CN116121104A - 一株贝莱斯芽孢杆菌及其应用、雪茄防霉剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)及其应用、雪茄防霉剂，属于微生物领域。本发明从CX‑81雪茄烟叶中分离筛选到1株贝莱斯芽孢杆菌DY‑7，其对黑曲霉(Aspergillus niger)、绳状篮状菌(Talaromyces funiculosus)、云南木霉(Trichodermayunnanense)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)均有显著的拮抗作用，为雪茄烟霉变生防控制相关研究提供了新的微生物资源。
Description
技术领域
本发明涉及一株贝莱斯芽孢杆菌及其应用、雪茄防霉剂，属于微生物领域。
背景技术
烟草行业的税额每年都占国家税收相当大的比例，而烟草品质的优劣关系到烟草行业的发展，进而对国计民生有着一定的影响(参见文献：周家喜.不同仓储环境微生物群落对烟叶陈化品质的影响[D].贵州大学,2017)。国产雪茄烟作为烟草行业高质量发展的一个重要领域，已经成为新的焦点。
然而，随着国产雪茄烟的快速发展，生产规模不断扩大，在实际生产过程中霉变频次也日益增高，制约着国产雪茄烟的高质量发展。雪茄烟叶内含物质丰富，在适宜的环境下，霉变微生物极易滋生，霉变现象尤为多发于生产加工和养护存储等环节，给雪茄烟生产和销售带来巨大的损失。部分霉菌定殖增长后，会向烟叶中分泌各种霉菌毒素和过敏素，引起人类哮喘和过敏性肺泡等疾病，此外，传播到空气中的大量霉菌孢子会导致空气污染，严重影响人类的生活和健康(参见文献：Vesper Stephen,Wymer Larry.The relationshipbetween environmental relative moldiness index values and asthma[J].International Journal of Hygiene and Environmental Health,2016,219(3))。
雪茄烟的防霉非常困难，常规的化学防霉剂对雪茄烟的品吸特性易造成不良影响，且易产生残留，应用非常有限，且物理防霉所采用的辐射、臭氧、密封降氧等技术，均在不同程度上存在防霉效果低、雪茄烟感官品质下降或遭到破坏等问题。生物防霉是利用防霉微生物或防霉代谢物对霉菌进行抑制或杀死，进而达到防霉效果的霉变防控方法，是目前极具广阔发展前景的一种方法。利用烟叶表面的有益微生物进行防霉，具有成本低、使用方便、对烟叶影响小等特点。然而当前暂无雪茄烟霉变生防控制相关研究。因此，筛选具有高效抗菌活性的菌株将具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一株贝莱斯芽孢杆菌，该贝莱斯芽孢杆菌可以高效的拮抗多种霉菌。
本发明还提供了上述贝莱斯芽孢杆菌在抑制烟草霉菌方面的应用，可以广泛应用于雪茄烟防霉领域。
本发明还提供了一种雪茄防霉剂，其能够抑制雪茄烟中多种霉菌的生长。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，该菌株为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)DY-7，保藏编号为CCTCC NO：M 2022906。
本发明从CX-81雪茄烟叶中分离筛选到一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)DY-7，其对多种霉菌都有高效的拮抗作用，可以在烟草防霉中应用。
贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)在抑制烟草霉菌方面的应用。
贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)DY-7可以高效的拮抗多种霉菌，可以应用于烟草防霉菌污染领域。
优选地，所述烟草为雪茄烟烟草。
优选地，所述霉菌为黑曲霉和/或绳状篮状菌和/或云南木霉和/或产黄青霉。
进一步优选地，在雪茄烟烟草中喷洒贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)DY-7菌液。
进一步优选地，8～10g雪茄烟烟草需使用(6～8)×109CFU贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)DY-7。
一种雪茄防霉剂，该防霉剂包括生防菌和辅料，所述生防菌为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)DY-7，保藏编号为CCTCC NO：M 2022906。
本发明中的贝莱斯芽孢杆菌DY-7能够在雪茄烟中高效拮抗多种霉菌，因此可以添加其他辅料作为雪茄防霉剂使用。
附图说明
图1为本发明实施例2中菌株菌落形态图；
图2为本发明实施例2中菌株革兰氏染色后显微形态图(目镜10倍、物镜100倍油镜)；
图3为本发明实施例2中基于16S rDNA基因序列构建的系统发育树；
图4为本发明实施例3中菌株抗菌结果图；
图5为本发明实施例4中菌株在雪茄烟中防霉效果图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此；若无特殊说明，实施例中所用的各类试剂、仪器等均为市售商品。
下述实施例及试验例中涉及到的部分生物材料、实验试剂、实验设备等情况简要介绍如下：
生物材料：
雪茄烟烟叶，来源于湖北宜昌CX-81雪茄烟品种。
菌株：黑曲霉、绳状篮状菌、云南木霉、产黄青霉，分离自湖北宜昌CX-81发酵前雪茄烟叶。
培养基：
LB固体培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10；琼脂15。
LB液体培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10。
沙氏固体培养基(g/L)：蛋白胨10，葡萄糖40；琼脂15。
一、一株贝莱斯芽孢杆菌
一株贝莱斯芽孢杆菌，该菌株为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)DY-7，保藏编号为CCTCC NO：M 2022906；保藏日期：2022年6月16日；保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。
本发明筛选得到的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)DY-7可以在温度30～37℃，PH6.8～7.2正常生长，最适生长温度37℃，pH 7.2。
实施例1贝莱斯芽孢杆菌DY-7的分离、筛选
取湖北宜昌CX-81雪茄烟品种1g，加入装有9mL无菌水的灭菌试管中，用棉塞封口，振荡2min，于水浴锅中80℃加热15min，定向筛选排除其他非芽孢杆菌菌种，静置冷却后，吸取上清液0.1mL稀释10-1～10-4，将10-2、10-4梯度稀释液分别涂布在LB固体培养基平板上，37℃培养12h。挑取平板上的单菌落分别进行纯化，得到进一步纯化的单菌落，将所得芽孢杆菌单菌落分别编号作进一步研究。将初筛所得菌株接种于LB液体发酵培养基中，于180rpm，37℃培养12h左右，得最适浓度在108CFU/mL，即得芽孢杆菌菌液。采用牛津杯法对分离菌株对从雪茄烟叶中分离得到的致霉能力较强的不同霉菌(黑曲霉、绳状篮状菌、云南木霉、产黄青霉)的拮抗能力进行筛选，并测量记录牛津杯周围出现的抑菌圈直径，挑选直径大、抑菌广谱性强的菌株进一步研究。即得到可以高效拮抗真菌黑曲霉、绳状篮状菌、云南木霉、产黄青霉的菌株DY-7。
实施例2菌株DY-7的鉴定
1、形态学鉴定
将上述筛选获得的DY-7接种到LB固体培养基平板上，于37℃培养12h后观察菌落形态。结果如图1、图2所示，菌株DY-7的菌体短杆状，革兰氏染色阳性，芽孢近似圆形，偏端生。在LB固体培养基上菌落扁平，表面粗糙，边缘不整齐，菌苔表面无光泽，不透明，蔓延。
2、分子生物学鉴定
用提取的菌体DNA为模版，采用细菌通用引物通过PCR反应扩增菌体的16S rDNA片段。
详细步骤如下：
菌株DY-7的16S rDNA基因片段经PCR扩增、纯化回收后完成DNA测序工作。将测得的序列用NCBI的Blastn程序进行序列相似性分析，从Genbank数据库和核糖体数据库选取相近种属的代表性菌株的16S rDNA基因序列，通过MEGA 6.0软件进行系统发育分析，用邻接法(Neighbor Joining)构建基于16S rDNA基因序列的系统发育树，用于检验自举支持率(Bootstrap)的重复抽样次数为1000次。纯化后的产物测序委托北京擎科生物技术公司测序，测序所得菌株DY-7的16S rDNA基因序列有1479个碱基，同源性分析结果显示菌株DY-7的16S rDNA基因序列与贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis WGB11的16S rDNA(KY962336.1)相似性达99.79％，且通过MEGA 6.0软件构建系统发育树，系统进化树如图3所示。由图3可以看出菌株DY-7属于贝莱斯芽孢杆菌进化枝。结合形态学特点和16S rDNA基因序列分析，该菌株被鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，命名为贝莱斯芽孢杆菌DY-7，已于2022年6月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2022906。
二、贝莱斯芽孢杆菌在抑制烟草霉菌方面的应用
本发明通过牛津杯抑菌实验，检测贝莱斯芽孢杆菌DY-7对霉菌为黑曲霉、绳状篮状菌、云南木霉和产黄青霉的抑菌效果；通过向雪茄烟烟叶分别喷洒霉菌孢子及贝莱斯芽孢杆菌DY-7菌液，培养后，观察拮抗效果。证明贝莱斯芽孢杆菌DY-7对所述霉菌表现出高效的拮抗效果。
实施例3贝莱斯芽孢杆菌DY-7抗菌活性分析
1、霉菌孢子悬浮液制备
从4℃冰箱保藏的黑曲霉、绳状篮状菌、云南木霉和产黄青霉沙氏固体培养基斜面上分别挑取菌落转接至装有50mL沙氏固体培养基的100mL锥形瓶，28℃恒温使其生长6d后，待表面长满菌落，向锥形瓶中加入无蒸馏水12-15mL，用无菌接种环在培养基与菌体生长表面轻微刮取，紧接着将含有菌丝和孢子的液体一并倒入提前塞好无菌脱脂棉的一次性注射器，缓慢推动并收集不含菌丝的滤液，将滤液收集至10mL无菌离心管中，吸取约10μL孢子悬浮液滴在血细胞计数板，生物显微镜下计数观察调整至实验室所需的104CFU/mL的黑曲霉、绳状篮状菌、云南木霉和产黄青霉孢子浓度。若浓度过大则无菌水稀释至所需浓度，浓度过小可离心浓缩。
2、牛津杯抑菌实验：
贝莱斯芽孢杆菌DY-7单菌落接入LB种子液培养基中，37℃、180rpm培养12h左右，菌液浓度达到108CFU/mL。将10mL沙氏培养基100μL霉菌孢子悬浮液(104CFU/mL)混合加入直径为9mm的一次性培养皿作为第一层，随后用灭菌后的镊子夹取无菌牛津杯放置该层，待再次倒入的沙氏培养基凝固后移出牛津杯。将108CFU/mL的100μL贝莱斯芽孢杆菌菌液加入每个琼脂孔中。于28℃，培养5d后观察抑菌圈大小。
以同批次筛选中具有抗菌活性的贝莱斯芽孢杆菌为对照菌，抑菌圈大小如表1和图4所示。结果表明，与对照菌相比贝莱斯芽孢杆菌DY-7对黑曲霉、绳状篮状菌、云南木霉、产黄青霉的抑制活性均显著提高，说明本发明筛选出的贝莱斯芽孢杆菌DY-7对烟草霉变中几种主要霉菌具有良好的拮抗效果。
表1菌株DY-7对不同霉菌的抑菌圈大小
实施例4贝莱斯芽孢杆菌DY-7在雪茄烟中的防霉效果分析
1、菌种活化
将冷冻保藏的菌种，接种到LB固体培养基，刮取菌苔接在LB液体培养基中37℃、180rpm、12h培养，使其活化。
2、种子液培养
将活化的种子转接到三角瓶液体种子培养基中(含蛋白胨10g/L、酵母浸出物5g/L、NaCl10g/L、pH 7.0)，37℃，180rpm培养14-16h至对数生长中期，得最适浓度在108CFU/mL，即得贝莱斯芽孢杆菌DY-7菌液。
3、雪茄烟中防霉实验
将雪茄烟烟叶剪碎成宽1cm、长6cm左右的雪茄烟烟叶碎片。分别称取5.7g雪茄烟叶于250mL锥形瓶中，对其用灭菌喷壶在每个瓶口依次喷洒1.0mL 2×104CFU/mL黑曲霉、绳状篮状菌、云南木霉、产黄青霉的孢子悬浮液，2h后，分别喷洒4.0mL不同浓度的B.velezensis DY-7菌悬液(107CFU/mL、108CFU/mL、109CFU/mL)，对照组喷洒4.0mL无菌蒸馏水，在28℃恒温培养箱下放置4d，观察拮抗效果。雪茄烟的防霉效果如图5所示。由图中可以看出对照组、107CFU/mL、108CFU/mL的B.velezensis DY-7处理组中烟草均不同程度被霉菌侵染，烟草表面霉菌感染范围大，有肉眼可见的绒毛，且散发出霉臭味，相比于对照组低浓度B.velezensis DY-7对烟草的拮抗能力弱。而在109CFU/mL的B.velezensis DY-7高浓度组中无肉眼可见的霉菌生长，具有正常的烟草味，表现出了最佳的拮抗功能。
三、一种雪茄防霉剂
一种雪茄防霉剂包括生防菌和辅料，所述生防菌为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)DY-7，保藏编号为CCTCC NO：M 2022906。辅料可以为水或常规制剂中使用的辅料。
Claims (7)
1.一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，其特征在于：所述菌株为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)DY-7，保藏编号为CCTCC NO：M 2022906。
2.如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)在抑制烟草霉菌方面的应用。
3.根据权利要求2所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)的应用，其特征在于：所述烟草为雪茄烟烟草。
4.根据权利要求2所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)的应用，其特征在于：所述霉菌为黑曲霉和/或绳状篮状菌和/或云南木霉和/或产黄青霉。
5.根据权利要求3所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)的应用，其特征在于：包括如下步骤：在雪茄烟烟草中喷洒贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)DY-7菌液。
6.根据权利要求5所述的莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)的应用，其特征在于：8～10g雪茄烟烟草使用(6～8)×109CFU贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)DY-7。
7.一种雪茄防霉剂，其特征在于：包括生防菌和辅料，所述生防菌为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)DY-7，保藏编号为CCTCC NO：M 2022906。
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