CN103820352B - 一种蜡样芽孢杆菌ysq08及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及农副产品加工领域，公开了一种蜡样芽孢杆菌YSQ08及其应用。所述蜡样芽孢杆菌（<i>Bacillus？cereus</i>）YSQ08，是从森林土壤中采用土壤稀释分离法分离获得，已于2012年09月03日保藏于中国典型培养物保藏中心（武汉大学，武汉，中国），菌种保藏号为CCTCC？No.？M2012322。该菌种具有很好的动物毛发降解能力，应用本菌种发酵后的动物毛发可作为饲料添加剂、生物肥料或餐厨垃圾降解剂的应用。

Description

一种蜡样芽孢杆菌YSQ08及其应用

技术领域

本发明涉及农副产品加工领域，更具体地，涉及一种蜡样芽孢杆菌YSQ08及其应用。

背景技术

我国集约化动物养殖业发展迅速，在满足人们对肉、蛋、奶需求的同时，还产生大量动物毛发如羽毛等副产物。动物毛发主要由角蛋白组成，由于养殖动物（猪、牛、羊、鱼）不能有效地分解角蛋白，除少部被直接制作羽毛球或保暖材料外，绝大部分动物毛发利用价值低，大部分作为废物被弃置。（汪国和等，2005）据统计，我国2011年肉鸡出栏量达到87.3亿，估计其羽毛产量达到88万吨。这些羽毛绝大部分被堆埋，不仅浪费了蛋白资源，还造成了环境污染。另外也有部分羽毛废物被资源化利用，主要是经过简单粉碎作为羽毛粉出口，经济效益较低。

与此同时，我国的饲料蛋白需求仍然存在较大的缺口，对国外市场的依存度很高，急需开发新的饲料蛋白来源。目前，我国饲料蛋白的原料主要为豆粕、杂粕以及鱼粉，主要依赖进口，价格年年上扬。如果动物毛发蛋白资源能得到更充分的利用，如采用物理、化学或生物降解的方法分解角蛋白，使之成为可溶性蛋白，提高动物利用水平，就能作为饲料蛋白的新的稳定的来源；并且可将动物毛发由废变宝，提高其利用价值。

但动物毛发的角蛋白的开发利用难度较大。动物毛发分解难度大的主要原因是由于其中主要成分角蛋白的分子结构复杂，包括α-螺旋和β-折叠等，另外还有大量的高度交联的分子键如二硫键等。因此，普通的物理、化学方法对于羽毛的降解效率受限制，而生物酶解的应用潜力则缺乏研究。（杨建强等，2005）一般的蛋白酶对角蛋白的降解效率较低。

在美国、日本等发达国家，对于动物毛发的开发利用研究也不少，例如作为培养基氮源、功能性纤维、微胶囊、化妆品、化肥等。我国对于动物毛发资源的应用程度仍然较低，为适应我国社会发展的需要，缓解氨基酸供求矛盾。在开发羽毛蛋白的应用方面，生物降解方法具有不可忽视的潜力，是当今的研究热点之一。BacillussubtilisKS-1（ManczingerLetal.,2003）、Bacilluslicheniformi（SuhHJetal.,2001）s、Streptomycesalbidofavus（PhilippeBetal.,1999）等羽毛降解菌株已经展开相关筛选研究工作，但仍未能满足饲料蛋白的工业需求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，为了克服现有技术中存在的动物毛发

中角蛋白利用率低的问题，提供一种可降解动物毛发的蜡样芽孢杆菌YSQ08。

本发明所要解决的另一技术问题是，提供一种由蜡样芽孢杆菌YSQ08制备得到的动物毛发发酵液。

本发明所要解决的上述技术问题通过以下技术方案予以实现：

一种蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）YSQ08，已于2012年09月03日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏编号为CCTCCNo.M2012322。

所述蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）YSQ08，是从黄鸡长期生长的鸡窝及附近土壤中采用土壤稀释分离法分离获得，已于2012年09月03日保藏于中国典型培养物保藏中心（武汉大学，武汉，中国），菌种保藏编号为CCTCCNo.M2012322。

更具体地，上述菌株是从24份土壤中筛选所得，将土壤样品稀释成不同稀释倍数的土壤稀释液，在牛肉膏蛋白胨培养基中37℃初步富集培养，然后使用稀释倒平板法分离纯种菌株，获得疑似羽毛降解菌31株。利用点种法在角蛋白平板培养基上筛选产生蛋白溶解圈的菌株。再将产生蛋白溶解圈的菌株接种到羽毛培养基中筛选，培养条件为37℃、200r/min，目标为观察到羽毛溶解现象。通过反复筛选，分离得到一株高羽毛降解能力的菌株。

该蜡样芽孢杆菌的微生物学特征为：菌落圆形或近似圆形，面积大，稍有光泽米白色，似蜡烛样颜色，半透明，扁平，表面粗糙，边缘不规则呈锯齿状。适宜生长温度为25~35℃，可以在pH6~9的环境中生长。菌体椭圆或柱状，末端较方，菌体串状成短或长链，体积1.0~1.2×3.0~5.0微米。产芽孢，芽孢圆形或柱形，中生或近中生，1.0~1.5微米，孢囊无明显膨大。革兰氏阳性，无荚膜，具有鞭毛可运动。接触酶、葡萄糖产酸、V-P试验、酪氨酸水解、淀粉水解、明胶液化、产硫化氢、产吲哚、氧化酶、硝酸盐还原阳性；阿拉伯糖、木糖、甘露醇产酸、甲基红试验、产脂酶、亚硝基还原、ONPG阴性。

根据《伯杰氏鉴定手册》提供的生理生化鉴定方法，并经16SrDNA测序鉴定，确认该菌株为蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus），标号为BacilluscereusYSQ08。

所述蜡样芽孢杆菌YSQ08的培养方法为：

本发明还提供所述的蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）YSQ08在降解角蛋白中的应用。

作为一种优选方案，所述的角蛋白为动物毛发中的角蛋白。

作为一种最优选方案，所述的动物毛发为鸡毛、牛毛或羊毛。一种动物毛发发酵液，其特征在于，将动物毛发利用蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）YSQ08发酵得到。

作为一种优选方案，所述的动物毛发为鸡毛、牛毛或羊毛。分别得到鸡毛发酵液、牛毛发酵液和羊毛发酵液。

上述动物毛发发酵液作为饲料添加剂、生物肥料或餐厨垃圾降解剂的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

该菌种能在48h内把羽毛降解为短肽、氨基酸和絮状物，并且羽毛梗也被降解，与丁淑丽等报道的产角蛋白酶黄杆菌（最高酶活69.9U/mL）、蔡成岗等报道的枯草芽孢杆菌菌株KD-N2（最高酶活66.5U/mL）、聂康康等报道的苏云金芽孢杆菌菌株NJY1（最高酶活88.77U/mL）相比，本专利筛选所得的羽毛降解菌相比有更好的羽毛降解能力。根据酶活分析结果，B.CereusYSQ08发酵液以牛毛为底物的角蛋白酶活性最高，达到271U/mL。以鸡毛为底物的角蛋白酶活性也达到203U/mL，而且鸡毛发酵液游离氨基酸含量较高，动物饲养试验结果表明发酵液可以作为饲料添加剂使用，达到增大饲料利用率的效果。

保藏信息：

蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）YSQ08，保藏日期：2012年09月03日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：武汉大学.武汉.中国，菌种保藏编号：CCTCCNo.M2012322。

附图说明

图１为蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）YSQ08革兰氏染色结果。

图２为蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）YSQ08在羽毛培养基发酵前的照片。

图3为蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）YSQ08在羽毛培养基发酵后的照片。

图4为蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）YSQ08在角蛋白培养基上检测蛋白溶圈结果照片。

图5为蜡样芽胞杆菌（Bacilluscereus）YSQ0816SrDNA序列的系统发育分析结果。

图6为蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）YSQ08发酵液对不同底物的角蛋白酶酶活。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对发明不做任何形式的限定。

实施例1：高效降解角蛋白菌株的分离、纯化与鉴定

在有黄鸡长期生长的鸡窝及附近土壤中采集土壤样品50g，分别在不同深度均匀挖取土壤，获得土壤样品24份。用10倍梯度稀释法分别将样品稀释到10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5的浓度，按5%接种量接种到5mL牛肉膏蛋白胨培养基中37℃富集静置培养12h。

对上述富集培养液取1mL用稀释倒平板法，在牛肉膏蛋白胨固体平板上分离纯种菌株，挑取单菌落，用点种法在角蛋白培养基上接种，37℃培养24h，观察蛋白溶圈现象。挑取所有产生蛋白溶圈的菌株共31株。

对上述31株菌株进行多次划线纯化培养，其中一株菌株产生的蛋白溶解圈直径达到26mm，按1%接种量接种到羽毛培养基中，37℃、200r/min培养48h，可明显观察到羽毛降解，命名该菌株为YSQ08。

观察YSQ08的菌落外观形态，并进行革兰氏染色、芽孢染色，确认细菌形态，结果如下：

在牛肉膏蛋白胨培养基上菌落圆形或近似圆形，面积大，稍有光泽米白色，似蜡烛样颜色，半透明，扁平，表面粗糙，边缘不规则呈锯齿状。

菌体椭圆或柱状，末端较方，菌体串状成短或长链，体积1.0~1.2×3.0~5.0微米。产芽孢，芽孢圆形或柱形，中生或近中生，1.0~1.5微米，孢囊无明显膨大。革兰氏阳性，无荚膜，具有鞭毛可运动。

根据《伯杰氏鉴定手册》提供的生理生化鉴定方法，检测结果如表1。

根据已知细菌的16SrDNA保守序列，选择常规通用引物27F和1541R，对YSQ08进行16SrDNA测序鉴定。引物序列如下：

27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'

1541R：5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'

使用饱和苯酚-氯仿抽提法提取YSQ08基因组，经琼脂糖电泳检验质量。PCR反应使用TAKARAExTaq^TMPCRkit进行扩增，扩增产物使用TAKARApMD19-TSimpleVector和TAKARAE.ColiCompetentCellsDH5α进行保存，送样到广州Invitrogen生物科技有限公司进行16SrDNA基因序列测序。将YSQ08菌株完整16SrDNA序列与GenBank进行Blast比对，再用ClustalX1.8.3进行多序列比对,采用Neighbour-Joining方法，通过Mega5软件构建系统发育树。重复取样1000次进行自展值(bootstrapvalue)分析，以评估系统进化树拓扑结构的稳定性。（季金殿等，2009）比对结果与蜡样芽孢杆菌（BacilluscereusBGSC6A5，GenBank号为AY224383.1）有99%相似性，结合上述形态和生理生化特征，表明YSQ08属于蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus），标号为BacilluscereusYSQ08。

蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）YSQ08已于2012年09月03日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCCNo.M2012322。

实施例2：本专利所述蜡样芽孢杆菌YSQ08的扩大培养及鸡毛降解效果

种子液培养基选用LB肉汤培养基和牛肉膏蛋白胨培养基，配方为：

LB肉汤培养基：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g，加蒸馏水定容至1000mL，pH7.0，121℃高压灭菌20min。

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏0.5g、蛋白胨1g、NaCl0.5g，加蒸馏水定容至1000mL，pH7.0~7.2，121℃高压灭菌20min。

将蜡样芽孢杆菌YSQ08斜面菌种（牛肉膏蛋白胨培养基）或甘油菌种（LB肉汤培养基）接种于装有50mL牛肉膏蛋白胨培养液的250mL锥形瓶中，置于恒温摇床中以37℃，200r/min培养12h可获得种子液。

发酵液选用鸡毛培养基，配方为：NaCl0.5g、CaCl₂0.06g、MgCl₂0.1g、K₂HPO₄1.4g、KH₂PO₄0.7g、鸡毛10g，加蒸馏水定容至1000mL，pH7.5，121℃高压灭菌20min。（ManczingerLetal.,2003）

将上述种子液按1%（v/v）接种量，接种于装有150mL鸡毛培养基的500mL锥形瓶中，置于恒温摇床中以37℃，200r/min培养48h可获得蜡样芽孢杆菌YSQ08发酵液，活菌数达到5.2×10¹⁰CFU/mL。

以鸡毛角蛋白粉，按0.5%的浓度加入pH为8.0的PBS缓冲溶液，摇匀配制成反应底物悬浮液。在试管中加入4mL配好的底物悬浮液，再加2mL上述蜡样芽孢杆菌YSQ08发酵液，摇匀，在55℃水浴锅中反应30min，加入10%三氯乙酸(TCA)溶液终止反应，4℃下10000g离心10min，取上清液于OD280nm下测定其吸光值。此反应条件下，吸光值每增加0.001定义为1个角蛋白酶活性单位U。（RiffelAetal.,2003）另外，以初步粉碎的鸡毛、牛毛、羊毛为底物，测定蜡样芽孢杆菌YSQ08发酵液对不同底物的角蛋白酶活性。

测得结果如图5所示，结果发现蜡样芽孢杆菌YSQ08发酵液对鸡毛角蛋白粉、鸡毛、牛毛、羊毛均有角蛋白酶活性，以牛毛为底物的酶活最高，可达到272U/mL。

实施例3：本专利所述动物毛发的发酵中试及发酵液中氨基酸浓度与组成

分别将1kg三黄胡须鸡毛（广东省四会郊区小型鸡场）、1kg黄牛牛毛（华南农业大学大丰路畜牧研究所）、1kg绵羊羊毛（华南农业大学大丰路畜牧研究所）加入蒸馏水中充分浸湿，定容至5L，分别置于8L磁力搅拌不锈钢发酵罐中，121℃灭菌45min，以0.5%接种量接种实施例2中制备得到的种子液进行发酵，37℃恒温培养，搅拌速度为100r/min，通气量为0.4V／V·min，pH调至8.0，连续发酵48h，可获得鸡毛发酵液、牛毛发酵液、羊毛发酵液。

利用氨基酸分析仪对鸡毛发酵液、牛毛发酵液、羊毛发酵液进行游离氨基酸浓度与组成的测定，方法为HPLC法（SuhHJetal.,2001），其测定结果如表2。

结果表明，发酵液的游离氨基酸的测定结果表明鸡毛发酵液中游离氨基酸含量最为丰富，和牛毛发酵液与羊毛发酵液相比，营养价值更高，其中酪氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸含量丰富，因此鸡毛发酵液更适合作为饲料添加剂。

实施例4：鸡毛发酵液作为动物饲料蛋白添加剂的养殖试验

选取60只4周龄雌性土鸡，按起始体重平均分为三组，如上述方法发酵鸡毛发酵液共30L，按0%、5%、10%（w/w）的比例添加到玉米粉豆粕鸡饲料中，分别喂饲三组土鸡28天，期间每天记录采食量，每7天记录体重，计算料肉比，结果如表3。

从动物养殖结果发现，在基础日粮中添加5%鸡毛发酵液作为饲料添加剂，与对照组相比，日增重增加了14.37%，但料肉比也增加了2.86%。而添加10%鸡毛发酵液可使土鸡日增重增加12.69%，而且料肉比下降3.97%，提高饲料利用率。表明蜡样芽胞杆菌YSQ08的鸡毛发酵液作为饲料添加剂，可有效提高饲料营养价值。

Claims (7)

1.一种蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）YSQ08，已于2012年09月03日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏编号为CCTCCNo.M2012322。

2.权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）YSQ08在降解角蛋白中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的角蛋白为动物毛发中的角蛋白。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的动物毛发为鸡毛、牛毛或羊毛。

5.一种动物毛发发酵液，其特征在于，将动物毛发利用权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）YSQ08发酵得到。

6.根据权利要求5所述的发酵液，其特征在于，所述的动物毛发为鸡毛、牛毛或羊毛。

7.权利要求5或6所述的动物毛发发酵液作为饲料添加剂、生物肥料的应用。