CN110577904A - 一株短小芽孢杆菌及其在制备葡萄灰霉病杀菌剂中的应用 - Google Patents

一株短小芽孢杆菌及其在制备葡萄灰霉病杀菌剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明具体提供一种短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus sp.）T2 CCTCC No.M2019047。通过从新疆天山冰湖葡萄酒庄葡萄园土壤中筛选、分离出一株编号为T2的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus sp.），通过目前常见的菌种鉴定手段获悉短小芽孢杆菌T2是一株新菌种，并对通过对小芽孢杆菌T2培养获得T2菌悬液，当T2菌悬液浓度在3.2×105CFU/mL以上具有较好的拮抗灰葡萄孢的效果，且随着T2菌液浓度的升高抑菌作用越明显，体现了筛选该菌种具有鲜明的应用价值导向。

Description

一株短小芽孢杆菌及其在制备葡萄灰霉病杀菌剂中的应用
技术领域
本发明涉及微生物菌种及其应用的技术领域，具体的涉及一株短小芽孢杆菌及其在制备葡萄灰霉病杀菌剂中的应用的技术领域。
背景技术
新疆是全国公认的最早种植葡萄、酿酒葡萄的地区，位于新疆境内的天山山脉两侧，是目前中国酿酒葡萄种植面积最大的产区，总面积约为14200公顷。
近年来，葡萄酒因其文化内涵与健康因子越来越受到消费者青睐，新疆葡萄栽培面积不断增大，品种逐年增加，然而随着酿酒葡萄种植规模的日益增大，每年因真菌性病害导致葡萄产量的损失也逐渐增加。据统计，葡萄生产中每年因病害造成的损失约在30％以上，葡萄在生长过程中，会有不同种类的微生物附着到浆果上，引起葡萄的疾病，或者给采后贮藏及酿酒过程造成污染，影响葡萄酒的品质，在酿酒过程中，霉菌除了会引起葡萄酒表层的污染，还会污染设备，尤其是阀门，并散发出非常难闻的气味，遭受假丝酵母污染会产生“酒花病”，在表面上生出一层灰白色或暗黄色的菌膜，引起葡萄酒中乙醇和有机酸的氧化，使酒味变淡，并产生不快的怪味和过氧化味。霉变引起的霉菌毒素可通过原料最终进入葡萄酒中，导致葡萄酒安全的不确定性如：抑制免疫系统、损害肝脏和肾脏、损害神经系统、导致胎儿畸形和引发癌症等。
葡萄灰霉病是葡萄生产中危害最大的病害之一，其病原菌是灰葡萄孢(Botrytiscinerea Pers.)，虽然有高效杀菌剂和先进的贮藏技术，但每年因灰霉病造成的葡萄产后损失最高可达50％，一般损失也在20％～30％，并且严重影响葡萄的品质。长期以来，使用农药杀菌剂是我国酿酒葡萄园栽培管理中常用的控制葡萄果实真菌病害的方法，由于病虫害的逐渐加重，且由于药物的连续作用，也会诱导病原菌产生抗药性从而降低化学杀菌剂的防病效果，对消费者健康和国际贸易都已经产生了深远的影响。实际上，除了影响健康外，葡萄酒作为农业深加工产品，酿酒葡萄上的农药残留在发酵过程中，从果实转移到发酵体系中，会影响酵母的正常生长代谢，抑制酵母的生长或延迟酵母的发酵持续时间等，进而影响到葡萄酒生产。
因此，从源头上监测和控制我国葡萄酒中的农药残留量，是促进葡萄酒市场长期稳定发展的关键。迫切需要新的安全的方法来取代化学杀菌剂的使用，在葡萄灰霉病发生普遍严重的地区，使用拮抗微生物进行生物防治，可以有效减少化学农药的使用，解决农药残留问题，延缓病菌抗药性的产生，特别是在病菌已产生抗药性的地区，使用拮抗微生物，更是抗药性治理的一项有效措施。
现有的国内外专利或非专利文献中都没有披露短小芽孢杆菌抑制葡萄灰霉病的报道，也没有提供一种能够抑制葡萄灰霉病的短小芽孢杆菌菌株，因此需要进一步探究短小芽孢杆菌的特性，提供能够用于抑制葡萄灰霉病的方法，对于微生物利用开发技术领域具有现实意义。
发明内容
针对目前未见通过在新疆天山冰湖葡萄酒庄葡萄园土壤中分离筛选新的短小芽孢杆菌的现状，本发明提供一种新菌种短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)T2及其在制备抑制葡萄灰霉病杀菌剂中的应用。本发明通过从新疆天山冰湖葡萄酒庄葡萄园土壤中分离筛选出一株新的菌种短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)T2 CCTCC No： M2019047，利用分离出的新菌种能够生产抗灰葡萄孢(Botrytis cinerea Pers.)的活性物质，T2菌株对灰霉菌孢子菌悬液最小抑菌浓度为3.2×105CFU/mL，T2菌株对灰霉菌孢子菌悬液最小杀菌浓度为3.2×106CFU/mL，且随着T2菌液浓度的升高抑菌作用越明显，从而抑制葡萄灰霉病，可用于开发成新型高效、低毒、环保的微生物杀菌剂，对于微生物利用开发技术领域具有现实意义。
本发明采用的主要技术方案：
本发明具体提供一种新菌种短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus) T2。通过从新疆天山冰湖葡萄酒庄葡萄园土壤中筛选、分离出优选得到一株编号为T2的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，通过目前常见的菌种鉴定手段获悉短小芽孢杆菌T2是一株新菌种，并对通过对小芽孢杆菌T2培养获得T2菌悬液，当T2菌悬液浓度在 3.2×105CFU/mL以上具有较好的拮抗灰葡萄孢的效果，且随着T2菌液浓度的升高抑菌作用越明显，体现了筛选该菌种具有鲜明的应用价值导向。
具体的，本发明根据新疆独特的地貌、气候环境，通过从新疆天山冰湖葡萄酒庄葡萄园土壤中进行微生物菌种的培养、分离，筛选一批优良菌种，并从中分离筛选出一株编号为T2的短小芽孢杆菌 (Bacillus pumilus)，经微生物学分类与鉴定，属于短小芽孢杆菌属，该菌株最适生长条件为：最适温度37℃、120rpm条件下，在培养基中摇床培养48h，最适生长培养基为改良脑心浸液肉汤培养基。依据《伯杰氏系统细菌学鉴定手册》(第九版)和《常见细菌系统鉴定手册》对编号为T2菌株进行形态学、生理生化试验，确定 T2菌株为异常球菌属中成员，但是具有与常见的短小芽孢杆菌属成员菌种不同的特点，具有一些新菌种的特性。
同时，本发明得到筛选新菌种短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)T2适合的培养基改良脑心浸液肉汤培养基，所述的改良脑心浸液肉汤培养基包括酵母浸粉15g、脱水小牛脑浸粉17.5g、蔗糖10g、磷酸氢二钠2.5g、柠檬酸三钠2.5g、蒸馏水1.0L、pH值 7.2。
进一步，本发明通过对新菌种短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)T2进行基因测序，序列参见附后提供的SEQ ID NO:1所示，所得序列经常见网站进行比对分析，结果发现，菌株T2的16S rRNA基因序列与Bacillus pumilus strain NCTC10337的同源性最高，为97.61％，菌株T2与Bacillus pumilus strain NCTC10337的亲缘关系最近。利用本领域常见采用的MEGA 5.0软件通过Neighbor- Joining方法建立系统进化树，结果经比对分析发现，菌株T2与 Bacillus pumilus strain NCTC10337菌株来源于同一分支的可信度为97％，表明该菌种作为新菌种的支持率极高，在进化树中体现极好的稳定性，经过系列菌种鉴定可知该菌株T2确定其为短小芽孢杆菌 (Bacillus pumilus)新种，具有新菌种鲜明的典型性的特点，从分类学角度暂命名为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)T2。
具体的，该菌株短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)T2已保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。地址：武汉市武汉大学，邮编：430072。保藏日期2019 年1月15日，菌种保藏号为CCTCC No：M2019047。
菌株短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)T2在营养琼脂培养基上，菌落光滑，直径3mm，菌落的颜色为淡黄色，菌落直径大小 3mm，表面光滑、湿润、表面有纹路，边缘不整齐，不透明，光学显微镜(100×10)观察菌体呈细杆状，革兰氏染色呈阳性，孔雀绿染色芽孢近端生，透射电子显微镜观察菌体大小为0.67μm～0.82μm ×0.65μm～1.12μm，细胞以二分裂繁殖，菌体周生鞭毛，芽孢椭圆，在静置改良脑心浸液肉汤液体培养基中菌体沉淀，半固体动力培养基扩散生长，由此可见，菌株T2与常见的短小芽孢杆菌 (Bacillus pumilus sp.)存在一些差异，具有一些新菌种的感官特征。
进一步，本发明提供一种利用短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)T2 CCTCC No:M2019047在制备抑制葡萄灰霉病菌杀菌剂中的应用，应用具体步骤如下：
在无菌环境下挑取短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)T2 CCTCC No:M2019047于发酵液体培养基，在37℃、120rpm摇床培养48h，培养至浓度为3.2×109CFU/mL的T2菌悬液，将T2菌悬液稀释为3×105CFU/mL。
本发明中，所述的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)T2 CCTCC No:M2019047的发酵液体培养基包括胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、蒸馏水1.0L、pH值7.4。进一步，本发明提供的浓度为3.2×105CFU/mL的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus) T2 CCTCC No:M2019047悬稀释液相对具有较好的拮抗灰葡萄孢的效果，且随着T2菌液浓度的升高抑菌作用越明显，具有广泛的应用价值。
通过实施本发明提供上述具体技术方案，实施本发明内容，可以达到以下有益效果：
(1)本发明提供的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)T2 CCTCC No:M2019047是一种典型的新菌种，最适温度37℃、 120rpm条件下，在培养基中摇床培养48h，最适生长培养基为改良脑心浸液肉汤培养基，能够生产抗灰葡萄孢(Botrytis cinerea Pers.)的活性物质的特性，同时具有培养条件简单，繁殖快的特点，确定其为短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus sp.)新种，具有新菌种典型性的特点，从分类学角度暂命名为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)T2。
(2)将本发明分离筛选的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus) T2 CCTCC No：M2019047，通过在37℃、120rpm培养48h，获得 3.2×109CFU/mL的T2菌悬液，当T2菌悬液浓度在3.2×105CFU/mL 以上具有较好的拮抗灰葡萄孢的效果，能够显著减轻葡萄灰霉病病害的发生，T2菌株发酵菌悬液当浓度达到3.2×106CFU/mL时，为 T2菌株发酵菌悬液最小杀菌浓度，对葡萄灰霉病孢子有较强的杀菌作用，且随着T2菌液浓度的升高抑菌作用越明显，从而抑制葡萄灰霉病，可用于开发成新型高效、低毒、环保的微生物杀菌剂，对于微生物利用开发技术领域具有现实意义，具有广泛的应用价值。
附图说明
图1所示为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)T2的16S rDNA 序列建立的N-J系统进化树图。
图2所示为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)T2在NA固体培养基和改良BHI液体培养基中的生长状态形态图，其中，A为T2 菌在NA固体培养基的生长状态形态图，B为T2菌在改良BHI液体培养基中的生长状态形态图。
图3所示为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)T2在光学显微镜下(100×10)革兰氏染色和芽孢染色图，其中，A为T2菌的革兰氏染色图，B为T2菌的芽孢染色图。
图4所示为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)T2在H-600A型扫描电镜结果图，其中，A为T2菌二分裂繁殖图，B为单个菌体图，C为多个菌体图，D为单个菌体周生鞭毛图，E为端生椭圆芽孢图。
图5所示为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)T2菌株的生长曲线图。
图6所示为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)T2菌株的最适培养温度图。
图7所示为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)T2菌株的最适生长pH图。
图8所示为不同浓度的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)T2菌悬液对灰葡萄孢抑制作用图，其中，A为T2菌悬液浓度为 3.2×109CFU/mL，B为T2菌悬液浓度为3.2×108CFU/mL，C为T2 菌悬液浓度为3.2×107CFU/mL，D为T2菌悬液浓度为 3.2×106CFU/mL，E为T2菌悬液浓度为3.2×105CFU/mL。
图9所示为S-570扫描电子显微镜观察不同浓度的短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)T2菌悬液对灰葡萄孢菌丝生长的影响图，其中，A为对照，B为T2菌悬液浓度为3.2×102CFU/mL，C为T2菌悬液浓度为3.2×103CFU/mL，D为T2菌悬液浓度为 3.2×104CFU/mL，E为T2菌悬液浓度为3.2×105CFU/mL。
具体实施方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。本发明中选用的所有原辅材料，以及选用的菌种培养方法都为本领域熟知选用的，本发明中涉及到的％都为重量百分比，除非特别指出除外。
本发明采用的样品：新疆天山冰湖葡萄酒庄葡萄园土壤。
本发明采用的菌种：灰葡萄孢(Botrytis cinerea Pers.)菌株由新疆农业科学院农产品贮藏加工研究所实验室提供。
本发明实施例中采用如下基础培养基：改良脑心浸液肉汤(改良BHI)培养基包括酵母浸粉15g、脱水小牛脑浸粉17.5g、蔗糖 10g、磷酸氢二钠2.5g、柠檬酸三钠2.5g、蒸馏水1.0L、pH值7.0；发酵液培养基包括胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、蒸馏水1.0L、pH值7.4；营养琼脂(NA)培养基包括蛋白胨10g、牛肉膏5g、NaCl5g、蒸馏水1.0L、pH值7.4、琼脂20g；马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基包括马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、蒸馏水1.0L、PH值5.5。马铃薯葡萄糖(PDB)培养基包括马铃薯 200g、葡萄糖20g、蒸馏水1.0L、PH值5.5。
另外，在下述的实施例中，如无特别说明，本发明中选用的所有试剂、原料和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
实施例一：短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)T2的分离、筛选及鉴定
(一)分离、筛选
从新疆天山冰湖葡萄酒庄葡萄园土壤中分离得到。称取1g土壤样品置于无菌离心管里，然后加9mL无菌0.9％的生理盐水和适量玻璃珠，于室温下振荡30min，梯度稀释后，每个梯度吸取0.1mL 稀释液加至NA培养基平板上并涂布，平板置37℃恒温培养。待长出菌落后挑取形状、大小、颜色等不同的菌落分别划线接种于相应的平板，直至无杂菌落。从中优选出一株编号为T2的菌株，保藏待用。
(二)分类、鉴定
1、PCR模板DNA的提取
将纯化后的菌种T2接种到BHI培养基中，37℃、120rpm条件下，摇床培养48h，收集菌体，采用DNA抽提试剂盒提取基因组总 DNA，进行短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)T216S rDNA序列测定与分析。
采用特异性引物：
27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；
1492R:5'-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3'。
采用16SrDNA特异性引物进行目的片段的PCR扩增，PCR反应体系总体积50μL，2×Mix 25uL、正反向引物(10μM)各1uL、菌样模板1uL、ddH2O 22uL，PCR扩增条件为，94℃5min；94℃30s， 54℃30s，72℃1min30s，35个循环；72℃10min，PCR验证后，回收目的片段进行测序。通过对上述T2菌种基因测序，序列参见附后提供的SEQ ID NO:1所示，所得序列经常见的NCBI网站进行比对分析，经比对分析发现，菌株T2的16S rRNA基因序列与Bacilluspumilus strain NCTC10337的同源性最高，为97.61％，菌株T2与 Bacillus pumilusstrain NCTC10337的亲缘关系最近。利用本领域常见采用的MEGA 5.0软件通过Neighbor-Joining方法建立系统进化树，发育树见附图1，结果经比对分析发现，菌株T2与Bacilluspumilus strain NCTC10337菌株来源于同一分支的可信度为97％，表明该菌种作为新菌种的支持率极高，在进化树中体现极好的稳定性，经过系列菌种分子水平鉴定可知该菌株T2确定为短小芽孢杆菌 (Bacillus pumilus sp.)新种，具有新菌种典型性的特点，从分类学角度暂命名为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)T2。
2、生理生化测定
(1)通过生长条件研究结果显示短小芽孢杆菌T2可生长温度为30-45℃之间，最适培养温度为37℃；最适生长培养基为改良脑心浸液肉汤培养基，可在pH6.0-8.0范围内生长，最适pH为7.0。
(2)菌株T2的生理生化特性情况如表1所示。T2菌株VP反应阳性，MR反应阴性，动力培养阳性，明胶液化，硝酸盐还原阳性，无法利用西蒙氏柠檬酸盐、枸橼酸盐、丙二酸盐，发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、甘露醇并且产酸，不能发酵木糖、乳糖和棉子糖，无法水解淀粉，过氧化氢酶、溶菌酶反应阳性。
表1：T2菌株生理生化试验结果
综合16S rDNA序列分析、系统发育分析、微生物学特性分析结果，表明本发明提供的短小芽孢杆菌T2确为异常球菌属的一株细菌新种，将其暂命名为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)T2。该菌于2019年1月15日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。地址：武汉市武汉大学，菌种保藏号为CCTCC No：M2019047。
菌株短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)T2在营养琼脂培养基上，菌落光滑，直径3mm，菌落的颜色为淡黄色，菌落直径大小 3mm，表面光滑、湿润、表面有纹路，边缘不整齐，不透明，如附图2所示；光学显微镜(100×10)观察菌体呈细杆状，革兰氏染色呈阳性，孔雀绿染色芽孢近端生，如附图3所示；透射电子显微镜观察菌体大小为0.67μm～0.82μm×0.65μm～1.12μm，细胞以二分裂繁殖，菌体周生鞭毛，芽孢椭圆，如附图4所示；在静置改良脑心浸液肉汤液体培养基中菌体沉淀，半固体动力培养基扩散生长。
实施例二：短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)T2生物学特性
(1)生长曲线测定
在无菌环境下挑取短小芽孢杆菌T2于BHI培养基，在37℃、 120rpm条件下，活化48h，培养至浓度为3.2×109CFU/mL左右的 T2菌悬液，吸取1mL于l00mL改良BHI培养基中，37℃培养，摇床转速120r/min，从第2h开始用分光光度计在600nm波长下测OD 值，24h以内每2h测一次，将测定的光密度值与其对应的培养时间作图，即可得出该生长条件下的生长曲线，设不接菌培养液为空白对照，结果见附图5，确定菌体生长稳定期为48h。
(2)最适培养温度测定
在无菌环境下挑取短小芽孢杆菌T2于改良BHI培养基，在 37℃、120rpm条件下，活化48h，培养至浓度为3.2×109CFU/mL左右的T2菌悬液，吸取1mL于l00mL改良BHI培养基中，分别于 25℃、28℃、30℃、37℃、40℃摇床培养，转速120r/min，用分光光度计在600nm波长下测OD值，设不接菌培养液为空白对照，结果见附图6，确定最佳培养温度为37℃。
(3)最适pH值测定
在无菌环境下挑取短小芽孢杆菌T2于改良BHI培养基，在 37℃、120rpm条件下，活化48h，培养至浓度为3.2×109CFU/mL左右的T2菌悬液，用1％NaOH或1％HCl，将液体培养基初始pH值分别调节为3.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，11.0，并用酸度计测定其最终pH值。T2菌悬液接种量为1％，37℃、20r/min培养至稳定期，用分光光度计在600nm波长下测OD值，设不接菌培养液为空白对照，结果见附图7，确定pH为7.0。
实施例三：短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)T2在对灰葡萄孢抑菌活性中的应用
(1)不同浓度的短小芽孢杆菌T2菌株对灰葡萄孢抑制作用
在无菌环境下挑取短小芽孢杆菌T2于发酵液体培养基，在3 7℃、120rpm条件下活化48h，培养至浓度为3.2×109CFU/mL的T2 菌悬液，备用；在无菌环境下挑取灰葡萄孢(Botrytis cinerea Pers.) 菌种，接种于PDB液体培养基上25℃摇床培养120h，获得2.3×109 CFU/mL的灰葡萄孢菌悬液，备用。
向以灭菌的PDA培养基平板中接种0.2mL灰葡萄孢菌悬液，涂布均匀后备用，将T2菌悬液稀释为3.2×109CFU/mL、3.2×108CFU/ mL、3.2×107CFU/mL、3.2×106CFU/mL、3.2×105CFU/mL，分别取1 00uL各T2菌悬液稀释液，注入牛津杯中，25℃培养6天，结果见附图8，通过牛津杯法测定抑菌圈直径结果见表2。表明T2菌悬液具有较好的拮抗灰葡萄孢的效果，且随着T2菌液浓度的升高抑菌作用越明显。
表2:不同浓度的T2菌悬液抑菌圈直径
(2)短小芽孢杆菌T2菌株对灰葡萄孢MIC和MBC的确定
将制备的2.33×109CFU/mL灰霉菌孢子菌悬液吸取0.1mL，分别加入到不同浓度的T2发酵液中摇匀，于600nm波长下用分光光度计测定稀释液初始吸光值，然后在水浴振荡器中进行振荡培养，振荡频率50r/min，于37℃培养48h，取出后再在600nm分光光度计下读数，吸光值与初始吸光值相同的试管浓度为稀释液的最低抑菌浓度MIC。把测定完的MIC试管继续在相同条件下培养12h时间，再用分光光度计测定吸光值。吸光值与初始吸光值仍相同的试管浓度为MBC。T2菌株对灰霉菌孢子菌悬液最小抑菌浓度为3.2×105CF U/mL，T2菌株对灰霉菌孢子菌悬液最小杀菌浓度为3.2×106CFU/m L。
(3)扫描电镜观察T2菌株对菌丝生长的影响
将T2菌株在无菌条件下接种到发酵液体培养基中，37℃120r/ min，培养48h即得到T2菌的发酵液，稀释倒平板法计数为3.2×109 CFU/mL，配制不同浓度的发酵液(3.2×109、3.2×108、3.2×107、3.2 ×106、3.2×105、3.2×104、3.2×103、3.2×102CFU/mL)，待用。取1m L不同浓度的T2菌液加入到熔化的25mL PDA培养基中，混匀后制平板，以不加拮抗测试液的PDA培养基为对照。平板涂布2.33×1 09CFU/mL葡萄灰霉病孢子悬液，于25℃培养箱中培养6天，观察生长情况，结果低浓度(102-105CFU/mL)平板有菌丝生长，高浓度平板均未有菌丝生长，挑取经过不同浓度T2菌液处理及对照平板上的边缘菌丝，在扫描电镜下明显看到空白对照，菌丝细长且多密，分支少，间节长孢子繁密，而随着抑菌浓度的升高，菌丝、孢子数量在逐步递减，菌丝变得稀疏、扭曲、变短，当浓度达到3.2×105CF U/mL时，孢子已消失殆尽，如附图9所示，表明3.2×105CFU/mL 浓度以上的T2菌悬液具有较好的拮抗灰葡萄孢的效果，且随着T2 菌液浓度的升高抑菌作用越明显。
根据本实施例结果表明，本发明所述的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)T2经过液体发酵培养，其发酵液中含有抑制葡萄灰霉孢子的物质，能够显著减轻葡萄灰霉病病害的发生，有望开发成为一种新型的防治农作物病害的微生物药剂。
通过上述系列实施例提供的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus) T2 CCTCC No：M2019047是一种典型的新菌种，该菌株最适生长条件为：温度37℃，pH值为7.0-7.2，该菌株发酵菌悬液当浓度达到3.2×105CFU/mL时，其发酵液中含有抑制葡萄灰霉孢子的物质，对葡萄灰霉病孢子有较强的抑制作用，能够显著减轻葡萄灰霉病病害的发生，T2菌株发酵菌悬液当浓度达到3.2×106CFU/mL时，为 T2菌株发酵菌悬液最小杀菌浓度，对葡萄灰霉病孢子有较强的杀菌作用，对于微生物菌种应用技术领域具有广泛的应用价值。
上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举，而由此所延伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
序列表
<110> 夏俊芳
<120> 一株短小芽孢杆菌及其在制备葡萄灰霉病杀菌剂中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1416
<212> DNA
<213> 短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus sp.)
<400> 1
gtcgagcgga cagaagggag cttgctcccg gatgttagcg gcggacgggt gagtaacacg 60
tgggtaacct gcctgtaaga ctgggataac tccgggaaac cggagctaat accggatagt 120
tccttgaacc gcatggttca aggatgaaag acggtttcgg ctgtcactta cagatggacc 180
cgcggcgcat tagctagttg gtggggtaat ggctcaccaa ggcgacgatg cgtagccgac 240
ctgagagggt gatcggccac actgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag 300
cagtagggaa tcttccgcaa tggacgaaag tctgacggag caacgccgcg tgagtgatga 360
aggttttcgg atcgtaaagc tctgttgtta gggaagaaca agtgcgagag taactgctcg 420
caccttgacg gtacctaacc agaaagccac ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat 480
acgtaggtgg caagcgttgt ccggaattat tgggcgtaaa gggctcgcag gcggtttctt 540
aagtctgatg tgaaagcccc cggctcaaca gggtcacggg gttactggga aggaaacttg 600
agtgcagaag aggagagtgg aattccacgt gtagcggtga aatgcgtaga gatgtggagg 660
aacaccagtg gcgaaggcga ctctctggtc tgtaactgac gctgaggagc gaaagcgtgg 720
ggagcgaaca ttaggagacc ttacagtggt ccacgccgta aacgatgagt gctaagtgtt 780
agggggtttc cgccccttag tgctgcagct aacgcattaa gcactccggg gccttacgag 840
ggtaacgcga ctgaaactca aaggaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg 900
gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta ccaggtcttg acatcctctg acaaccctag 960
agatagggct ttcccttcgg ggacagagtg acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt 1020
gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttgatctta gttgccagca 1080
tttagttggg cactctaagg tgactgccgg tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt 1140
caaatcatca tgccccttat gacctgggct acacacgtgc tacaatggac agaacaaagg 1200
gctgcgagac cgcaaggttt agccaatccc ataaatctgt tctcagttcg gatcgcagtc 1260
tgcaactcga ctgcgtgaag ctggaatcgc tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga 1320
atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccac gagagtttgc aacacccgaa 1380
gtcggtgagg taacctttat ggagccagcc gccgaa 1416

Claims (6)

1.一株短小芽孢杆菌（Bacillus pumilussp.）T2，其特征在于，所述的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus sp.）T2的菌种保藏号为CCTCC No.M2019047。
2.如权利要求1所述的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus sp.）T2的基因序列如SEQ IDNO:1所示。
3.如权利要求1所述的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus sp.）T2，其特征在于，短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus sp.）T2最适培养基为改良脑心浸液肉汤培养基含有，酵母浸粉15g、脱水小牛脑浸粉17.5g、蔗糖10g、磷酸氢二钠2.5g、柠檬酸三钠2.5g、蒸馏水1.0L，pH值7.2。
4.如权利要求1所述的一株短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus sp.）T2在抑制葡萄灰霉病中的应用。
5.如权利要求4所述的一株短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus sp.）T2在抑制葡萄灰霉病中的应用，其特征在于，在无菌环境下挑取短小芽孢杆菌T2于发酵液体培养基，在37℃、120rpm摇床培养48h，培养至浓度为3.2×109CFU/mL的T2菌悬液，将T2菌悬液稀释为3.2×105CFU/mL。
6.如权利要求4所述的一株短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus sp.）T2在抑制葡萄灰霉病中的应用，其特征在于，发酵液体培养基胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、蒸馏水1.0L、pH值7.4。
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