塑料的降解。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (3)
1.一株耐高温高效降解聚乙烯塑料的苍白空气芽孢杆菌(Aeribacillus composti)M，其保藏编号为CCTCC NO：M2022349。
2.一种权利要求1所述苍白空气芽孢杆菌在降解聚乙烯塑料中的应用。
3.一种权利要求1所述苍白空气芽孢杆菌在降解堆肥中聚乙烯塑料中的应用。
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