CN114958676B - 一种基于芽孢杆菌发酵产物的抗菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种芽孢杆菌发酵产物的制备方法及应用。制备方法为：S1：制备菌株的液体制剂；爆气自来水或者井水100Kg+芽孢1Kg（枯草芽孢杆菌CK3 500g+凝结芽孢杆菌500g）+红糖5kg+氮肥（尿素）200g，温度在26℃‑35℃，每天需搅拌一次，容器不密封，培养72小时以上；S2：细菌上清液粉剂制备：将菌株的液体制剂混合均匀，放入离心机5000 rpm 30 min；将离心完成后的上清收集放入1000 Da的透析袋中，于冰水浴中透析24 h，每6小时更新一次外围冰水；透析完成后的液体在超低温冰箱预冷后，放入冷冻干燥机10pa ‑60℃冻干成粉末。本发明的发酵产物的抗菌抑菌作用显著，可作为抗生素的替代品和保健类应用于水产养殖病害防控中。
Description
技术领域
本发明属于微生态制剂技术领域，更具体地，涉及一种基于芽孢杆菌发酵产物的抗菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
细菌性疾病一直是制约水产养殖业发展的重要因素。细菌性疾病不仅会造成水产动物的大量死亡，还会诱导病毒性疾病的爆发，导致大规模水产动物疫病，给水产养殖业带来巨大的威胁。因此，控制水产养殖环境中病原菌的数量，对于水产动物疫病防控具有重要的意义。目前，针对水产病原菌的控菌方法主要使用化学消毒剂和抗生素。化学消毒剂虽然控菌效率高，但是有效成分易降解、控菌时效短，会造成病菌的反弹，过量使用对养殖对象有急性毒性效应。而抗生素的滥用会导致多种病原菌产生耐药性，同时在水生动物、水体中药物残留的毒副作用给食品安全、养殖环境以及自然生态环境都带来巨大威胁。因此，开发研究新型的水产养殖控菌手段和技术方法，对于水产动物病害防控具有十分重要的作用。微生态制剂是近年来国内外迅速崛起的一类新型微生物添加剂，具有调节肠道菌群平衡、拮抗病原菌、促进动物生长、提高饲料转化率和增强机体免疫功能等优点，已被广泛应用于畜、禽、渔养殖业和饲料业，亦成为了抗生素的理想替代品。
发明内容
芽孢杆菌是一类革兰氏阳性菌，被认为是水产动物中的益生菌，在健康养殖过程中发挥着重要的作用。随着人们对芽孢杆菌产生的活性代谢产物不断地深入研究，发现了大量各种类型的抗菌物质，主要包括脂肽类抗菌物质，多肽类抗菌物质，酚类、氨基糖苷类化合物、异构香豆素类化合物等抗菌物质。这些抗菌物质在能够杀菌的同时，又不破坏动物体内的正常细胞，对人体安全，在生物医药方面具有重要的应用价值。因此，开发有效的芽孢杆菌抗菌制剂对于水产养殖中细菌性病害的防控具有重要的意义。
本发明提供了芽孢杆菌CK3和凝结芽孢杆菌发酵产物制剂，以解决畜禽生产过程中过量使用抗生素而导致的畜禽肠道内微生物菌群失衡、疾病增加、药物残留技术问题，同时本发明又增加了微生态制剂的种类，解决了药物残留所带来的食品安全问题。
为了实现上述目的，根据本申请的一个方面，提供了一种基于芽孢杆菌发酵产物的抗菌剂及其制备方法。该发酵产物的制备方法包括：以枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌发酵液为原料，经过透析、干燥、粉碎制备而成；
本发明的技术方案如下：
第一方面，提供一种芽孢杆菌发酵产物的制备方法，包括：
将芽孢杆菌菌种接种于扩大发酵培养基中，温度在26℃-35℃，每天搅拌1~2次，有氧发酵培养72小时以上使菌体数量在109cfu/mL以上；离心收集发酵上清液，并在截留分子量为1000Da的透析袋中进行透析，真空冷冻干燥即得；
所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌CK3 和凝结芽孢杆菌的混合物，其中枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，采用枯草芽孢杆菌CMCC（B）63501，来源为购买于沪震生物科技有限公司，货号HZ0098的甘油菌产品；凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans，采用凝结芽孢杆菌NBRC12714，来源为购买于上海瑞楚生物科技有限公司，产品名称：凝结芽孢杆菌,SHBCCD10861,NBRC12714货号527161267921的冻干粉产品。
在一些实施例中，所述枯草芽孢杆菌CK3 和凝结芽孢杆菌菌种接种的质量比例1:1。
在一些实施例中，扩大发酵培养基组分为：食用红糖50 g/L，尿素2g/L，溶于蒸馏水中，并在120-122℃下高压灭菌18-22min，接种枯草芽孢杆菌：凝结芽孢杆菌=1：1；
每1kg芽孢杆菌，采用的扩大发酵培养基的组成为：食用红糖5 kg、尿素200 g溶于无菌水100 kg中，灭菌即得。
在一些实施例中，离心为 4000-6000 rpm 转速下离心10-30 min。
在一些实施例中，透析为采用无菌的PBS溶液为透析液，4℃下透析24h；
在一些实施例中，真空冷冻干燥为在10pa、 -60℃条件下冷冻干燥成粉末。
第二方面，提供一种芽孢杆菌发酵产物，通过所述的制备方法制备得到。
第三方面，提供所述的芽孢杆菌发酵产物用于制备抑制细菌制剂的应用。
在一些实施例中，所述细菌包括大肠杆菌、维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌、金黄色葡萄球菌、克雷伯氏菌、霍乱弧菌。
将实验室保种的菌样包括枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌在灭菌的300 mL LB培养基中进行扩大培养，30℃下150 rpm培养12 h。然后6000 rpm转离心10min收集菌体，作为进一步扩大培养的菌株。制备扩大发酵培养基。将枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌菌种接种于培养基中，温度控制在35℃，每天搅拌1~2次，在培养基中充气发酵，培养72h以上。离心收集发酵上清液，并在截留分子量在1000Da的透析袋中进行透析，放入超低温冰箱预冷，进行真空冷冻干燥，在10pa -60℃下冻干成粉状，并用于杀菌活性鉴定。
进一步的，扩大发酵培养基组分是：无菌水100 kg, 食用红糖5 kg，尿素200 g。
在一些实施例中，所述的芽孢杆菌发酵产物的制备方法，包括：
S1：制备菌株的液体制剂；爆气自来水或者井水100Kg+芽孢1Kg（枯草芽孢杆菌CK3500g+凝结芽孢杆菌500g）+红糖5kg+氮肥（尿素）200，温度在26℃-35℃，每天需搅拌一次，容器不密封，培养72小时以上；
S2：细菌上清液粉剂制备：将菌株的液体制剂混合均匀，放入离心机 5000 rpm 30min；将离心完成后的上清收集放入1000 da 的透析袋中，于冰水浴中透析24h，每6小时更新一次外围冰水；透析完成后的液体在超低温冰箱预冷后，放入冷冻干燥机10pa -60℃冻干成粉末。
进一步的，杀菌活性鉴定步骤为：通过牛津杯法测定杀菌活性，将冻干后的干粉溶于水，制备浓度为0.1g/mL的母液。将待检测细菌，包括大肠杆菌Escherichia coli，维氏气单胞菌Aeromonas veronii，嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila，金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus，克雷伯氏菌Klebsiella Trevisan，霍乱弧菌Vibrio cholerae，过夜培养，然后涂布在LB固体培养基上。将直径约1cm的牛津杯放在培养基上，分别加入等体积的PBS，发酵液上清，冷冻干燥浓缩液。在恒温培养箱中过夜培养，然后记录观察抑菌圈大小。
本发明的第一个目的是提供一种混合芽孢杆菌发酵培养的方法；
本发明的第二个目的是利用发酵培养产物制备抗菌物质的方法；
本发明的第三个目的是提供该发酵产物抗菌活性测定结果。
本发明的发酵产物的抗菌抑菌作用显著，可作为抗生素的替代品和保健类应用于水产养殖病害防控中。
附图说明
图1，本发明实施例的芽孢杆菌发酵产物冻干后成品。
图2，本发明实施例的复合芽孢杆菌发酵产物对多种细菌的杀灭效果，其中1是PBS对照，4是发酵物冻干粉，5是冻干粉溶液稀释10倍，3是冻干粉溶液稀释100倍，2是冻干粉溶液稀释1000倍。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
出于本说明书和所附权利要求书的目的，除非另有陈述，否则所有表达量、百分数或比例的数字及本说明书和所附权利要求书中所用的其它数值被理解为在所有情况下都由术语“约”修饰。此外，本文公开的所有范围都包括端点在内且可独立组合。
芽孢杆菌混合菌株扩大培养
将实验室保种的菌样包括枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌在灭菌的300 mL LB培养基中进行扩大培养，30℃下150 rpm培养12 h。然后6000 rpm转离心10min收集菌体，作为进一步扩大培养的菌株。制备扩大发酵培养基。将枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌菌种接种于培养基中，温度控制在35℃，每天搅拌1~2次，在培养基中有氧发酵，培养72h以上，保证菌体数量在109cfu/mL以上。
芽孢杆菌发酵液抗菌物质制备
发酵结束后，收集发酵上清液，5000 rpm，离心10 min。将上清液放入截留分子量1000Da的透析袋中进行透析，透析液为无菌的PBS溶液。在4℃下，透析24h。收集透析好的发酵液，并放入超低温冰箱中-80℃，快速冷冻。然后将冷冻好的发酵液，放入真空冷冻干燥机中，进行冷冻干燥浓缩，10pa，-60℃条件下冷冻干燥48h以上，最终制备成粉状物质。
芽孢杆菌发酵液抗菌物质杀菌活性测定
杀菌活性的测定通过牛津杯的方法，具体的将待检测细菌，包括大肠杆菌E. coli，维氏气单胞菌A. veronii，嗜水气单胞菌A. hydrophila，金黄色葡萄球菌S. aureus，克雷伯氏菌K. Trevisan，霍乱弧菌V. cholerae，过夜培养，然后涂布在LB固体培养基上。将冻干后的干粉溶于水，制备浓度为0.1g/mL的母液。将直径约1cm的牛津杯放在培养基上，分别加入等体积的PBS，发酵液上清，冷冻干燥浓缩液。在恒温培养箱中过夜培养，然后记录观察抑菌圈大小。
真空冻干后的发酵物质为粉状，结果如图1所示。通过牛津杯法检测了其对不同细菌的杀灭活性，结果如图2所示。冻干粉溶液（10 mg/mL）对所选的6种细菌均有明显的抑菌圈，表现出显著的杀菌活性。在其稀释10倍后，浓度达到1mg/mL左右时，依然表现出较好的杀菌活性。而其稀释1000倍后，除了对嗜水气单胞菌A. hydrophila有显著杀菌活性外，对其他细菌无明显杀灭效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种芽孢杆菌发酵产物的制备方法，其特征在于，包括：
将芽孢杆菌菌种接种于扩大发酵培养基中，温度在26℃-35℃，有氧发酵培养72小时以上使菌体数量在109cfu/mL以上；离心收集发酵上清液，并在截留分子量为1000Da的透析袋中进行透析，真空冷冻干燥即得；其中扩大发酵培养基组分为：食用红糖50 g/L，尿素2g/L，溶于蒸馏水中；
所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌的混合物，其中所述枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，采用枯草芽孢杆菌 CMCC(B) 63501；所述凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans，采用凝结芽孢杆菌NBRC12714。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌CK3 和凝结芽孢杆菌菌种接种的质量比例1:1。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，每1kg芽孢杆菌，采用的扩大发酵培养基的组成为：食用红糖5 kg、尿素200 g溶于无菌水100 kg中，灭菌即得。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，离心为 4000-6000 rpm 转速下离心10-30 min。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，透析为采用无菌的PBS溶液为透析液，4℃下透析24h。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，真空冷冻干燥为在10pa、 -60℃条件下冷冻干燥成粉末。
7.通过权利要求1-6任一项所述的制备方法制备得到的芽孢杆菌发酵产物用于制备抑制细菌制剂的应用；所述细菌为大肠杆菌、维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌、金黄色葡萄球菌、克雷伯氏菌、霍乱弧菌。
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