CN104059869B - 一株海洋解淀粉芽孢杆菌及其培养方法和应用 - Google Patents
一株海洋解淀粉芽孢杆菌及其培养方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104059869B CN104059869B CN201410281747.9A CN201410281747A CN104059869B CN 104059869 B CN104059869 B CN 104059869B CN 201410281747 A CN201410281747 A CN 201410281747A CN 104059869 B CN104059869 B CN 104059869B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- extract
- tunning
- fermentation
- vibrio anguillarum
- liquid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Abstract
本发明公开了一株海洋解淀粉芽孢杆菌及其培养方法和应用。海洋解淀粉芽孢杆菌B5(Bacillus amyloliquefaciens strain chenj-5)，分离自连云港海域的海泥海水，海带，浒苔，裙带菜，龙须菜，紫菜。现保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期2014年5月27日，保藏号：CCTCCNO:M2014229该菌株基因序列已于2012年1月8号登记在NCBI中，登记号：JN859130.1。该菌对水产病害菌鳗弧菌Vibrio anguillarum有较强的拮抗作用。该细菌发酵后的发酵产物及发酵液提取物和菌体提取物对鳗弧菌均具有显著抑菌特性。该海洋细菌对鳗弧菌拮抗特性使该海洋细菌可以制作为水产养殖益生菌剂及生物饲料添加剂。该细菌发酵产物抑制鳗弧菌特性使该菌发酵产物及发酵产物提取物可用于制备防治鳗弧菌病害药物，该细菌发酵产物具有较高的热耐受性。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，本发明涉及一种鳗弧菌拮抗菌新菌株的分离方法特别是一种海洋解淀粉芽孢杆菌B5的分离方法本发明还涉及前述分离方法得到的海洋解淀粉芽孢杆菌B5及其发酵产物的应用。
背景技术
弧菌是引起水产养殖鱼类细菌性疾病的最重要一类病原菌。由弧菌引起的疾病,流行面积广,发病率高,给养殖业造成了巨大危害,长期以来是水产领域研究的一大热点。
鳗弧菌可以侵染大多数鱼类,是对水产养殖危害最大的弧菌,也是被研究和报道最多的弧菌。早在1718年就有了关于鳗鲡感染弧菌病的文字记载,而且意大利西北沿海地区养殖的鳗鲡在1790年就因弧菌病的暴发性流行而导致36t鳗鲡在不到1个月的时间内全部死亡。鳗弧菌是引起水产养殖动物败血症的重要病原之一，由其引起的弧菌病是我国水产养殖鱼类的主要疾病，感染的养殖品种涉及大菱鲆、牙鲆、半滑舌鳎、鲈鱼、美国红鱼、鳗鲡、大西洋鲑等50多种重要养殖品种，大多数海水养殖鱼类都容易被该菌感染,英国就曾报道过：野生鳗鲡因感染了鳗弧菌大量死亡的事例。感染鳗弧菌后的病鱼主要出现出血性败血症、体表肿胀、发炎等症状。引起我国养殖鱼类产业的重大经济损失。
为了控制和预防水产病害的流行爆发，长期以来水产病害控制主要依靠各种农药、抗生素、喹诺酮类、磺胺类、呋喃类等化学药物及各种消毒剂。这些化学药物和抗生素盲目使用，虽然在一定程度上可快速抑制或杀死病原菌，有效地控制疾病的发生和蔓延，提高水产养殖动物的生存率。但药物防治存在的弊端也越来越明显，产生了很多负面效应：抗药性病原株的产生，抗生素及化学药物使用量逐渐加大，水产品中药物残留危及食品安全，抗药性病菌菌株质粒转移到人类病原菌中，增加人类疾病治疗的困难程度，给人类健康带来了巨大威胁。基于这些负面效应人们开始寻找绿色安全抗生素和化学药物的替代品用于水产动物疾病的防治。
随着微生物学研究技术的发展,世界各国对海水养殖动物弧菌病防治的研究越来越多，而利用益生菌的拮抗作用来防治弧菌病的研究更是一大热点。但利用海洋解淀粉芽孢杆菌或其发酵产物或提取物应用于水产病害防治，特别是应用于鳗弧菌病害防治及药物开发国内外未见相关的专利、文献报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种来自海洋解淀粉芽孢杆菌B5或其发酵产物或提取物应用于水产病害抗菌与防治，特别是应用于鳗弧菌病害防治及药物的用途。本发明所要解决的另一技术问题是提供了海洋解淀粉芽孢杆菌B5的分离方法。为了寻找新的鳗弧菌拮抗微生物及新型鳗弧菌抑制剂，本申请的发明人从江苏连云港海域分离海洋微生物并制取其发酵产物，然后对获得的发酵产物的鳗弧菌拮抗及抑制活性进行了研究。
本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明公开了海洋解淀粉芽孢杆菌B5对水产致病菌鳗弧菌的拮抗与防病用途，所述鳗弧菌为Vibrioanguillarum保藏于中国典型培养物保藏中心菌种编号：CCTCCM203069。
本发明中涉及的海洋解淀粉芽孢杆菌B5的分离方法步骤如下：
⑴样品的采集与富集在连云港海域用无菌采样袋及无菌采样工具采集海水，海泥，海带，浒苔，裙带菜，龙须菜，紫菜样品。注明样品名称、采集日期以及采集地点。
⑵样品进行如下处理：海水样品采集来的海水混匀取10mL加入到装有100mL无菌海水TSB液体富集培养基的500ml三角瓶中28℃、180r/min的条件下摇床富集培养2d。海泥样品采集来的海泥混匀采用五点法采样再混匀，取10g海泥放入事先灭好菌的装有100ml海水TSB液体富集培养基的500ml三角瓶中28℃、180r/min的条件下摇床富集培养2d。海带样品用无菌海水冲洗海带样品3次后，放入无菌组织捣碎机中破碎至糊状，取10g浒苔破碎物加入到装有100mL无菌海水TSB液体富集培养基的500ml三角瓶中28℃、180r/min的条件下摇床富集培养2d。浒苔，裙带菜，龙须菜，紫菜样品处理同海带样品处理。
⑶海洋细菌的分离及纯化分别取1mL上述样品富集培养物的清液放入盛有9mL无菌海水的试管中进行梯度稀释取10-4、10-5、10-6稀释度样品0.1mL涂布到直径9cm的海水TSB固体分离培养基平板上，28℃倒置培养2d，每个稀释梯度重复3次观察并挑取形态、颜色不同的菌落采用三区划线方法进行纯化得到若干海洋细菌纯菌株。
⑷鳗弧菌拮抗菌分离、筛选，将鳗弧菌在无菌条件下，挑取2-3环菌体接种到装有100mL无菌海水TSB液体培养基的500ml三角瓶中28℃、180r/min的条件下摇床培养18小时，获得鳗弧菌种子液。取0.1ml上述鳗弧菌种子液涂布到海水TSB固体平板上，在上述每只平板上均匀点种⑶中获得的一株海洋细菌，在28℃条件下进行共培养36小时，观察并测量抑菌圈大小，筛选出对鳗弧菌具有拮抗效果的海洋细菌。
结果获得了一株海洋细菌B5。该海洋细菌B5是发明人从中国江苏连云港海域的海底沉积物中分离到的一株细菌，对鳗弧菌具有较强的拮抗特性。
上述的海洋细菌B5的生物学形态描述为：在海水TSB培养基上，菌落形态：圆形突起，边缘不整齐，白色，干涩无光泽，该菌株菌体形态：杆状，两端钝圆，革兰氏染色阳性，芽孢中生，椭圆形，周生鞭毛，大小为(0.5～0.8)×(1.5.～4.5)μm。如图1，图2，图3所示。
上述的海洋细菌B5的生理生化指标：生理生化试验结果表明，菌株B5的生理生化试验结果与文献的有关海洋解淀粉芽孢杆菌特征一致，能利用葡萄糖、蔗糖、半乳糖、甘露糖、甘露醇，不利用果糖、乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、肌醇，氧化酶反应、硝酸盐还原试验、淀粉水解试验、明胶液化，v-p实验和2％氯化钠生长试验为阳性，吲哚反应、MR试验和脱羧酶试验为阴性。如表1。
表1海洋解淀粉芽孢杆菌B5的生理生化指标
注“-”表示阴性，“+”表示阳性
根据形态学观察结果和生理生化特性，查阅《伯杰氏细菌鉴定手册》第八版等相关文献，初步认为海洋细菌B5属于芽孢杆菌属。
上述的海洋细菌B5的基因学鉴定为：
⑴海洋细菌B5的16SrDNA测序
应用细菌16SrDNA基因通用引物,正向引物为(ALF165312)：5'-GAGAGTTTGATCCTGGCT-3'，反向引物：(ALF165313)：5'-CGGCTACCTTGTTACGAC-3'，扩增海洋细菌B5的16SrDNA序列，经扩增产物测序得到海洋细菌B5大小为1381bp的基因片段，其序列已在GenBank中登记，登记号为JN051504.1。经与GenBank数据库中报道的16SrDNA核苷酸序列比对，序列同源性非常高的100个序列中，菌株chenj-5的16SrDNA核苷酸序列与Bacillusamyloliquefaciens、Bacillussubtilis，Bacillusvallismortis的16SrDNA序列相似度在99％以上，无法准确区分。见图4，图5。
⑵海洋细菌B5的gyrB基因PCR扩增与测序
应用gyrB基因引物(-gyrBprimers：)
UP-1S(5-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA-3)，
UP-2Sr(5-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCC-3)，扩增海洋细菌B5的16SrDNA序列，经扩增产物测序得到海洋细菌B5大小为1165bp的基因片段，其序列已在GenBank中登记，登记号为JN859130.1。
用Blast在线程序进行同源比较,结果表明,所测得序列与数据库中Bacillusamyloliquefaciens来源的DNAgyrasesubunitB基因序列的一致性很高最高达99％。见序列表SEQIDNO.2，图6。
根据菌株的形态特征和基因学特征的分析以及系统发育分析，鉴定海洋细菌B5为解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)。
本发明所述的的海洋解淀粉芽孢杆海洋解淀粉芽孢杆菌B5(Bacillusamyloliquefaciensstrainchenj-5)已于2014年5月27日保藏在中国典型培养物保藏中心(其简称CCTCC)，保藏号：CCTCCM2014229该菌株基因序列已于2012年1月8号登记在NCBI中，登记号：JN859130.1。
本发明中涉及的海洋解淀粉芽孢杆菌B5发酵产物及提取物及极性段提取物对鳗弧菌独特抑制特性研究通过以下方式实现。
前述海洋解淀粉芽孢杆菌B5(Bacillusamyloliquefaciensstrainchenj-5)，其发酵产物、发酵产物的提取物经检测发现均具有较强的鳗弧菌抑制活性，并且其发酵产物及发酵产物的提取物的热稳定性高，发酵产物及提取物经121℃保温1小时，其抑制鳗弧菌活性不受影响。发酵产物的提取物包括：发酵液提取物、菌体提取物、极性段提取物。经检测发现这三种提取物均具有对鳗弧菌抑制活性的特性。
发酵产物：海洋解淀粉芽孢杆菌B5经菌种活化，制作种子液，按2％接种量接种于装有无菌30L海水TSB发酵培养基的50L发酵罐中，在28℃、150r/min、通气量1.2vvm条件下发酵培养36小时后获得海洋解淀粉芽孢杆菌B5发酵产物。
发酵液浓缩物：发酵产物经管式离心机离心固液分离，得到发酵液和菌体；将发酵液减压浓缩至原体积的五分之一后得到发酵液浓缩物。
菌体提取物：发酵产物经管式离心机离心固液分离，得到发酵液和菌体；菌体在真空干燥箱中4小时内直线程序升温(30℃-50℃)干燥，得干燥的菌体；干燥的菌体按1∶20(W/V)加入甲醇萃取3次，合并甲醇提取液，减压蒸馏干燥得到菌体提取物。
极性段提取物：将前述的发酵液浓缩物采用液-液分配萃取法依次用石油醚或氯仿或乙酸乙酯或正丁醇按照1∶1比例萃取得到极性段提取物，极性段提取物为石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物或水提取物。
前述获得海洋解淀粉芽孢杆菌B5菌株的发酵产物的发酵方法包括：菌种活化过程、种子液制备过程和发酵培养过程。
菌种活化过程：取所述保藏菌种，采用划线法接种于海水TSB固体斜面培养基上，培养得到菌株B5固体斜面培养物，培养温度为28℃，培养时间18小时。
种子液制备过程：将上述海洋解淀粉芽孢杆菌B5固体斜面培养物在无菌条件下，挑取2-3环菌体接种到装有100mL无菌海水TSB液体培养基的500ml三角瓶中28℃、180r/min的条件下摇床培养18小时，获得海洋解淀粉芽孢杆菌B5种子液。发酵培养过程：在通气搅拌式发酵罐内加入海水TSB液体发酵培养基，灭菌后接入种子液搅拌发酵，获得发酵产物。其中，灭菌的方法为：在121℃下维持15min；利用无菌海水调整种子液的浓度至2.0*107cfu/ml种子液的接入按接种量2％接入；搅拌发酵环境参数为：通气量1.2vvm，温度为28℃，搅拌速度为每分钟150转；发酵时间为：36小时。
所述的海水TSB固体斜面培养基的配置方法为：称取胰蛋白胨17g，大豆蛋白胨3g，磷酸氢二钾2.5g，葡萄糖2.5g，5g琼脂粉利用陈海水加热搅拌溶解后，加陈海水定容至1000ml，利用NaOH调整PH＝7.2—7.5，再在121℃条件下灭菌15min后获得海水TSB固体斜面培养基。
所述的海水TSB液体发酵培养基的配置方法为：称取胰蛋白胨17g，大豆蛋白胨3g，磷酸氢二钾2.5g，葡萄糖2.5g，利用陈海水加热搅拌溶解后，加陈海水定容至1000ml，利用碱水调整PH＝7.2—7.5，再在121℃条件下灭菌15min后获得海水TSB液体发酵培养基。
上述发酵产物及发酵产物提取物抑制鳗弧菌测定方法：将鳗弧菌在无菌条件下，挑取2-3环菌体接种到装有100mL无菌海水TSB液体培养基的500ml三角瓶中28℃、180r/min的条件下摇床培养18小时，获得鳗弧菌种子液。取0.1ml上述鳗弧菌种子液涂布到9cm海水TSB固体平板上，在上述每只平板上均匀放置三只无菌牛津杯。在每块平板的三只牛津杯中注入一种发酵液或发酵产物提取物的预处理物，在28℃条件下正置培养24小时，测量抑菌圈大小，同时做空白对照组。
上述发酵液为通过离心处理后的发酵产物的清液部分，发酵产物提取物预处理物为利用二甲基桠枫作为溶剂溶解上述发酵产物提取物的溶液。空白对照组为在牛津杯只加二甲基桠枫溶剂。
如上所述，本发明的海洋解淀粉芽孢杆菌B5菌株对鳗弧菌具有拮抗作用和其发酵产物、发酵产物的提取物具有鳗弧菌抑制活性的特点。因此，海洋解淀粉芽孢杆菌B5菌株用于制作水产动物益生菌，海洋解淀粉芽孢杆菌B5的发酵产物、发酵产物的提取物用于防治水产动物鳗弧菌病的药物，该治疗鳗弧菌药物包含上述发酵产物，或发酵产物的提取物。
附图说明
图1为海洋解淀粉芽孢杆菌B5菌株的革兰氏染色。
图2为海洋解淀粉芽孢杆菌B5菌株的芽孢染色。
图3为海洋解淀粉芽孢杆菌B5菌株的鞭毛染色。
图4为海洋解淀粉芽孢杆菌B5菌株的16SrRNA的PCR扩增产物电泳图。
图5为海洋解淀粉芽孢杆菌B5菌株以16SrDNA基因序列为基础构建的系统发生树
图6为海洋解淀粉芽孢杆菌B5菌株以gyrB基因序列为基础构建的系统发生树
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
实施例1海洋解淀粉芽孢杆菌B5的分离方法:
⑴样品的采集与富集在连云港海域用无菌采样袋及无菌采样工具采集海水，海泥，海带，浒苔，裙带菜，龙须菜，紫菜样品。注明样品名称、采集日期以及采集地点。
⑵样品进行如下处理：海水样品采集来的海水混匀取10mL加入到装有100mL无菌海水TSB液体富集培养基的500ml三角瓶中28℃、180r/min的条件下摇床富集培养2d。海泥样品采集来的海泥混匀采用五点法采样再混匀，取10g海泥放入事先灭好菌的装有100ml海水TSB液体富集培养基的500ml三角瓶中28℃、180r/min的条件下摇床富集培养2d。海带样品用无菌海水冲洗海带样品3次后，放入无菌组织捣碎机中破碎至糊状，取10g浒苔破碎物加入到装有100mL无菌海水TSB液体富集培养基的500ml三角瓶中28℃、180r/min的条件下摇床富集培养2d。浒苔，裙带菜，龙须菜，紫菜样品处理同海带样品处理。
⑶海洋细菌的分离及纯化分别取1mL上述样品富集培养物的清液放入盛有9mL无菌海水的试管中进行梯度稀释取10-4、10-5、10-6稀释度样品0.1mL涂布到直径9cm的海水TSB固体分离培养基平板上，28℃倒置培养2d，每个稀释梯度重复3次观察并挑取形态、颜色不同的菌落采用三区划线方法进行纯化得到若干海洋细菌纯菌株。
⑷鳗弧菌拮抗菌分离、筛选，将鳗弧菌在无菌条件下，挑取2-3环菌体接种到装有100mL无菌海水TSB液体培养基的500ml三角瓶中28℃、180r/min的条件下摇床培养18小时，获得鳗弧菌种子液。取0.1ml上述鳗弧菌种子液涂布到海水TSB固体平板上，在上述每只平板上均匀点种⑶中获得的一株海洋细菌，在28℃条件下进行共培养36小时，观察并测量抑菌圈大小，筛选出对鳗弧菌具有拮抗效果的海洋细菌。经菌体形态学、生理生化及基因学鉴定确定获得一株海洋解淀粉芽孢杆菌B5。
⑸筛选到的海洋细菌B5纯培养物，转入固体斜面试管在28℃条件培养24小时，放在4℃冰箱中保存。
实施例2海洋解淀粉芽孢杆菌B5的鉴定和表型等方面的研究:
上述的海洋细菌B5的生物学形态描述为：在海水TSB培养基上，菌落形态：圆形突起，边缘不整齐，白色，干涩无光泽，该菌株菌体形态：杆状，两端钝圆，革兰氏染色阳性，芽孢中生，椭圆形，周生鞭毛。大小为(0.5～0.8)×(1.5.～4.5)μm。如图1，图2，图3所示。
上述的海洋细菌B5的生理生化指标：生理生化试验结果表明，菌株B5的生理生化试验结果与文献的有关海洋解淀粉芽孢杆菌特征一致，能利用葡萄糖、蔗糖、半乳糖、甘露糖、甘露醇，不利用果糖、乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、肌醇，氧化酶反应、硝酸盐还原试验、淀粉水解试验、明胶液化，v-p实验和2％氯化钠生长试验为阳性，吲哚反应、MR试验和脱羧酶试验为阴性。如表1。
根据形态学观察结果和生理生化特性，查阅《伯杰氏细菌鉴定手册》第八版等相关文献，初步认为海洋细菌B5属于芽孢杆菌属。
上述的海洋细菌B5的基因学鉴定为：
⑴海洋细菌B5的16SrDNA测序
应用细菌16SrDNA基因通用引物,正向引物为(ALF165312)：5'-GAGAGTTTGATCCTGGCT-3'，反向引物：(ALF165313)：5'-CGGCTACCTTGTTACGAC-3'，扩增海洋细菌B5的16SrDNA序列，经扩增产物测序得到海洋细菌B5大小为1381bp的基因片段，其序列已在GenBank中登记，登记号为JN051504.1。经与GenBank数据库中报道的16SrDNA核苷酸序列比对，序列同源性非常高的100个序列中，菌株chenj-5的16SrDNA核苷酸序列与Bacillusamyloliquefaciens、Bacillussubtilis，Bacillusvallismortis的16SrDNA序列相似度在99％以上，无法准确区分。见图5。
⑵海洋细菌B5的gyrB基因PCR扩增与测序
应用gyrB基因引物(-gyrBprimers：)
UP-1S(5-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA-3)，
UP-2Sr(5-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCC-3)，扩增海洋细菌B5的16SrDNA序列，经扩增产物测序得到海洋细菌B5大小为1165bp的基因片段，其序列已在GenBank中登记，登记号为JN859130.1。
用Blast在线程序进行同源比较,结果表明,所测得序列与数据库中Bacillusamyloliquefaciens来源的DNAgyrasesubunitB基因序列的一致性很高最高达99％。见序列表SEQIDNO.2，图6。
根据菌株的形态特征和基因学特征的分析以及系统发育分析，鉴定海洋细菌B5为解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)。
本发明所述的的海洋解淀粉芽孢杆海洋解淀粉芽孢杆菌B5(Bacillusamyloliquefaciensstrainchenj-5)已于2014年5月27日保藏在中国典型培养物保藏中心(其简称CCTCC)，保藏号：CCTCCM2014229该菌株基因序列已于2012年1月8号登记在NCBI中，登记号：JN859130.1。
实施例3海洋解淀粉芽孢杆菌B5的发酵方法：
菌种活化：取海洋解淀粉芽孢杆菌B5，采用划线法接种于海水TSB固体斜面培养基上，28℃培养18小时，得到对数生长期的斜面培养物。
其中海水TSB固体斜面培养基的配置方法为：称取胰蛋白胨17g，大豆蛋白胨3g，磷酸氢二钾2.5g，葡萄糖2.5g，5g琼脂粉利用陈海水加热搅拌溶解后，加陈海水定容至1000ml，利用NaOH调整PH＝7.2—7.5，再在121℃条件下灭菌15min后获得海水TSB固体斜面培养基。
种子液制备过程：将海洋解淀粉芽孢杆菌B5固体斜面培养物在无菌条件下，挑取2-3环菌体接种到装有100mL无菌海水TSB液体培养基的500ml三角瓶中28℃、180r/min的条件下摇床培养18小时，获得海洋解淀粉芽孢杆菌B5种子液。
发酵培养过程：在通气搅拌式发酵罐内加入海水TSB液体培养基，在121℃下维持15min灭菌后，接入种子液搅拌发酵，获得发酵产物。种子液预先利用无菌海水调整种子液的浓度至2.0*107cfu/ml，种子液的接种量按2％(v/v)接入；搅拌发酵环境参数为：通气量1.2vvm，温度为28℃，搅拌速度为每分钟150转；发酵时间为：36小时。获得具有抑制鳗弧菌活性的海洋解淀粉芽孢杆菌B5发酵产物。
其中海水TSB液体培养基的配置方法为：称取胰蛋白胨17g，大豆蛋白胨3g，磷酸氢二钾2.5g，葡萄糖2.5g，利用陈海水加热搅拌溶解后，加陈海水定容至1000ml，利用碱水调整PH＝7.2—7.5，再在121℃条件下灭菌15min后获得海水TSB液体发酵培养基。
实施例4海洋解淀粉芽孢杆菌B5对鳗弧菌拮抗作用:
海洋解淀粉芽孢杆菌B5和鳗弧菌菌株活化。将斜面保藏菌株B5及鳗弧菌，在无菌海水TSB固体斜面培养基或海水TSB固体平板培养基上划线传代培养2代备用。
将鳗弧菌在无菌条件下，挑取2-3环菌体接种到装有100mL无菌海水TSB液体培养基的500ml三角瓶中28℃、180r/min的条件下摇床培养18小时，获得鳗弧菌种子液。取0.1ml上述鳗弧菌种子液涂布到3块9cm海水TSB固体平板上。在上述每只平板上均匀点种活化好的海洋解淀粉芽孢杆菌B5，在28℃条件下倒置平板，进行共培养48小时，观察并测量拮抗圈大小。测得其拮抗圈大小如下表：
表2海洋解淀粉芽孢杆菌B5对鳗弧菌拮抗圈
由结果可以得到海洋解淀粉芽孢杆菌B5对鳗弧菌具有较强的拮抗特性，具有开发利用价值。
实施例5海洋解淀粉芽孢杆菌B5发酵液提取物、菌体提取物和极性段提取物的
制备方法
发酵液提取物：实施例3的淀粉芽孢杆菌B5发酵产物经管式离心机离心固液分离，得到发酵液和菌体；将发酵液减压浓缩至原体积的五分之一后用等体积的乙酸乙酯萃取3次，再将乙酸乙酯层减压干燥后得到发酵液提取物。
菌体提取物：实施例3的淀粉芽孢杆菌B5发酵产物经管式离心机离心固液分离，得到发酵液和菌体；菌体在真空干燥箱中4小时内30℃-50℃直线程序升温干燥，得干燥的菌体；干燥的菌体按1∶20(W/V)加入甲醇萃取3次，合并甲醇提取液，减压蒸馏干燥得到菌体提取物。
极性段提取物：将本实施例3所述的发酵液减压浓缩至原体积的五分之一，再采用液-液分配萃取法依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇按照1∶1比例萃取发酵液提取物的混悬液分别得到石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物等4个极性段提取物，剩余的发酵液提取物的混悬液为水的极性段提取物。
实施例6海洋解淀粉芽孢杆菌B5发酵产物、发酵液提取物、菌体提取物和极性段提取物对鳗弧菌抑制作用:
分别将发酵液提取物、菌体提取物和极性段提取物放入真空干燥箱内，真空度为-0.1mPa，温度为45℃减压干燥，去除提取溶剂残留。然后分别配置为10mg/ml二甲基亚砜溶液备用。
将鳗弧菌在无菌条件下，挑取2-3环菌体接种到装有100mL无菌海水TSB液体培养基的500ml三角瓶中28℃、180r/min的条件下摇床培养18小时，获得鳗弧菌种子液。取0.1ml上述鳗弧菌种子液涂布到块9cm海水TSB固体平板上。在无菌条件下在每只平板上均匀放置3只外径为8mm的无菌牛津杯。利用无菌枪分别吸取0.1ml上述的海洋解淀粉芽孢杆菌B5发酵产物、发酵液提取物、菌体提取物和极性段提取物二甲基亚砜溶液放入牛津杯中。在28℃条件下正置平板，进行共培养48小时，观察并测量抑菌圈大小。测得其抑菌圈大小如下表3，表4：
表3海洋解淀粉芽孢杆菌B5发酵产物、发酵液提取物和菌体提取物对鳗弧菌抑菌圈
表4海洋解淀粉芽孢杆菌B5发酵液极性段提取物对鳗弧菌抑菌圈
由表3，表4，可得发酵产物、发酵液提取物及菌体提取物均对鳗弧菌有较强的抑制特性，发酵液极性段提取物的抑菌活性物质主要在氯仿提取物和乙酸乙酯提取物中，为以后的活性物质分离提供了技术支撑。
实施例7海洋解淀粉芽孢杆菌B5发酵产物热稳定性
将海洋解淀粉芽孢杆菌B5发酵产物在25℃、50℃、75℃、100℃、水浴锅及121℃高压灭菌锅中保温放置60min处理。以鳗弧菌作为指示菌，测定其抑菌活性。测得其抑菌圈直径大小分别为，25℃20.3mm，50℃22mm、75℃21.5mm、100℃20.7mm、121℃21.8mm。由此可得海洋解淀粉芽孢杆菌B5发酵产物热稳定性高，为后续的发酵物分离提供了极其便利的操作条件。
Claims (12)
1.一种海洋细菌，其特征在于：该细菌分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2014年5月27日，保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO:M2014229。
2.一种如权利要求1所述的海洋细菌的用途，其特征在于：所述海洋解淀粉芽孢杆菌用于制备对鳗弧菌的拮抗药物的用途。
3.一种具有抑制鳗弧菌活性的发酵产物，其特征在于，所述的发酵产物由权利要求1所述的细菌经过液体发酵获得。
4.如权利要求3所述的一种具有抑制鳗弧菌活性的发酵产物，其特征在于，所述发酵产物由以下步骤发酵获得：
(1)菌种活化：取如权利要求1所述的海洋细菌，采用划线法接种于海水TSB固体斜面培养基上，28℃培养18小时，得到对数生长期的斜面培养物；
(2)种子液制备过程：将权利要求1所述的海洋细菌的固体斜面培养物在无菌条件下，挑取2-3环菌体接种到装有100mL无菌海水TSB液体培养基的500ml三角瓶中，28℃、180r/min的条件下摇床培养18小时，获得权利要求1所述的海洋细菌种子液；
(3)发酵培养过程：在通气搅拌式发酵罐内加入海水TSB液体培养基，在121℃下维持15min灭菌后冷却；种子液预先利用无菌海水调整种子液的浓度至2.0*107cfu/ml，种子液的接种量按2％(v/v)接入，接入种子液之后搅拌发酵；搅拌发酵环境参数为：通气量1.2vvm，温度为28℃，搅拌速度为每分钟150转；发酵时间为：36小时，获得发酵产物。
5.一种如权利要求4所述的发酵产物的用途，其特征在于：所述发酵产物用于制备防治鳗弧菌病害药物的用途。
6.一种具有抑制鳗弧菌活性的发酵液提取物，其特征在于，所述发酵液提取物由以下步骤获得：
如权利要求4所述的发酵产物经管式离心机离心固液分离，得到发酵液和菌体；将发酵液减压浓缩至原体积的五分之一后用等体积的乙酸乙酯萃取3次，再将乙酸乙酯层减压干燥后得到发酵液提取物。
7.一种如权利要求6所述的发酵液提取物的用途，其特征在于：所述发酵液提取物用于制备防治鳗弧菌病害药物的用途。
8.一种具有抑制鳗弧菌活性的菌体提取物，其特征在于，所述菌体提取物由以下步骤获得：
如权利要求4所述的发酵产物经管式离心机离心固液分离，得到发酵液和菌体；菌体在真空干燥箱中4小时内30℃-50℃直线程序升温干燥，得干燥的菌体；干燥的菌体按1∶20(W/V)加入甲醇萃取3次，合并甲醇提取液，减压蒸馏干燥得到菌体提取物。
9.一种如权利要求8所述的菌体提取物的用途，其特征在于：所述菌体提取物用于制备防治鳗弧菌病害药物的用途。
10.一种具有抑制鳗弧菌活性的极性段提取物，其特征在于，所述极性段提取物由以下步骤获得：
如权利要求4所述的发酵产物经管式离心机离心固液分离，得到发酵液和菌体；将发酵液减压浓缩至原体积的五分之一，获得发酵液浓缩物；再采用液-液分配萃取法依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇按照1∶1比例萃取发酵液浓缩物分别得到石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物等4个极性段提取物，剩余的发酵液浓缩物为水的极性段提取物。
11.一种如权利要求10所述的极性段提取物的用途，其特征在于：所述极性段提取物用于制备防治鳗弧菌病害药物的用途。
12.一种获得如权利要求4所述的一种具有抑制鳗弧菌活性的发酵产物的发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)菌种活化：取权利要求1所述的海洋细菌，采用划线法接种于海水TSB固体斜面培养基上，28℃培养18小时，得到对数生长期的斜面培养物；
(2)种子液制备过程：将权利要求1所述的海洋细菌的固体斜面培养物在无菌条件下，挑取2-3环菌体接种到装有100mL无菌海水TSB液体培养基的500ml三角瓶中，28℃、180r/min的条件下摇床培养18小时，获得权利要求1所述的海洋细菌种子液；
发酵培养过程：在通气搅拌式发酵罐内加入海水TSB液体培养基，在121℃下维持15min灭菌后冷却；种子液预先利用无菌海水调整种子液的浓度至2.0*107cfu/ml，种子液的接种量按2％(v/v)接入，接入种子液之后搅拌发酵；搅拌发酵环境参数为：通气量1.2vvm，温度为28℃，搅拌速度为每分钟150转；发酵时间为:36小时，获得发酵产物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410281747.9A CN104059869B (zh) | 2014-06-20 | 2014-06-20 | 一株海洋解淀粉芽孢杆菌及其培养方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410281747.9A CN104059869B (zh) | 2014-06-20 | 2014-06-20 | 一株海洋解淀粉芽孢杆菌及其培养方法和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104059869A CN104059869A (zh) | 2014-09-24 |
| CN104059869B true CN104059869B (zh) | 2016-07-06 |
Family
ID=51547804
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410281747.9A Active CN104059869B (zh) | 2014-06-20 | 2014-06-20 | 一株海洋解淀粉芽孢杆菌及其培养方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104059869B (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107868767A (zh) * | 2017-12-14 | 2018-04-03 | 宁波大学 | 一种紫菜藻际益生菌及其应用 |
| CN109486882A (zh) * | 2018-12-29 | 2019-03-19 | 上海邦成生物工程有限公司 | 一种解淀粉芽孢杆菌抗g-细菌抗菌肽及其发酵生产方法 |
| CN112961817B (zh) * | 2021-04-06 | 2021-11-05 | 广西中医药大学 | 一种利用海盐渗透压胁迫筛选高产Macrolactins海洋芽孢杆菌的方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20110043040A (ko) * | 2009-10-20 | 2011-04-27 | 이오형 | 광범위 항균활성 및 소화효소를 보유한 미생물의 분리 및 이를 이용한 기능성 대나무발효액의 제조방법 |
| CN102286408A (zh) * | 2011-08-04 | 2011-12-21 | 武汉光谷世傲生物科技有限公司 | 一种解淀粉芽胞杆菌wh3及制备方法和用途 |
| CA2831473A1 (en) * | 2011-04-13 | 2012-10-18 | Basf Se | Expression method |
| CN103695360A (zh) * | 2014-01-13 | 2014-04-02 | 淮海工学院 | 一种海洋解淀粉芽孢杆菌1a的分离方法与用途 |
-
2014
- 2014-06-20 CN CN201410281747.9A patent/CN104059869B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20110043040A (ko) * | 2009-10-20 | 2011-04-27 | 이오형 | 광범위 항균활성 및 소화효소를 보유한 미생물의 분리 및 이를 이용한 기능성 대나무발효액의 제조방법 |
| CA2831473A1 (en) * | 2011-04-13 | 2012-10-18 | Basf Se | Expression method |
| CN102286408A (zh) * | 2011-08-04 | 2011-12-21 | 武汉光谷世傲生物科技有限公司 | 一种解淀粉芽胞杆菌wh3及制备方法和用途 |
| CN103695360A (zh) * | 2014-01-13 | 2014-04-02 | 淮海工学院 | 一种海洋解淀粉芽孢杆菌1a的分离方法与用途 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Bacillus amyloliquefaciens strain chenj-5 DNA gyrase subunit B (gyrB);Chen, J.;《GenBank:JN859130.1》;20120108 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104059869A (zh) | 2014-09-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108676756B (zh) | 贝莱斯芽孢杆菌及其作为水产病原菌抑制剂的应用 | |
| CN108865953B (zh) | 一株广谱抑制水产病原性弧菌的芽孢杆菌及其复合菌制剂 | |
| CN109337841B (zh) | 一株具有高效抑菌性能的枯草芽孢杆菌bys2 | |
| CN104974950B (zh) | 一种海洋解淀粉芽孢杆菌及其用途 | |
| CN105039223B (zh) | 一株具有抑制产气荚膜梭菌作用的枯草芽孢杆菌及其应用 | |
| CN107338198B (zh) | 一种植物乳杆菌及其应用 | |
| CN110016451A (zh) | 一株贝莱斯芽胞杆菌、其微生态制剂及其制备方法 | |
| CN103320365B (zh) | 一株鱼源嗜水气单胞菌拮抗菌株及其应用 | |
| CN104195067A (zh) | 一株解淀粉芽孢杆菌及其在水产养殖中的应用 | |
| CN102154176A (zh) | 一种大菱鲆致病菌株及腹水病灭活疫苗 | |
| CN109161509A (zh) | 一株能防治牛羊腹泻病的菌株 | |
| CN104059869B (zh) | 一株海洋解淀粉芽孢杆菌及其培养方法和应用 | |
| CN103555613B (zh) | 一株对无乳链球菌有拮抗作用的枯草芽孢杆菌及其应用 | |
| CN104774781B (zh) | 一株枯草芽孢杆菌dcu及其用途 | |
| CN105349463B (zh) | 一种假单胞菌菌株及其应用 | |
| CN102417896A (zh) | 一种金黄色葡萄球菌的噬菌体及其应用 | |
| CN110331103A (zh) | 一株溶藻链霉菌n1-32、其微生态制剂及其制备方法 | |
| CN105695376B (zh) | 一株毒杀植物根结线虫的简单芽孢杆菌及其应用 | |
| CN109880767A (zh) | 一株用于预防或治疗对虾弧菌病的菌株 | |
| CN103205383B (zh) | 短小芽孢杆菌e14及其培养方法与用途 | |
| CN102559533A (zh) | 一种萎缩芽孢杆菌及其制剂和应用 | |
| CN114437964B (zh) | 一株贝莱斯株芽孢杆菌及其应用 | |
| CN104830728A (zh) | 一种雷氏普罗威登斯菌 | |
| CN104195068A (zh) | 一种用于预防和治疗对虾早期死亡综合症的复合微生态制剂及其应用 | |
| CN105670954B (zh) | 一种内生枯草芽孢杆菌及其作用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CP03 | Change of name, title or address | ||
| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: No.59 Cangwu Road, Haizhou District, Lianyungang City, Jiangsu Province 222000 Patentee after: Jiangsu Ocean University Address before: No.59 Cangwu Road, Xinpu District, Lianyungang City, Jiangsu Province 222000 Patentee before: HUAIHAI INSTITUTE OF TECHNOLOGY |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20210305 Address after: 222000 room 307, building 3, science and technology venture City, 17 Huaguoshan Avenue, hi tech Industrial Development Zone, Haizhou District, Lianyungang City, Jiangsu Province Patentee after: Lianyungang Zhonghua Agricultural Technology Co.,Ltd. Address before: No.59 Cangwu Road, Haizhou District, Lianyungang City, Jiangsu Province 222000 Patentee before: Jiangsu Ocean University |