CN101323844A - 血红蛋白降解菌njm4 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种血红蛋白降解菌NJM4，属于生物高技术领域。该菌株NJM4分类命名为：短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，保藏号为CGMCC NO.2337。将菌株接种于种子培养基中，37℃条件下，以120r/min培养24h，获得NJM4液体培养物。该菌株在鲜血琼脂培养基上产生透明的溶血圈，在血红蛋白发酵培养基中血红蛋白降解率为53.6％，在血红蛋白溶液中将血红蛋白降解为小分子的多肽。本发明是利用微生物发酵的方法降解血红蛋白，适用于优质蛋白饲料的生产。可用于畜禽屠宰废弃血液资源的开发利用，特别是将血液蛋白转化成饲料，不仅可以变废为宝、保护环境，还可以促进可持续发展，且具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明一种血红蛋白降解菌NJM4，属于生物高技术领域，是利用微生物发酵的方法降解血红蛋白，适用于优质蛋白饲料的生产。
背景技术
畜禽血液是一种宝贵的蛋白资源。一方面是由于血粉的蛋白质含量很高，如猪血中蛋白质占鲜血的17-20％，联合国粮农组织农业部在推荐开发利用血粉的第32号报告中，把血粉与骨粉、肉粉、鱼粉、动物下脚料做了较详细的比较，结果表明，血粉的蛋白质含量是最高的。而且必须氨基酸全部具备；另一方面，血粉的特殊营养价值与含铁高有关，血内含铁量比现有的所有其他产品都高。如血的含铁量为30毫克(％)，肉内为2.6毫克(％)，而且铁吸收率很高。虽然血粉中粗蛋白达79.9％，不过其中难以消化的血红蛋白占70％以上。国内已有一些企业收集屠宰血液，制成血粉，部分取代蛋白饲料，但因血粉中血红蛋白分子量大，动物缺乏专业性消化血红蛋白的酶类，使得血粉中大部分蛋白难以消化，且血粉的适口性差。目前的血粉工业化生产工艺，能部分改善血红蛋白的消化率，但仍然难以解决消化率低下的问题。因此，畜禽血液除少量用于制作血豆腐、血肠外，基本未得到开发利用，宝贵的蛋白资源绝大部分被白白排掉，既形成巨大浪费又加重了环境污染。研究表明每千克血的污染负荷BODS为150克，去除1千克BODS负荷需花费人民币0.4元，防治全国畜禽血排放所造成的环境污染，需耗费人民币1亿元。因此，开展畜禽屠宰废弃血液资源的开发利用研究，特别是将血液蛋白转化成饲料，不仅可以变废为宝、保护环境，还可以促进可持续发展，且具有广阔的应用前景。近年来，全球养殖业的飞速发展，集约化程度也越来越高。但是饲料蛋白资源开始出现严重的短缺，如最重要的饲料蛋白-鱼粉的世界产量这些年来一直在持续下降，价格一路飙升。因此开发新的饲料蛋白作为鱼粉的替代品迫在眉睫，而利用产量巨大的畜禽屠宰血液用高效菌株发酵后作为优质蛋白饲料源，不失为最佳途径之一。
发明内容
技术问题
本发明的目的在于针对生产实践中饲料蛋白资源开始出现严重的短缺的问题，提供一种血红蛋白降解高效菌株，用于开发新的蛋白饲料。
技术方案本发明提供一种血红蛋白降解菌，该菌株NJM4分类命名为：短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，2008年1月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区大屯路.中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC NO.2337，主要生物学特性为G+，菌体为杆状，大小约0.6～0.7μm×2.0～3.0μm，周生鞭毛；接触酶，V-P反应，葡萄糖、蔗糖产酸，利用柠檬酸盐阳性；厌氧生长，卵黄反应，利用丙酸盐，水解淀粉阴性；该菌株16S rDNA的Genbank登陆号为EU234500。
上述菌株NJM4的扩大培养方法为：
1)种子培养基的配方为，1L蒸馏水中含：6.0g蛋白胨，4.0g牛肉浸膏，2.0g酵母浸汁，5.0g氯化钠。加热溶解，调节pH 7.5，121℃高压灭菌15min。
2)将上述得到的菌株NJM4接种于装有50mL种子培养基的250mL的锥形瓶中，温度37℃条件下，在摇床上以120r/min的转速培养24h，获得NJM4菌液，菌体数量为4×1011CFU/mL。
血红蛋白降解菌NJM4能在鲜血琼脂培养基上生长，产生透明溶血圈。所述鲜血琼脂培养基配方为：1L蒸馏水中含：10.0g蛋白胨，3.0g牛肉浸膏，5.0g氯化钠，20.0g琼脂粉。加热溶解，调节pH 7.5，121℃高压灭菌15min。冷却至45℃～50℃，加入新鲜羊血50mL。
用血红蛋白降解菌NJM4发酵血红蛋白发酵培养基，降解血红蛋白。血红蛋白发酵培养基的配方为：1L蒸馏水中含：4.0g葡萄糖，0.4g磷酸氢二钾，0.5g氯化钠，0.6g磷酸二氢钾，0.1g硫酸镁，0.02g硫酸铁，调节pH7.0，121℃高压灭菌15min。冷却至45℃～50℃，加10.0g新鲜羊血红蛋白。
用上述血红蛋白降解菌NJM4发酵血红蛋白溶液，使血红蛋白降解为小分子的多肽。将血红蛋白降解菌NJM4，在装有200μL上述血红蛋白溶液的96孔培养板中，温度37℃条件下，分别培养0h、10h、18h、24h、36h时采样，采集到的样品做SDS-PAGE电泳，电泳结果显示随着时间的增加血红蛋白被逐步降解成小分子的多肽。所述血红蛋白溶液的配方为：1L灭菌蒸馏水中含新鲜羊血红蛋白50g。
有益效果
本发明提供了血红蛋白降解菌NJM4。血红蛋白降解菌NJM4能在鲜血琼脂培养基上生长，产生透明溶血圈。用血红蛋白降解菌NJM4发酵血红蛋白发酵培养基，血红蛋白降解率为：53.6％。血红蛋白降解菌NJM4发酵血红蛋白溶液，使血红蛋白降解为小分子的多肽。本发明还提供了血红蛋白降解菌NJM4的扩大培养方法，产品中的菌体数量达到4×1011CFU/mL。
血红蛋白降解菌NJM4可用于畜禽屠宰废弃血液资源的开发利用，利用产量巨大的畜禽屠宰血液用高效菌株发酵后作为优质蛋白饲料源，特别是将血液蛋白转化成饲料，不仅可以变废为宝、保护环境，还可以促进可持续发展，且具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为血红蛋白降解菌NJM4在血红蛋白溶液中发酵血红蛋白后得到的上清液的SDS-PAGE电泳结果，结果显示随着时间的增加血红蛋白被逐步降解成小分子的多肽。
其中1-5泳道为血红蛋白未接种NJM4的对照组，采样时间分别为0h、10h、18h、24h、36h；M为蛋白质分子量标准(66KD、45KD、35KD、27KD、20KD、14.4KD、9.5KD、6.5KD、4.1KD)；7-11泳道为血红蛋白接种NJM4的试验组，采样时间分别为0h、10h、18h、24h、36h。
具体实施方式
实施例1：高效菌株分离
从屠宰场排污沟等特殊环境中共采集样品2g，加入10mL营养肉汤，振荡1min，静置5min，吸取上清液接种营养肉汤培养基，温度37℃条件下培养48h。
将上述培养菌种划线接种鲜血琼脂培养基平板，温度37℃条件下培养24h。所述鲜血琼脂培养基配方为，1L蒸馏水中含：10.0g蛋白胨，3.0g牛肉浸膏，5.0g氯化钠，20.0g琼脂粉。加热溶解，调节pH 7.5，121℃高压灭菌15min。冷却至45℃～50℃，加入新鲜羊血50mL。
对上述培养基中产生溶血圈较大的细菌进行纯培养。得到溶血能力较大的一株细菌，命名为：NJM4。该菌株NJM4为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，2008年1月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.2337，主要生物学特性为G+，菌体为杆状，大小约0.6～0.7μm×2.0～3.0μm，周生鞭毛；接触酶，V-P反应，葡萄糖、蔗糖产酸，利用柠檬酸盐阳性；厌氧生长，卵黄反应，利用丙酸盐，水解淀粉阴性；该菌株16S rDNA的Genbank登陆号为EU234500。
实施例2：上述菌株NJM4的扩大培养
种子培养基的配方为，1L蒸馏水中含：6.0g蛋白胨，4.0g牛肉浸膏，2.0g酵母浸汁，5.0g氯化钠。加热溶解，调节pH 7.5，121℃高压灭菌15min。
将上述得到的菌株NJM4接种于装有50mL种子培养基的250mL的锥形瓶中，温度37℃条件下，在摇床上以120r/min的转速培养24h，获得NJM4液体培养物，菌体数量为4×1011CFU/mL。
实施例3：利用菌株NJM4在血红蛋白发酵培养基中发酵降解血红蛋白取实施例2获得的NJM4液体培养物6mL，接种于装有150mL血红蛋白发酵培养基的250mL锥形瓶中，温度37℃条件下，在摇床上以120r/min的转速培养24h。血红蛋白发酵培养基的配方为：1L蒸馏水中含：4.0g葡萄糖，0.4g磷酸氢二钾，0.5g氯化钠，0.6g磷酸二氢钾，0.1g硫酸镁，0.02g硫酸铁，调节pH7.0，121℃高压灭菌15min。冷却至45℃～50℃，加10.0g新鲜羊血红蛋白。采用凯氏定氮法测定血红蛋白降解率，培养24h后血红蛋白降解率为53.6％。
实施例4：利用菌株NJM4在血红蛋白溶液中发酵降解血红蛋白
取实施例2获得的NJM4液体培养物10μL，接种于装有200μL血红蛋白溶液的96孔培养板中，温度37℃条件下培养36h。血红蛋白溶液的配方为，1L灭菌蒸馏水中含：新鲜羊血红蛋白50g。
分别采集0h、10h、18h、24h、36h的液体培养物，12000r/min离心5min，得到的上清液做SDS-PAGE电泳，电泳结果显示随着时间的增加血红蛋白被逐步降解成小分子的多肽(图1)。
Claims (3)
1.一种血红蛋白降解菌，其特征在于，该菌株NJM4分类命名为：短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，2008年1月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.2337。
2.如权利要求1所述的血红蛋白降解菌，其扩大培养方法为：
(1)种子培养基的配制：1L蒸馏水中含6.0g蛋白胨、4.0g牛肉浸膏、2.0g酵母浸汁和5.0g氯化钠，加热溶解，调节pH 7.5，121℃高压灭菌15min；
(2)将权利要求1所述菌株NJM4接种于装有50mL种子培养基的250mL的锥形瓶中，温度37℃条件下，在摇床上以120r/min的转速培养24h，获得NJM4菌液。
3.权利要求1或2所述的血红蛋白降解菌在降解血液蛋白资源方面的应用。
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