CN116121103A - 一株解淀粉芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一株解淀粉芽孢杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株解淀粉芽孢杆菌及其应用，属于微生物领域。本发明从烟叶中分离筛选到1株解淀粉芽胞杆菌DY‑9，保藏编号为CCTCC NO：M 2022907，该解淀粉芽孢杆菌可有效拮抗黑曲霉(Aspergillus niger)、绳状篮状菌(Talaromyces funiculosus)、云南木霉(Trichoderma yunnanense)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、聚多曲霉(Aspergillussydowii)，应用于烟草防霉领域；又可高效拮抗禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)，同时降解呕吐毒素，广泛应用于食品防霉领域。

Description

一株解淀粉芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株解淀粉芽孢杆菌及其应用，属于微生物领域。
背景技术
烟草是我国重要的栽培植物，除能制成烤烟、旱烟、斗烟、雪茄烟等供人吸食外，还有多种医疗用途。而霉变一直以来都是困扰烟草行业的棘手问题。自然界中霉变微生物具有种类多、分布广、繁殖力和潜伏性强等特点，因此在烟草生产和加工的各个环节均存在霉变风险(参见文献：周家喜.不同仓储环境微生物群落对烟叶陈化品质的影响[D].贵州大学,2017)。另一方面，烟叶又可以为霉菌的生长提供必要的基质条件，如葡萄糖、蛋白质、有机酸等，当烟叶处于适宜的温湿度条件下时，微生物就可以利用其中的营养物质迅速生长繁殖致使烟叶发霉，引起烟叶质量的降低，造成优质烟叶资源浪费及巨大经济损失，还有可能产生霉菌毒素而直接影响烟叶的质量安全性(参见文献：陈善义,李菁菁,林俭,包可翔,范坚强,张瑞强,陈义强,陈少滨,何伟.基于高通量测序的不同产地和部位自然醇化片烟真菌群落结构分析[J].烟草科技,2018,51(04):12-19.)。因此，控制烟草霉变损失，不仅是经济上的需要，也是控制霉菌污染、保护环境和人类健康的需要。
因引起霉变的霉菌具有种类多、繁殖力强、繁殖方式多样等特点，传统的化学和物理霉变防控技术手段很难发挥理想的效果。化学防霉如对烟叶喷洒化学农药容易造成烟叶的农药残留，持续施加化学农药还会引发霉菌的抗药性，从而影响卷烟和雪茄烟的安全，所得低质量烟叶也不利于其出口。物理防霉法包括紫外线、臭氧、辐射等，均会产生防霉效果低、感官品质下降或遭到破坏等问题，并且其局限性较大，很难取得预期的理想效果。随着人们对生态环境保护意识的不断提高和生物技术的飞速发展，防霉的研究热点已转向具有环保、安全、高效且无污染等特点的生物抗霉方法。但目前对烟草中防霉菌株的报道非常少且已报道的菌株防霉能力仍需加强。因此，筛选具有高效抗菌活性的菌株将具有重要的意义。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的是提供一株可高效拮抗多种霉菌的解淀粉芽孢杆菌。
本发明的第二个目的是提供了上述解淀粉芽孢杆菌在抑制烟草中霉菌方面的应用，为烟草生物防霉提供了一种新的微生物资源。
本发明的第三个目的是提供了上述解淀粉芽孢杆菌在抑制禾谷镰刀菌方面的应用。
本发明的第四个目的是提供了上述解淀粉芽孢杆菌在降解呕吐毒素方面的应用。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，该菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)DY-9，保藏编号为CCTCC NO：M 2022907。
本发明从湖北宜昌CX-81雪茄烟叶中分离筛选到一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)DY-9，其对多种霉菌都有高效的拮抗作用，可以应用在抑制烟草霉菌方面。
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)在抑制烟草中霉菌方面的应用。
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)DY-9在卷烟和雪茄烟中高效拮抗黑曲霉、绳状篮状菌、云南木霉、产黄青霉、聚多曲霉，对烟草防霉研究提供一种新的微生物资源。
优选地，所述烟草为卷烟烟草和雪茄烟烟草。
优选地，所述霉菌为黑曲霉和/或绳状篮状菌和/或云南木霉和/或产黄青霉和/或聚多曲霉。
进一步优选地，在所述烟草中喷洒解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)DY-9菌液。
进一步优选地，8～10g烟草需使用(6～8)×109CFU解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)DY-9。
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)被广泛应用于食品，如小麦、水果等的防霉菌污染中。因此，本发明在验证DY-9对烟草霉变主要的霉菌的拮抗作用同时，也验证了其对禾谷镰刀菌的拮抗作用。
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)在抑制禾谷镰刀菌方面的应用。
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)在降解呕吐毒素方面的应用。
优选地，所述降解呕吐毒素为降解粮食、水果中的呕吐毒素。
附图说明
图1为本发明实施例2中菌株菌落形态图；
图2为本发明实施例2种菌株革兰氏染色后显微形态图(目镜10倍、物镜100倍油镜)；
图3为本发明实施例2中基于16S rDNA基因序列构建的系统发育树；
图4为本发明实施例3、实施例5中菌株抗菌结果图；
图5为本发明实施例4中菌株在卷烟中防霉效果图；
图6为本发明实施例4中菌株在雪茄烟中防霉效果图；
图7为本发明实验例1中菌株在苹果中防霉效果图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此；若无特殊说明，实施例中所用的各类试剂、仪器等均为市售商品。
下述实施例及试验例中涉及到的部分生物材料、实验试剂、实验设备等情况简要介绍如下：
生物材料：
雪茄烟烟叶，来源于湖北宜昌CX-81雪茄烟品种。
菌株：黑曲霉、绳状篮状菌、云南木霉、产黄青霉、聚多曲霉，分离自湖北宜昌CX-81发酵前雪茄烟叶；禾谷镰刀菌分离自市售苹果。
培养基：
LB固体培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10；琼脂15。
LB液体培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10。
沙氏固体培养基(g/L)：蛋白胨10，葡萄糖40；琼脂15。
一、一株解淀粉芽孢杆菌
一株解淀粉芽孢杆菌，该菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)DY-9，保藏编号为CCTCC NO：M 2022907；保藏日期：2022年6月16日；保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。
本发明筛选得到的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)DY-9可以在温度30～37℃，PH 6.8～7.2正常生长，最适生长温度37℃，pH 7.2。
实施例1解淀粉芽孢杆菌DY-9的分离、筛选
取湖北宜昌CX-81雪茄烟叶1g，加入装有9mL无菌水的灭菌试管中，用棉塞封口，振荡2min，于水浴锅中80℃加热15min，定向筛选排除其他非芽孢杆菌菌种，静置冷却后，吸取上清液0.1mL稀释10-1～10-4，将10-2、10-4梯度稀释液分别涂布在LB固体培养基平板上，37℃培养12h。挑取平板上的单菌落分别进行纯化，得到进一步纯化的单菌落，将所得芽孢杆菌单菌落分别编号作进一步研究。将初筛所得菌株接种于LB液体发酵培养基中，于180rpm，37℃培养12h左右，得最适浓度在108CFU/mL，即得芽孢杆菌菌液。采用牛津杯法对分离菌株对不同霉菌的拮抗能力进行筛选，并测量记录牛津杯周围出现的抑菌圈直径，挑选直径大、抑菌广谱性强的菌株进一步研究。获得了6株具有高效拮抗霉菌且抑菌广谱性强的菌株，进一步对该6株菌株进行降解呕吐毒素能力的筛选。将复筛所得到的菌株接种于LB液体培养基中，于180rpm，37℃培养12h左右，得最适浓度(即得芽孢杆菌菌液)在108CFU/mL时最为显著。称取8g霉变麸皮和12g水，121℃灭菌后加入1.5mL芽孢杆菌菌液，于37℃培养48h。测定芽孢杆菌降解呕吐毒素效果的方法采用呕吐毒素检测试剂盒完成。即得到可以高效拮抗真菌(禾谷镰刀菌、黑曲霉、绳状篮状菌、云南木霉、产黄青霉、聚多曲霉)又可高效降解呕吐毒素的菌株DY-9。
实施例2菌株DY-9的鉴定
1、形态学鉴定
将上述筛选获得的DY-9接种到LB固体培养基平板上，于37℃培养12h后观察菌落形态。结果如图1、图2所示，菌株DY-9的菌体短杆状，革兰氏染色阳性，芽孢近似圆形，偏端生。在LB固体培养基上菌落扁平，表面粗糙，边缘不整齐，菌苔表面无光泽，不透明，蔓延。
2、分子生物学鉴定
用提取的菌体DNA为模版，采用细菌通用引物通过PCR反应扩增菌体的16S rDNA片段。详细步骤如下：
菌株DY-9的16S rDNA基因片段经PCR扩增、纯化回收。完成DNA测序工作后将测得的序列用NCBI的Blastn程序进行序列相似性分析，从Genbank数据库和核糖体数据库选取相近种属的代表性菌株的16S rDNA基因序列，通过MEGA 6.0软件进行系统发育分析，用邻接法(Neighbor Joining)构建基于16S rDNA基因序列的系统发育树，用于检验自举支持率(Bootstrap)的重复抽样次数为1000次。纯化后的产物进行测序，测序所得菌株DY-9的16SrDNA基因序列有1484个碱基，同源性分析结果显示菌株DY-9的16S rDNA基因序列与解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens WG8的16S rDNA(KY085968.1)的相似性达99.93％，且通过MEGA 6.0软件构建系统发育树，系统进化树如附图3所示，显示菌株DY-9属于解淀粉芽孢杆菌。结合形态学特点和16S rDNA基因序列分析，该菌株被鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，命名为解淀粉芽孢杆菌DY-9，已于2022年6月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2022907。
二、解淀粉芽孢杆菌在抑制烟草中霉菌方面的应用
本发明通过牛津杯抑菌实验，检测解淀粉芽孢杆菌DY-9对黑曲霉、绳状篮状菌、云南木霉、产黄青霉和聚多曲霉的抑菌效果；通过向卷烟烟丝和雪茄烟烟叶分别喷洒霉菌孢子及解淀粉芽孢杆菌DY-9菌液，培养后，观察拮抗效果。证明解淀粉芽孢杆菌DY-9对所述霉菌表现出高效的拮抗效果。
实施例3解淀粉芽孢杆菌DY-9抗黑曲霉、绳状篮状菌、云南木霉、产黄青霉和聚多曲霉活性分析
1、霉菌孢子悬浮液制备
从4℃冰箱保藏的黑曲霉、绳状篮状菌、云南木霉、产黄青霉和聚多曲霉的沙氏固体培养基斜面上分别挑取菌落转接至装有50mL沙氏固体培养基的100mL锥形瓶，28℃恒温使其生长6d后，待表面长满菌落，向锥形瓶中加入无蒸馏水12-15mL，用无菌接种环在培养基与菌体生长表面轻微刮取，紧接着将含有菌丝和孢子的液体一并倒入提前塞好无菌脱脂棉的一次性注射器，缓慢推动并收集不含菌丝的滤液，将滤液收集至10mL无菌离心管中，吸取约10μL孢子悬浮液滴在血细胞计数板，生物显微镜下计数观察调整至实验室所需的104CFU/mL的黑曲霉、绳状篮状菌、云南木霉、产黄青霉和聚多曲霉孢子浓度。若浓度过大则无菌水稀释至所需浓度，浓度过小可离心浓缩。
2、牛津杯抑菌实验：
解淀粉芽孢杆菌DY-9单菌落接入LB种子液培养基中，37℃、180rpm培养12h左右，菌液浓度达到108CFU/mL。将10mL沙氏培养基100μL霉菌孢子悬浮液(104CFU/mL)混合加入直径为9mm的一次性培养皿作为第一层，随后用灭菌后的镊子夹取无菌牛津杯放置该层，待再次倒入的沙氏培养基凝固后移出牛津杯。将108CFU/mL的100μL解淀粉芽孢杆菌菌液加入每个琼脂孔中。于28℃，培养5d后观察抑菌圈大小。
以实验室前期保藏的具有抗菌活性的解淀粉芽孢杆菌LX-12(保藏编号：CCTCCNO：M 2015234)为对照菌，抑菌圈大小如表1和图4所示。结果表明，与对照菌相比解淀粉芽孢杆菌DY-9对黑曲霉、绳状篮状菌、云南木霉、产黄青霉、聚多曲霉的抑制活性均显著提高。
表1菌株DY-9对不同霉菌的抑菌圈大小
实施例4解淀粉芽孢杆菌DY-9在卷烟和雪茄烟中的防霉应用
1、菌种活化
将冷冻保藏的菌种，接种到LB固体培养基，刮取菌苔接在LB液体培养基中37℃、180rpm、12h，使其活化。
2、种子液培养
将活化的种子转接到三角瓶液体种子培养基中，37℃，180rpm培养14-16h至对数生长中期，得最适浓度在108CFU/mL，即得解淀粉芽孢杆菌DY-9菌液。
3、卷烟和雪茄烟中防霉实验
将雪茄烟烟叶剪碎成宽1cm、长6cm左右的雪茄烟烟叶碎片。分别称取8.5g卷烟成品烟丝和雪茄烟叶于250mL锥形瓶中，对其用喷壶在瓶口喷洒1mL 2×104CFU/mL黑曲霉、绳状篮状菌、云南木霉、产黄青霉、聚多曲霉孢子悬浮液，2h后，分别喷洒6mL不同浓度的B.amyloliquefaciens DY-9菌悬液(107CFU/mL、108CFU/mL、109CFU/mL)，对照组喷洒6mL无菌蒸馏水，在28℃恒温培养箱下放置4d，观察拮抗效果。卷烟的防霉效果如图5所示，雪茄烟叶的防霉效果如图6所示。在对照组、107CFU/mL、108CFU/mL的B.amyloliquefaciens DY-9处理组中烟草均不同程度被霉菌侵染，烟草表面霉菌感染范围大，有肉眼可见的绒毛，且散发出霉臭味，相比于对照组低浓度B.amyloliquefaciens DY-9对烟草的拮抗能力弱。而在109CFU/mL的B.amyloliquefaciens DY-9高浓度组中无肉眼可见的霉菌生长，具有正常的烟草味，表现出了最佳的拮抗功能。
三、解淀粉芽孢杆菌在抑制禾谷镰刀菌方面的应用
本发明通过牛津杯抑菌实验，检测解淀粉芽孢杆菌DY-9对禾谷镰刀菌的抑菌效果；通过向苹果喷洒禾谷镰刀菌孢子悬浮液及解淀粉芽孢杆菌DY-9菌液，证明解淀粉芽孢杆菌DY-9对禾谷镰刀菌表现出高效的拮抗效果。
实施例5解淀粉芽孢杆菌DY-9抗禾谷镰刀菌活性分析
具体实施步骤如实施例3所述，以实验室前期保藏的具有抗菌活性的解淀粉芽孢杆菌LX-12(保藏编号：CCTCC NO：M 2015234)为对照菌，抑菌圈大小如表2和图4所示。结果表明，与对照菌相比解淀粉芽孢杆菌DY-9对禾谷镰刀菌表现出高效的拮抗作用。
表2菌株DY-9对禾谷镰刀菌的抑菌圈大小
实验例1解淀粉芽孢杆菌DY-9抑制苹果中禾谷镰刀菌
苹果经蒸馏水清洗后，用0.1％次氯酸钠浸润消毒，并用蒸馏水冲洗晾干。用无菌打孔器打孔，在伤口部位注入30μL不同浓度的解淀粉芽孢杆菌DY-9菌悬液(106CFU/mL、107CFU/mL、108CFU/mL、109CFU/mL)，对照组注入30μL无菌蒸馏水，2h后，同样的位置注入2×104CFU/mL禾谷镰刀菌孢子悬浮液，在28℃下放置5d。结果如图7所示，109CFU/mL的解淀粉芽孢杆菌DY-9菌悬液对苹果中禾谷镰刀菌的实际应用效果最好，能有效抑制苹果发霉。
四、解淀粉芽孢杆菌DY-9降解呕吐毒素方面的应用
本发明通过呕吐毒素检测试剂盒检测解淀粉芽孢杆菌DY-9对呕吐毒素的降解作用，证明解淀粉芽孢杆菌DY-9对霉变麸皮中的呕吐毒素具有高效的降解作用。
实施例6解淀粉芽孢杆菌DY-9降解呕吐毒素能力分析
将解淀粉芽孢杆菌DY-9接种于LB液体培养基中，于180rpm，37℃培养12h左右，得最适浓度在108CFU/mL，即得芽孢杆菌菌液。称取8g霉变麸皮和12g水，121℃灭菌后加入1.5mL芽孢杆菌菌液，以加入1.5mL的无菌蒸馏水作为空白对照，于37℃培养48h。测定芽孢杆菌降解呕吐毒素效果的方法采用呕吐毒素检测试剂盒完成。呕吐毒素降解率根据如下公式计算获得：呕吐毒素降解率＝100％×(空白-样品)/空白。结果显示，解淀粉芽孢杆菌DY-9对麸皮中呕吐毒素的降解率达到73％，说明解淀粉芽孢杆菌DY-9具有高效的降解麸皮中呕吐毒素的能力。

Claims (9)

1.一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，其特征在于：所述菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)DY-9，保藏编号为CCTCC NO：M 2022907。
2.如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)在抑制烟草中霉菌方面的应用。
3.根据权利要求2所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的应用，其特征在于：所述烟草为卷烟烟草和/或雪茄烟烟草。
4.根据权利要求2所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的应用，其特征在于：所述霉菌为黑曲霉和/或绳状篮状菌和/或云南木霉和/或产黄青霉和/或聚多曲霉。
5.根据权利要求3所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的应用，其特征在于：在所述烟草中喷洒解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)DY-9菌液。
6.根据权利要求5所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的应用，其特征在于：8～10g烟草需使用(6～8)×109CFU解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)DY-9。
7.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)在抑制禾谷镰刀菌方面的应用。
8.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)在降解呕吐毒素方面的应用。
9.根据权利要求8所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的应用，其特征在于：所述降解呕吐毒素为降解粮食、水果中的呕吐毒素。
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