CN101928681A - 短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)NMCN1及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)NMCN1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2009年11月2日，保藏号为CGMCC No.3377。本发明的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)NMCN1CGMCC No.3377是一种从西藏纳木错湖湖边泥土中分离得到的生防芽孢杆菌，可以在10℃的条件下生长，有利于发挥其促生和生防作用，能够抑制番茄灰霉病的病原菌和酵母菌，还能够促进拟南芥和番茄的生长，特别是对于番茄灰霉病的防治效果高达75％，同时增加番茄产量达12％。
Description
技术领域
本发明涉及一种短小芽胞杆菌，具体地说，是一种分离于西藏具促生和防病作用的低温适生短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)NMCN1及其在防治番茄灰霉病害中的应用。
背景技术
番茄灰霉病是由半知菌亚门真菌、灰葡萄孢菌侵染所致，主要为害花和果实，亦可为害叶片与茎；幼果染病较重，柱头和花瓣多先被侵染，后向果实转移，果实病变多从果柄处向果面扩展，致病果皮呈灰白色、软腐，病部长出大量灰绿色霉层，严重时果实脱落，严重影响着保护地蔬菜尤其是番茄的生产。目前对于番茄灰霉病的防治主要是通过喷洒化学试剂，但是化学农药的大量使用不仅造成了空气、水源、土壤和食物的污染，更重要的是经过化学农药的定向选择使病原菌产生了抗药性，人们迫切希望能够在生物领域寻找到低毒、高效、环境友好的新型农药。植物根围促生细菌(PlantGrowth-Promoting Rhizobacteria，简称PGPR)因为与植物之间具有良好的互利共生关系，不仅能够诱导植物产生抗病性，而且可以促进植物生长、提高作物产量，因而成为倍受瞩目的一类生防细菌，但是目前未见专门用于防治番茄灰霉病的生防细菌的报道。
发明内容
本发明目的在于提供一种对于对半知菌亚门真菌、灰葡萄孢菌等病原菌有显著抑菌效果、并能有效防治番茄灰霉病和促进作物生 长的短小芽孢杆菌。
上述目的是通过如下技术手段实现的：
一种短小芽孢杆菌，分类命名为短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)NMCN1，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏日：2009年11月2日，保藏号：CGMCC No.3377。
短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)NMCN1 CGMCC No.3377，是从西藏纳木错湖湖边泥土中分离，经平板对峙筛选获得。
短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)NMCN1 CGMCC No.3377为革兰氏阳性细菌，杆状，能在10℃生长，是一种低温适生菌，但是不能在50℃生长，能耐受pH5.7和7％NaCl的培养，接触酶试验、V-P试验、柠檬酸盐利用试验、葡萄糖发酵和酪素试验均为阳性，淀粉水解试验、硝酸盐还原试验、厌氧生长试验和丙酸盐利用试验均为阴性。
利用PCR技术扩增短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)NMCN1CGMCC No.3377的16S rDNA序列，获得长度为484bp的片段，将测试结果(如序列表所示)与GenBank中已知的16S rDNA进行同源性比较，发现与Bacillus pumilus GQ911554.1的相似性最高，为99％。
根据菌体的革兰氏染色、菌落的形态特征、菌株的生理生化性质以及16S rDNA序列分析的结果，参照《芽孢杆菌属》(蔡妙英等译，农业出版社，1988年)和《微生物分类学》(张继忠，上海复旦大学出版社，1995年)的检索表进行检索，将该菌株鉴定为 短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，命名为NMCN1。
含有短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)NMCN1 CGMCCNo.3377的菌剂也属于本发明的保护范围。
短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)NMCN1 CGMCC No.3377菌株的应用方法为发酵培养→稀释→喷洒→效果测定。
短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)NMCN1 CGMCC No.3377的发酵培养基组成为：葡萄糖20g/L，L-谷氨酸5g/L，MgSO40.5g/L，KCl 0.5g/L，KH2PO4 1g/L，Fe2SO4·6H2O 0.15mg/L，MnSO4·H2O 5.0mg/L，CuSO4·5H2O 0.16mg/L，其余为过滤水，并调节至pH7.0。
短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)NMCN1 CGMCC No.3377对半知菌亚门真菌、灰葡萄孢菌和酵母菌有显著的抑菌效果，能明显促进番茄的生长。
附图说明
图1为实施例2短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)NMCN1CGMCC No.3377的芽胞图片；
图2为实施例9短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)NMCN1CGMCC No.3377对于真菌酵母菌的抑菌效果图片。
具体实施方式
以下通过具体实施方式进一步描述本发明，由技术常识可知，本发明也可通过其它的不脱离本发明技术特征的方案来描述，因此所有在本发明范围内或等同本发明范围内的改变均被本发明包含。
实施例1：
采用五点取样法，用小铲子除去表土，于5～25mm处采取土样几十克，装入采样袋内，标记好采样时间、地点、植被。称取5g土样，放入45ml生理盐水中，摇床上震荡30分钟，静置使澄清。吸取上清液分别用无菌水稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5五个浓度梯度，80℃水浴10min。吸取200μl涂LB平板，37℃过夜培养。待平板上长出菌落后，挑取单菌落，划线纯化后编号保存。筛选得到短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)NMCN1 CGMCCNo.3377。
实施例2：
对实施例1的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)NMCN1CGMCC No.3377进行形态特征观察和生理生化特征鉴定，结果表明，该菌为革兰氏阳性，杆状，产芽孢(如图1所示)。能在10℃生长，但是不能在50℃生长，能耐受pH5.7和7％NaCl的培养，接触酶试验、V-P试验、柠檬酸盐利用试验、葡萄糖发酵和酪素试验均为阳性，淀粉水解试验、硝酸盐还原试验、厌氧生长试验和丙酸盐利用试验均为阴性。
实施例3：
将实施例1的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)NMCN1CGMCC No.3377接种于液体LB培养基，180rpm，37℃震荡培养10小时，离心收集菌体，悬浮后加入溶菌酶和SDS破壁，采用酚-氯仿法提取基因组DNA。以提取到的总DNA为模板，用正向引物PRB1601(5’-GGATCCTAATACATGCAAGTCGAGCGG-3’)和反 向引物PRB1602(5’-GGATCCACGTATTACCGCGGCTGCTGGC-3’)对菌株的16S rDNA基因进行PCR扩增。PCR条件为：95℃，4min；94℃，1min；50℃，1min；72℃，2min；34cycle；72℃，10min，4℃保存。PCR产物回收以后进行测序，经确认其长度为484bp，测序结果如序列表所示，在GenBank中与Bacillus pumilusGQ911554.1相似性为99％。
实施例4：
培养基：
1C培养基
| 组成成分 | 浓度 | 1×1C | 5×1C |
| 胰蛋白胨 | 0.7 | 4.2g | 21g |
| 氯化钠 | 0.5 | 3g | 15g |
| 大豆木瓜酶水解物 | 0.3 | 1.8g | 9g |
| 终体积 | 600ml | 600ml |
土壤浸出液
主要培养基
| 组成成分 | 终浓度 | 体积(ml) |
| 5×1C | 1× | 50 |
[0031]
| 20％葡萄糖 | 0.1％ | 1.25 |
| 土壤浸出液 | 10％ | 25 |
| 水 | 173.75 |
将实施例1的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)NMCN1CGMCC No.3377接种到上述液体培养基中，37℃培养过夜，取5ul菌液点到距离固体培养基平板中心2.5cm的十字交叉点，每个菌株5个重复，分别放置在4℃、10℃、14℃、18℃、30℃的培养箱中培养，每天记录菌株的生长情况，共记录15天。结果表明，本发明的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)NMCN1 CGMCC No.3377能在温度≤10℃的环境中生长，将在此温度下，能在一周内显现菌落的菌株记为低温生长菌株，得到低温适生短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)NMCN1 CGMCC No.3377。
实施例5：
将实施例1的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)NMCN1CGMCC No.3377接种在LB培养基上，过夜培养，然后将活化的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)NMCN1 CGMCC No.3377转接到Landy培养基中进行摇瓶发酵，温度为30℃，摇床转速为200rpm，发酵时间为38小时，得短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)NMCN1CGMCC No.3377的发酵液。
其中发酵培养基组成为：20g葡萄糖，5g L-谷氨酸，0.5gMgSO4，0.5g KCl，1g KH2PO4，0.15mg Fe2SO4·6H2O，5.0mgMnSO4·H2O，0.16mg CuSO4·5H2O，用过滤水补足至总体积为1L， 调节至pH7.0。
实施例6：
采用平板对峙法，倒好PDA平板，在平板中央放置直径1cm的番茄灰霉病菌菌块，在其四周距离2cm处对称放置四个滤纸片，在滤纸片上打5μl实施例1的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)NMCN1 CGMCC No.3377的菌悬液，重复三次，在25℃光照培养箱中培养5天，结果显示抑菌圈平均直径为18mm，即本发明的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)NMCN1 CGMCC No.3377对于番茄灰霉病菌的抑菌效果显著。
实施例7：
拟南芥种子经次氯酸钠(有效Cl含量为5％)表面消毒后，播种到MS培养基平板(9cm)上，温室培养一周备用。
将实施例4的低温适生短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)NMCN1 CGMCC No.3377接种到LB液体培养基中培养过夜，测定OD值后，将其浓度定量为105cfu/ml，拟南芥种苗用菌液浸根5min后，种到MS平板(20×20cm)上，每个平板4颗苗，每个菌株设置3个重复。温室培养21d，取出平板称量每颗拟南芥的鲜重。阴性对照组为新鲜液体培养基浸根的拟南芥，阳性对照组为FZB42浸根的拟南芥。试验结果：用浓度为105cfu/ml的菌悬液处理的拟南芥平均鲜重为0.01598g，阴性对照组的拟南芥平均鲜重为0.0097g，阳性对照组的拟南芥平均鲜重为0.01598g。即本发明的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)NMCN1 CGMCC No.3377对拟南芥有很好的促生效果。
实施例8：
将实施例4的低温适生短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)NMCN1 CGMCC No.3377接种到LB液体培养基中培养过夜，测定OD值后，将浓度分别定量在107cfu/ml、106cfu/ml、105cfu/ml和104cfu/ml，分别取不同浓度的细胞悬浮液10ml与1％的羧甲基纤维素30ml配制成混合液，备用；将经过表面消毒(75％酒精消毒5min，次氯酸钠(有效Cl含量为5％)消毒5min，灭菌水清洗3～5次)的玉米种子浸泡在前述不同浓度的混合液中，每个浓度10粒种子，三个重复，2h后取出种子过夜吹干，然后放在铺有湿润滤纸的培养皿中，30℃暗处培养；2d后记录萌发种子数，6d后测量种子鲜重，芽长，根长。对照组为用新鲜培养基和粘附剂的混合液浸种。结果表明：用浓度为104cfu/ml的菌悬液处理玉米种子时，芽平均长度为2.66cm，而对照组的芽平均长度为2.3cm；用浓度为107cfu/ml的菌悬液处理玉米种子时根的平均长度为2.533cm，而对照组的芽平均长度为2.3cm。即本发明的短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)NMCN1 CGMCC No.3377对玉米种子萌发的促生作用良好。
实施例9：
将实施例4的低温适生短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)NMCN1 CGMCC No.3377接种到1C培养基中培养8h后，以1∶100的比例转接到10ml的Landy培养基中，发酵约40小时，离心收集上清液，4℃贮藏备用。
将待测真菌菌株酵母菌接种到适宜培养基中培养过夜，测定 OD值后将菌液稀释到107cfu/ml，混合培养基制成含菌平板。待冷却完全后，十字交叉打孔(距平板中心2.5cm)，接种低温适生短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)NMCN1 CGMCC No.3377于Landy培养基发酵上清液。放置室温下培养2d，观察抑菌效果。结果如图2所示，抑菌圈直径为40mm，即本发明的短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)NMCN1 CGMCC No.3377对真菌酵母菌有显著的抑制作用。
实施例10：
番茄种子用清水浸泡2h，于28℃潮湿条件下催芽，播种于装有无菌土壤的花盆中，待番茄苗长到5片真叶的时候，用菌悬液灌根，平均每株番茄苗浇20ml实施例5的短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)NMCN1 CGMCC No.3377菌液(浓度为108cfu/ml)，以后隔3天浇灌该菌液一次，共3次，用清水做对照。两周后抽取10株苗，测定株高、根长和植株鲜重。结果显示，经菌液处理过的番茄苗明显比对照长势好。经测定，株高增加率达37％，根长增加率达到2.6％，鲜重增加率达到129.1％。即本发明的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)NMCN1 CGMCC No.3377菌株对番茄有明显的促生作用。
实施例11：
将实施例5的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)NMCN1CGMCC No.3377的发酵液稀释100倍，在番茄开花前十天开始以喷雾形式喷发酵液，以后每间隔7天喷一次，连续喷3次。对于番茄灰霉病的防治效果可达75％，增加番茄产量12％。即本发明的 短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)NMCN1 CGMCC No.3377能明显抑制番茄灰霉病，并能有效促进番茄生长、增加番茄产量。
序列表
TGAGCGTAGTTGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTG
CGAGCAGTTACTCTCCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTT
ACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAG
GACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTA
GGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTC
TCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCATTACCCCAC
CAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGACAGCCGA
AACCGTCTTTCATCCTTGAACCATGCGGTTCAAGGAACTATCCG
GTATTAGCTCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAG
GTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACATCCGGGAG
CAAGCTCCCTTCTGTCCGCTCGACTTGCATGTATTAGGATCCAA
Claims (7)
1.一种短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)NMCN1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2009年11月2日，保藏号为CGMCC No.3377。
2.根据权利要求1所述的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)NMCN1 CGMCC No.3377，其特征在于，是从西藏纳木错湖湖边泥土中分离，经平板对峙筛选获得。
3.根据权利要求1所述的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)NMCN1 CGMCC No.3377，其特征在于，革兰氏染色阳性，杆状，能产芽孢，能在10℃生长，但是不能在50℃生长，能耐受pH5.7和7％NaCl的培养，接触酶试验、V-P试验、柠檬酸盐利用试验、葡萄糖发酵和酪素试验均为阳性，淀粉水解试验、硝酸盐还原试验、厌氧生长试验和丙酸盐利用试验均为阴性。
4.根据权利要求1所述的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)NMCN1 CGMCC No.3377，其特征在于，其16S rDNA的部分核苷酸序列如序列表所示。
5.权利要求1所述的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)NMCN1CGMCC No.3377的应用方法，其特征在于，包括发酵培养→稀释→喷洒→效果测定四个步骤。
6.根据权利要求5所述的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)NMCN1 CGMCC No.3377的应用方法，其特征在于，所述发酵培养过程中的发酵培养基组成为：葡萄糖20g/L，L-谷氨酸5g/L，MgSO4 0.5g/L，KCl 0.5g/L，KH2PO4 1g/L，Fe2SO4 ·6H2O 0.15mg/L，MnSO4 ·H2O 5.0mg/L，CuSO4 ·5H2O 0.16mg/L，其余为过滤水，并调节至pH7.0。
7.权利要求1～4任意一项的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)NMCN1 CGMCC No.3377在抑制番茄灰霉病菌和促进番茄生长、增加番茄产量中的应用。
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