CN103205383B - 短小芽孢杆菌e14及其培养方法与用途 - Google Patents

Abstract

本发明是一种短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）E14 CGMCC No.6682。本发明还公开了短小芽孢杆菌E14的培养方法，其步骤：将短小芽孢杆菌E14菌株接种到2216E液体培养基中，28℃、150rpm培养20h，即得菌液。本发明所述的短小芽孢杆菌E14或所述的方法培养得到的菌液具备抑制哈维氏弧菌（Vibrioharveyi）的抑菌用途，可以用于虾蟹养殖药物的制备，或者用于作为抑菌药物添加到虾蟹养殖饲料中。

Description

短小芽孢杆菌E14及其培养方法与用途

技术领域

本发明涉及一种微生物菌种，特别是一种短小芽孢杆菌E14；本发明还涉及该菌的培养方法与用途。

背景技术

近年来随着城市化和工业化进程的日益推进，导致海洋生态环境质量逐年下降，养殖病害也日益严重，由局部养殖区发展到几乎所有的养殖区，由阶段性发病发展到养殖全过程发病。其中弧菌病是海水养殖动物主要的细菌性病害之一，由弧菌属细菌引起，哈维氏弧菌就是一例。

目前对弧菌病的防治，多采用化学合成药物和抗生素等传统方法，这不仅使细菌耐药性增加，导致微生物的生态失调，产生二重感染，而且还使抗生素在生物体内残留，人体长期摄入可导致慢性中毒等，影响了水产养殖业的可持续性发展；滥用抗生素也使我国水产品出口屡屡受阻，给水产业造成了巨大损失。益生菌作为抗生素的替代品日益受到广泛的重视，它可通过刺激水生动物机体的免疫系统或抑制致病菌的生长来提高水产动物免疫力和抗病力。益生菌多数来自养殖水体、养殖动物体表或体内的正常细菌区系，不会对养殖动物造成危害,被人们视为一种行之有效的生物控制途径之一，因此研究开发预防、治疗和遏制泥鳅细菌性病害发生的微生物制剂就显得十分重要。本研究以防治水产主要病原菌哈维氏弧菌为目的，从虾蟹混养池底泥中分离筛选拮抗菌，为进一步开发微生物制剂奠定基础。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的短小芽孢杆菌E14。

本发明还提供了前述菌株E14的培养方法与用途。

本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种短小芽孢杆菌（Bacillus  pumilus）E14  CGMCC  No.6682。

本发明所述的短小芽孢杆菌E14的培养方法，其特点是，其步骤如下：将短小芽孢杆菌E14菌株接种到2216E液体培养基中，28℃、150 rpm培养20 h，即得菌液。

本发明所述的短小芽孢杆菌E14或者其培养方法得到的菌液具有抑制哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）的用途。

本发明所涉及的菌株短小芽孢杆菌（Bacillus  pumilus）E14已于2012年10月18日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCC No. 6682；保藏单位地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，电话：010-64807355。

以下对本发明的菌株短小芽孢杆菌E14进行详细说明。

1．菌株的分离筛选

1．1菌株分离及保存

样品采集：在虾蟹养殖期，取养殖池底泥15g左右，装入无菌塑料保鲜袋，当天带回实验室，4℃保藏备用。菌株分离：取5 g采集的泥样，加入45 mL无菌生理盐水，30 ℃摇床培养2 h，然后10^-1~10^-7梯度稀释，各梯度取100 μL涂布于2216E培养基平板上，30 ℃连续培养 3 d，挑取形状、色泽、质地不同的菌落，逐次划线分离成纯培养物，加入终浓度15%的甘油，-20℃保存备用。

1．2分离菌株的抑菌活性检测与筛选

1．2．1抑菌圈实验

将分离出来的待测菌株点接到涂布有哈维氏弧菌的2216E双层平板上，28℃培养24 h，观察各菌株抑菌圈的大小，其中一株被命名为E14的对哈维氏弧菌有较强的抑菌效果，故用该菌株进行后续实验。

1．3 E14不同用量对哈维氏弧菌的拮抗效果

将E14菌株接种到2216E液体培养基中，28℃、150 rpm培养20 h。在涂布有哈维氏弧菌的2个平板上，各放置5个牛津杯，取20、40、60、80、100和120、140、160 μL培养液，依次加入2个平板的牛津杯中，中间的牛津杯分别加入50和150μL 未接种的无菌培养基作对照，轻轻放入恒温培养箱中，28℃培养24 h，观察抑菌圈大小变化情况，结果见图1、图2。

由从图1可见，随着拮抗菌体积的增大，抑菌圈直径也随之增大，但在120 μL后，抑菌圈的直径不再增加，由此可见，E14菌株使用120 μL的过夜培养液可以达到最大的抑菌效果。

2．E14菌株的形态特征

E14菌株在2216E平板上菌落表现为：乳白色，扁圆形，凝胶状，表面较光滑，与培养基接触不紧密，易挑起。在显微镜下观察，显示革兰氏阳性，短杆状，大小为1.10~1.32×0.67~0.83 μm。

3．E14菌株的分子鉴定

3．1 E14菌株基因组DNA提取及16S rDNA扩增

E14菌株总DNA提取按常规细菌总DNA提取方法操作，用16S rDNA通用引物AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和TACCTTGTTACGACTT扩增16S rDNA片段，经天跟通用型DNA回收试剂盒（DP214）回收。

3．2     E14菌株16S rDNA序列测定

按Takara DNA Ligation Kit 说明，将得到的16S rDNA与pMD-18T连接，送上海鼎安生物科技有限公司测序。测序结果已提交Genebank数据库，登录号JX987716。

3．3 E14菌株系统发育地位的确定

从http://rdp.cme.msu.edu 网站下载20个相似性较高的模式菌株16S rDNA序列，使用BioEdi软件进行多重比对，用MEGA4.0做进化树，从进化树可以看出，E14与Bacillus pumilus亲缘关系较近，因此将E14命名为短小芽胞杆菌Bacillus pumilus E14。

4．E14菌株拮抗物质的研究

将拮抗菌E14在2216E液体培养基中28 ℃，150 rpm摇床培养20 h，然后做如下处理：①取菌液100μL，不做任何处理；②菌液在4 ℃，8000 rpm下离心30 min，取上清再离心，共三次；③菌液在4℃，8000 rpm下离心30 min，取沉淀再离心，共三次，用等体积pH8.0的50 mM Tris-HCl，300 mM NaCl重悬沉淀；④取菌液100μL，加蛋白酶K（终浓度1 mg/mL）55 ℃温育4 h；⑤取菌液100μL，沸水浴10 min；⑥对照：未接菌的2216E培养液。分别取以上各处理样品20μL，用滤纸片抑菌圈法检测其抑菌活性，结果见图3。由图3分析可知，该拮抗菌的抑菌活性物质存在于菌液上清之中，即为细菌细胞外物质；在高温和蛋白酶K处理下均失去抑菌活性，可以判断该物质属于蛋白质类。

与现有技术相比，本发明提供了一种新的菌株短小芽孢杆菌E14，该菌株或者经本发明方法培养得到的菌液具有抑制哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）的用途，可以用于虾蟹养殖药物的制备，或者用于作为抑菌药物添加到虾蟹养殖饲料中。

附图说明

图1、图2为本发明菌株E14使用量对哈维氏弧菌的拮抗效果图；图中数字为加入发酵液的体积（μL）；

图3为本发明菌株E14拮抗特质菌性及在细胞中位置的确定图；图中①为E14菌液，②为上清，③为沉淀，④为蛋白酶K消化菌液，⑤为水煮菌液，⑥灭菌2216E。

具体实施方式

以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。

实施例1，一种短小芽孢杆菌（Bacillus  pumilus）E14  CGMCC  No.6682。

实施例2，一种如实施例1所述的短小芽孢杆菌E14的培养方法，其步骤如下：将短小芽孢杆菌E14菌株接种到2216E液体培养基中，28℃、150 rpm培养20 h，即得菌液。

实施例1所述的短小芽孢杆菌E14或者实施例2所述的方法培养得到的菌液的具用抑菌作用，可以用来抑制哈维氏弧菌（Vibrio harveyi），可以用于虾蟹养殖药物的制备，或者用于作为抑菌药物添加到虾蟹养殖饲料中。

Claims (4)

1.一种短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）E14，其特征在于，保藏号为CGMCCNo.6682。

2.一种如权利要求1所述的短小芽孢杆菌E14的培养方法，其特征在于，其步骤如下：将短小芽孢杆菌E14菌株接种到2216E液体培养基中，28℃、150rpm培养20h，即得菌液。

3.权利要求1所述的短小芽孢杆菌E14的非治疗抑菌用途，所抑的菌为哈维氏弧菌（Vibrioharveyi）。

4.权利要求2所述的方法培养得到的菌液的非治疗抑菌用途，所抑的菌为哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）。