CN114908009A - 一株口粘液乳杆菌pr63及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株口粘液乳杆菌（Limosilactobacillus oris）PR63及其应用，所述口粘液乳杆菌（Limosilactobacillus oris）PR63于2022年4月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.24641。本发明的口粘液乳杆菌PR63对多种抗生素敏感，可以促进童鸽生长发育；能够显著提高血清中免疫球蛋白含量、抗氧化指标，从而促进家禽免疫能力及氧化应激水平，具有重要的发育学研究价值和实践养殖意义，该菌可以开发成促进生长，提高免疫功能及抗氧化应激能力的益生菌制剂。

Description

一株口粘液乳杆菌PR63及其应用
技术领域
本发明属于生物防控技术领域，具体涉及一株口粘液乳杆菌PR63及其应用。
背景技术
近年来，抗生素滥用的现象时有发生，使得大量病原菌出现耐药性，导致治愈疾病的难度大大增加。同时，动物长期采食抗生素造成大量药物残留在畜产品当中，从而通过食物链转移到人体，给人类疾病的预防与治疗带来更大困难。寻找并开发可以代替抗生素且具有天然无毒害作用的饲用添加剂刻不容缓。
益生菌制剂对调整和保持畜禽肠道微生态平衡、调节机体免疫机能、防治疾病、提高饲料利用率与生产性能等有着重要作用。目前畜禽上使用最为广泛的益生菌是乳酸杆菌和芽孢杆菌，在动物日粮中添加益生菌来促进动物消化系统的消化吸收功能，极大的促进了动物新陈代谢和营养物质的吸收，在一定程度上有助于增强动物免疫力和抵抗力。乳酸菌能够分解糖类产生乳酸，降低肠道pH值，抑制肠道腐败菌的活动。产生的细菌素能抑刹或杀死胃、肠道内的病原菌，维持场道菌群平衡；此外，还能合成维生素，分泌消化酶类，辅助食物消化，促进营养物质吸收，降低宿主血胆固醇，增强宿主对乳酸的耐受力，是动物肠道中的优势菌群之一。
血清生化指标能够反映出动物机体的物质吸收、代谢情况，并反映动物机体生理健康状况，血清TP和ALB含量反映动物体内蛋白质的代谢情况，血清TC、TG含量是反映机体脂类代谢水平的重要指标，其含量的增加是一些疾病发生的诱因之一。氧化应激是体内自由基产生的一种负面作用，是导致机体衰老和与相关疾病的重要原因。GSH-PX和SOD是机体主要的抗氧化酶，MDA是氧化应激的标志物，口服益生菌可使机体氧化应激能力增强。
但是要获得对人体和动物有益的口粘液乳杆菌并非易事，一方面需要通过发明人大量的研究实验，另一方面还需要凭借一定的运气。口粘液乳杆菌(Limosilactobacillusoris)是一种杆状的革兰氏阳性益生菌，广泛分布于自然界，属于人和动物肠道内重要的生理性细菌之一。有研究表明口粘液乳杆菌具有良好的耐酸耐胆盐能力，可有效提高产蛋率、平均蛋重和蛋黄重，降低蛋黄中的胆固醇含量(Wan Z，Sun N，Luo M，et al.Promotion ofEgg Production Rate and Quality Using Limosilactobacillus oris BSLO 1801，aPotential Probiotic Screened from Feces of Laying Hens with Higher EggProductive Performance[J].Probiotics andAntimicrobial Proteins，2021：1-13.)。但将口粘液乳杆菌应用于畜禽，探究对生长、免疫、抗氧化性能方面的研究仍处于空白阶段，且并不是所有益生菌均对畜禽具有促生长、提高免疫性能的作用。有研究发现，在干乳期奶牛的全混合日粮中添加枯草芽孢杆菌对其体重、采食量和料重比以及营养物质消化率无显著影响(王志刚.日粮添加益生菌对干乳期奶牛生长性能、瘤胃发酵及氮平衡的影响[J].中国饲料，2022(04)：45-48.)。在日粮中添加复合益生菌(枯草芽孢杆菌+丁酸梭菌)和丁酸梭菌对灵山土鸡生长性能均无显著影响(李修宇.日粮中添加益生菌对灵山土鸡生长性能、血液指标、肠道形态和盲肠菌群的影响[D].广西大学，2021.)。在饲料中添加丁酸梭菌、乳酸菌和复合益生菌对青年鸽的平均日增重、IgA、IgG含量无显著差异(袁文华，李国勤，韩安法，王淼，李浙烽，刁新平，卢立志.益生菌对青年鸽生长、免疫和抗氧化性能及繁殖相关基因表达的影响[J].动物营养学报，2019，31(07)：3294-3301.)。
乳酸杆菌属内种之间的差异较大，表型性状、生化反应和生理特征方面具有明显差异，目前关于口粘液乳杆菌在家禽动物鸽上的研究甚少，因此如何获得对动物甚至是鸽的生长有益的口粘液乳杆菌仍旧是亟待解决的一大难题。
发明内容
发明目的：为解决现有技术中存在的技术问题，本发明所要解决的第一个技术问题是提供了一株口粘液乳杆菌PR63，该所述的口粘液乳杆菌PR63不仅能促进童鸽生长发育，还能增强机体免疫功能和氧化应激能力。
本发明所要解决的第二个技术问题是提供了一种益生菌，所述益生菌包含所述的口乳酸杆菌。
本发明所要解决的第三个技术问题是提供了口粘液乳杆菌或所述的益生菌在鸽养殖中的应用。
技术方案：为实现上述技术目的，本发明提供了一株口粘液乳杆菌(Limosilactobacillus oris)PR63，所述口粘液乳杆菌(Limosilactobacillus oris)PR63于2022年4月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.24641，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明内容还包括一种益生菌制剂，所述益生菌制剂包括所述的口粘液乳杆菌(Limosilactobacillus oris)PR63。
本发明内容还包括所述的口粘液乳杆菌(Limosilactobacillus oris)PR63或所述的益生菌制剂在禽类动物养殖中的应用。
其中，所述禽类动物包括但不仅限于鸽子。
其中，所述应用为促进机体生长发育的应用。
其中，所述应用为增强机体免疫功能和氧化应激能力。
其中，所述应用为口粘液乳杆菌PR63灌胃量为4.5×109CFU/mL禽类动物。
本发明的口粘液乳杆菌PR63耐受性能好，抑菌效果良好，对多种抗生素敏感，并且对生长发育有促进作用，能增强机体免疫功能和氧化应激能力。
有益效果：相对于现有技术，本发明具备以下优点：
1、本发明首次分离鉴定获得口粘液乳杆菌PR63，是鸽源性的乳酸杆菌，通过筛选证实其对常见鸽腹泻细菌病原抑制能力强，对多种抗生素敏感。
2、口服口粘液乳杆菌PR63可以促进童鸽生长发育；与空白对照组相比，该口粘液乳杆菌PR63显著提高了平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)，降低了料重比(F/A)。
3、本发明首次发现筛选的口粘液乳杆菌PR63能够显著提高血清中免疫球蛋白含量、抗氧化指标，从而促进家禽免疫能力及氧化应激水平，具有重要的发育学研究价值和实践养殖意义，该菌可以开发成促进生长，提高免疫功能及抗氧化应激能力的益生菌制剂。
附图说明
图1为口粘液乳杆菌PR63菌落形态及光学显微镜革兰氏染色观察图；
图2为口粘液乳杆菌PR63的PCR琼脂糖凝胶电泳，生长曲线，产酸耐酸耐胆盐性能，抑菌性能，药敏试验及溶血性能结果图；A：口粘液乳杆菌PR63其PCR扩增后的基因大小约为1 500bp；B：24h生长曲线及产酸能力；C-D：在pH＝3，0.3％胆盐环境下具有良好的耐受性能；E、培养48h后的平板，未出现溶血现象。
图3为口服21d口粘液乳杆菌PR63对童鸽生长性能及发育结果图。A：口服21d口粘液乳杆菌日增重极显著增加，料重比与空白组相比显著降低；B：常见血清生化指标对比结果图，葡萄糖和总胆固醇含量无显著差异，尿素和甘油三酯含量显著降低，白蛋白、肌酐含量显著升高。*p＜0.05，**p＜0.01。
图4为口服21d口粘液乳杆菌PR63对童鸽免疫及抗氧化能力结果图。A：血清检测IgA、IgG、IgM的含量均显著提高；B：血清检测丙二醛、过氧化氢酶及谷胱甘肽过氧化氢酶活力显著降低，超氧化物歧化酶含量无显著差异。*p＜0.05，**p＜0.01，***p<0.001。
具体实施方式
下面通过具体的实施例和附图对本发明进一步说明。下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规试剂和常规方法。
实施例1样品的来源与菌株的初步筛选、菌株的鉴定及益生特性
1、样品的来源与菌株的初步筛选
无菌条件下，采集60日龄健康白羽王鸽粪便，放于MRS液体培养基与甘油混合中，4℃保存，尽快带回实验室。用无菌生理盐水将菌液稀释至10-5，取100μL稀释液均匀涂布在MRS琼培养基上，37℃温箱烛灯法厌氧培养48h，挑取单菌落，划线接种MRS培养基，纯化三次，选取疑似菌株进行革兰氏染色后镜检，观察菌体形态，如图1所示选取镜下无芽孢的革兰氏阳性菌株，将得到的菌株与60％(V/V)甘油2：1混合保存得到纯化菌株PR63，于2022年4月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.24641。
2、乳酸菌的生化和16S rDNA鉴定
将步骤1中的纯化菌株PR63按照1％接种量接种到MRS液体培养基中，于37℃摇床200rpm培养24h，获得活化菌株，依据《伯杰细菌鉴定手册》和《乳酸菌分类鉴定及实验方法》中乳酸菌属和种的生理生化鉴定指标对其进行生化鉴定，用HBI乳酸菌生化鉴定条(购买于青岛海博生物，中国)作基于生化反应表型鉴定并对比后归类。
用水煮法提取菌株基因组DNA并作为模板，然后采用乳酸菌属16S rDNA通用引物(27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)进行PCR扩增。采用20μL PCR反应体系(2 x F8 Fastlong PCR MasterMix 10μL，10μmol/L上、下游引物各0.5μL，灭菌水4μL，模板5μL)。扩增条件为：95℃预变性5min、94℃变性30s、57℃复性30s、72℃延伸90s、循环35次，最后一个循环72℃延伸10min，最后4℃保存。PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像分析仪观察结果。如图2A所示PCR扩增后的基因大小约为1500bp，与预期结果相一致。对PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。对测得的菌株DNA序列运用GeneBank中的BLAST工具软件在DNA序列数据库中搜索同源DNA序列并进行比较分析，根据BLAST搜索和比较，结果表明菌株PR63与Limosilactobacillus oris同源性达到99％，因此，将PR63命名为口粘液乳杆菌。
3、生长曲线和产酸能力
将步骤1的纯化菌株PR63以1％的接种量接种到MRS液体培养基中，置于37℃摇床中培养24h，每间隔2h取三个平行，测定菌株培养液的OD600nm值和pH值，如图2B所示以培养时间为横坐标，以pH值和OD600nm值为纵坐标，绘制菌株生长曲线。
4、耐酸耐胆盐
将步骤1的纯化菌株PR63按1％的接种量接种到MRS液体培养基中，37℃摇床培养24h后，1 800rpm，3min离心，弃上清，收集菌体。将菌体接种到0.1mol/L盐酸溶液配制pH值分别为5.0、4.0、3.0、2.0的MRS液体培养基和猪胆盐含量为0.1％、0.2％、0.3％、0.5％、1％的MRS液体培养基中，以无菌MRS肉汤为空白对照，37℃培养3h，每组3个重复，测OD600nm值，求得酸、胆盐处理组的OD600nm值与空白组OD600nm值的比值，即相对存活率。如图2C-D所示，口粘液乳杆菌PR63在pH3条件下存活率均达到60％以上，在0.3％胆盐浓度环境下存活率58.3％。
5、抑菌实验
以大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌为致病性指示菌，并于37℃摇床200rpm培养24h，获得活化菌株，采用牛津杯法进行抑菌试验。取活化后100μL，5×108CFU/mL的致病性指示菌均匀涂布在LB营养琼脂平板上，静置15min，待菌液渗透均匀，每个平板放置3个牛津杯，吸取200μL步骤2的活化菌株PR63，置37℃培养箱培养24h，量取抑菌圈大小。每组试验进行三次重复，最终取其平均值进行记录。
如表1所示用游标卡尺测量抑菌圈直径所取平均值。口粘液乳杆菌PR63对三种致病菌均有抑菌作用，对大肠杆菌抑制效果最好，对沙门氏菌是抑制效果优于金黄色葡萄球菌。
本发明菌株可抑制肠道致病菌大肠杆菌E-coil，鸡白痢沙门氏菌S.pullorum，金黄色葡萄球菌S.aureus的生长。
表1
Figure BDA0003635716440000051
Figure BDA0003635716440000061
6、药敏实验
采用药敏纸片琼脂扩散法检测益生菌对抗生素的耐药性，选取14种抗生素，吸取100μL步骤2的活化菌株PR63均匀涂布在MRS琼脂培养基表面，静置15min，用无菌镊子将药敏纸片贴放表面，轻轻压实，于37℃培养箱培养24h，观察其耐药结果，如表2所示用游标卡尺量取抑菌圈直径并记录，根据美国临床和实验室标准协会(CLSI)执行的标准进行判定，PR63除对多粘菌素B耐药以外，对其余13种抗生素均表现敏感。
表2
Figure BDA0003635716440000062
7、溶血实验
将步骤2的活化菌株PR63在绵羊无菌血平板上进行划线，置于37℃培养箱中48h，如图2E所示观察不存在溶血环。
实施例2检测口服口粘液乳杆菌后对童鸽生长性能的影响
选取40日龄健康雌性白羽王鸽测初始体重后随机分为空白组和实验组，24只/组，空白组童鸽口服灌胃无菌1mL PBS(pH7.4)21天，试验组，每只童鸽连续21d接种4.5×109CFU/mL口粘液乳杆菌PR63，于第22天采样。童鸽禁食8h后称量初始体重即试验开始，试验期间，每7d记录一次各组采食量、体增重，计算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)以及料重比(F/A)。
口乳酸杆菌PR63处理后，平均日采食量(ADFI)与空白组相比差异不显著，平均日增重(ADG)、料重比(F/A)却显著优于空白组(图3A)，试验结束时，每个重复随机选取试验鸽2只，空腹12h后，翅下静脉采血5mL，静置30min后，3500r/min离心10min，分离血清，检测血清生化指标(图3)B，包括肌酐(Cr)、白蛋白(ALB)、葡萄糖(GLU)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、尿素(HDL)。ALB、GLU和TC与空白组相对无明显差异，TG、HDL含量显著降低，Cr含量显著升高。
实施例3检测口服口粘液乳杆菌后对童鸽免疫、抗氧化性能的影响
采用实施例2的方法进行喂养后，通过ELISA方法检测血清中IgA、IgG、IgM的含量(图4A)，口服口乳酸杆菌PR63的童鸽免疫功能显著提高，同时检测血清抗氧化指标(图4B)，包括谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)和超氧化物歧化酶(SOD)活性，过氧化氢酶(CAT)和丙二醛(MDA)含量。过氧化氢酶与谷胱甘肽过氧化物酶活力显著提高，表明口乳酸杆菌能显著增强童鸽抗氧化能力，减少对机体的氧化损伤。

Claims (7)

1.一株口粘液乳杆菌（Limosilactobacillus oris）PR63，其特征在于，所述口粘液乳杆菌（Limosilactobacillus oris）PR63于2022年4月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.24641。
2.一种益生菌制剂，其特征在于，所述益生菌制剂包括权利要求1所述的口粘液乳杆菌（Limosilactobacillus oris）PR63。
3.权利要求1所述的口粘液乳杆菌（Limosilactobacillus oris）PR63或权利要求2所述的益生菌制剂在禽类动物养殖中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述禽类动物为鸽子。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用为促进机体生长发育的应用。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用增强机体免疫功能和氧化应激能力。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用为口粘液乳杆菌PR63灌胃量为1×106CFU/mL ~ 1×1010CFU/mL。
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