CN116849291A - 一种强化动物免疫功能的发酵饲料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于发酵饲料领域，公开了一种强化动物免疫功能的发酵饲料及其制备方法。申请人首次从海洋环境中筛选出产胞外多糖的发酵粘液乳杆菌，保藏编号为：GDMCC NO：62193。经GPC系统测定是一种在化学结构上全新的多糖。申请人进一步研发了其与解淀粉盐水球菌HL‑6共培养液的方法，显著提高了多糖的产量，试验结果证实该多糖具有免疫调节的功能。以产胞外多糖的发酵粘液乳杆菌LAN4制备的发酵饲料，由于经过液态发酵与固态发酵法生产多糖，进一步提高了多糖的产量，并且发酵生产的胞外多糖不用提取，直接吸附到饲料或饲料原料中而进行应用，显著降低了多糖的应用成本。
Description
技术领域
本发明属于发酵饲料领域，具体涉及一种强化动物免疫功能的发酵饲料及其制备方法。
背景技术
发酵饲料指在人为控制下，把有益微生物接种在饲料原料或全价配合饲料，经过一段时间的发酵，利用发酵过程中产生的消化酶，将饲料原料进行体外消化，并且还会产生乳酸、维生素等有益代谢产物。发酵饲料在近些年已发展为饲料行业的一个发展趋势，其开发与利用成为饲料行业的研究热点。然而，现在用于发酵饲料的有益微生物，代谢过程中很少产生具有免疫增强功能的物质。
多糖称多聚糖，是生物有机体内普遍存在的一类生物大分子。不仅参与组织细胞骨架的构成，而且是多种内源性生物活性分子的重要组成成分。多糖具有一定的调节机体免疫功能的作用，其作用是多途径、多环节、多靶点的，如促进免疫细胞增殖与分化，分泌各种淋巴因子等。多糖作为饲料添加剂具有良好的活性，能提高机体的免疫力，并有低毒和低耐药性等特点，具有广阔的应川前景。多糖的来源有植物、动物与微生物，相对于植物与动物源多糖，微生物源多糖具有容易大规模生产的特点，具有更好的应用前景。
乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是国际公认的安全微生物（generallyrecognized as safe, GRAS），不仅可以维持宿主正常的胃肠道微生态平衡，还具有免疫调节的作用。乳酸菌胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）是乳酸菌主要的代谢产物之一。近年来，已从陆地上分离筛选出较多产胞外多糖的乳酸菌，由于对陆地产EPS乳酸菌的大量筛选及研究，发现新的产EPS乳酸菌变得越来越困难。而海洋中蕴藏着丰富的微生物资源，且已有相关报道表明海洋中存在乳酸菌，因此从海洋中筛选产EPS乳酸菌成为可能。由于海洋高盐、低温、寡营养的独特环境决定了海洋乳酸菌与陆地乳酸菌在生长代谢上的差别，从而使得海洋乳酸菌可能具有生产独特生物活性多糖的能力。
乳酸菌胞外多糖具有免疫调节功能，在饲料工业有着良好的应用前景，然而现有的乳酸菌发酵发酵产量较低，影响了乳酸菌胞外多糖在饲料工业的应用。发酵培养基的配方是发酵工业中非常关键的因素，其直接影响代谢产物的产量以及后续的生产成本。尽管现有的发酵培养基很多，也有很多成功的范例，但是由于微生物菌种的多样性，不同菌种之间配方没有参考和借鉴意义。目前，乳酸菌的培养常用MRS培养基或其改良型，但上述培养基不能高产乳酸菌胞外多糖，影响了乳酸菌胞外多糖的应用。
本发明，首次于海洋源样品中筛选出了可分泌胞外多糖的发酵粘液乳杆菌，该乳杆菌分泌的胞外多糖的重均分子量为21.44 KDa；经高效液相色谱测定，得出EPSLAN4是由葡萄糖（70.33%）、甘露糖（23.02%）、半乳糖（4.02%）、葡萄糖醛酸（0.76%）、半乳糖醛酸（0.51%）组成的杂多糖，是一种在化学结构上全新的多糖。进一步的，申请人筛选出适合该菌株分泌胞外多糖的培养基及共培养菌株，获得了高产全新胞外多糖的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种强化动物免疫功能的发酵饲料，所述的发酵饲料中含有发酵菌株发酵粘液乳杆菌LAN4和解淀粉盐水球菌HL-6，所述的发酵粘液乳杆菌（Limosilactobacillus fermentum）的保藏编号为：GDMCC NO：62193，解淀粉盐水球菌HL-6（Salinicoccus amylolyticus）的保藏编号为：GDMCC NO：60715，已在CN 111893069 B中公开。
本发明另一个目的在于提供一种强化动物免疫功能的发酵饲料的制备方法。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
申请人自海洋源样品筛选出一株高产胞外多糖的乳酸菌，通过生物形态和分子鉴定，该菌株鉴定为发酵粘液乳杆菌，该菌株已于2022年04月07日送至广东省微生物菌种保藏中心保藏，保藏编号为：GDMCC NO：62193，分类命名：Limosilactobacillus fermentum LAN4，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
发酵粘液乳杆菌（Limosilactobacillus fermentum LAN4）在MRS培养基上，于37℃培养48小时的菌落形态如图1中A所示，其菌落呈圆形，乳白色，边缘整齐。扫描电镜观察其个体形态如图1中B所示，为短杆状。本发明的发酵粘液乳杆菌产的胞外多糖，经GPC系统测定胞外多糖EPSLAN4的重均分子量为21.44 KDa；经高效液相色谱测定，得出EPSLAN4是由葡萄糖（70.33%）、甘露糖（23.02%）、半乳糖（4.02%）、葡萄糖醛酸（0.76%）、半乳糖醛酸（0.51%）组成的杂多糖，是一种在化学结构上全新的多糖。
一种强化动物免疫功能的发酵饲料，所述的发酵饲料中含有发酵菌株发酵粘液乳杆菌LAN4和解淀粉盐水球菌HL-6，所述的发酵粘液乳杆菌（Limosilactobacillus fermentum）的保藏编号为：GDMCC NO：62193，解淀粉盐水球菌HL-6（Salinicoccus amylolyticus）的保藏编号为：GDMCC NO：60715。
一种强化动物免疫功能的发酵饲料的制备方法，包括下述步骤：将发酵粘液乳杆菌LAN4和解淀粉盐水球菌HL-6的种子液均按1-5%（V/V）的接种量接种于灭菌后冷却至室温的发酵培养基中，于37℃～41℃，静置发酵16 -24h；按照发酵液质量：发酵原料的质量比为0.4～0.9：1的比例将发酵液与发酵原料混合，加入营养物，接入枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和酵母菌，并混匀；于10℃～50℃，静置发酵48h～96h，即得；
所述的蔬菜汁的制备方法为：将新鲜的大白菜与芥菜切碎后，按照湿重质量比为1：0.5～1.5的比例混合，然后按照蔬菜：水的质量比为1:0.5～1.5的比例加入水，用匀浆机打浆，打浆后用纱布过滤，收集滤液即可得到蔬菜汁；
所述的发酵培养基的配方为：蔬菜汁1L，葡萄糖10～60g，麦芽糖10～60g，氯化钠30～60g，碳酸钙1～10g，蛋白胨10～60 g；
所述的发酵原料为全价配合饲料或饲料原料，所述的饲料原料为豆粕、麸皮和玉米粉中的一种或其组合物；
所述的营养物为葡萄糖、麦芽糖、蛋白胨、磷酸氢二钾与碳酸钙所组成的混合物，所述的营养物的加入量以加入的营养物的质量占发酵原料总质量百分比计，分别为：葡萄糖0.01%～5%，麦芽糖0.01%～5%，蛋白胨0.01%～5%，磷酸氢二钾0.01%～5%，碳酸钙0.01%～5%；
所述的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和酵母菌均来源于商业渠道，即为常规的发酵用菌株，其添加量均为占发酵原料总质量百分比计为0.01%～0.1%，菌剂产品的有效菌含量均为2×1010CFU/g～1×1011CFU/g。
以上所述的方法中，优选的，发酵可在呼吸膜发酵袋、发酵池、发酵木箱或发酵槽等装置中进行。
本发明还包括，上述发酵饲料在制备提高动物免疫力饲料中的应用，其应用过程包括：发酵结束后，以全价配合饲料为原料制备的发酵饲料产品直接进行饲喂；或以饲料原料制备的发酵饲料进行烘干粉碎后，再应用于全价配合饲料中。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
（1）申请人首次从海洋环境中筛选出产胞外多糖的发酵粘液乳杆菌。经GPC系统测定胞外多糖EPSLAN4的重均分子量为21.44 KDa；经高效液相色谱测定，得出EPSLAN4是由葡萄糖（70.33%）、甘露糖（23.02%）、半乳糖（4.02%）、葡萄糖醛酸（0.76%）、半乳糖醛酸（0.51%）组成的杂多糖，是一种在化学结构上全新的多糖。
（2）本发明申请以蔬菜汁为基础，并以葡萄糖与麦芽糖为复合碳源，显著提高了发酵粘液乳杆菌的多糖的产量；并采用与解淀粉盐水球菌HL-6共培养液的方法，进一步提高了多糖的产量。
（3）以产胞外多糖的发酵粘液乳杆菌（Limosilactobacillus fermentum）LAN4制备的发酵饲料，由于经过液态发酵与固态发酵法生产多糖，进一步提高了多糖的产量，并且发酵生产的胞外多糖不用提取，直接吸附到饲料或饲料原料中而进行应用，显著降低了多糖的应用成本。
附图说明
图1发酵粘液乳杆菌（Limosilactobacillus fermentum）LAN4的菌落形态与个体形态图。
图2为产胞外多糖乳酸菌的拉丝表型。
图3为菌株LAN4的系统发育树。
图4为EPSLAN4的分子量分布图。
图5为EPSLAN4对RAW264.7细胞活力的影响示意图。
图6为EPSLAN4对脂多糖诱导RAW264.7细胞NO、IL-6、TNF-α分泌的影响示意图。
图7为EPSLAN4对脂多糖诱导RAW264.7细胞MAPK信号通路的影响示意图。
图8为EPSLAN4对RAW264.7细胞吞噬能力的影响示意图。
图9为EPSLAN4对RAW264.7细胞NO、IL-6、TNF-α分泌的影响示意图。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：
发酵粘液乳杆菌（Limosilactobacillus fermentum）LAN4的分离与鉴定：
取10g海洋源样品（海水鱼与虾的肠道、红树林土壤）于90mL MRS肉汤中，于37℃富集48小时后，对培养液进行梯度稀释，取适宜梯度稀释液100 µL涂布于含质量浓度3%（W/V）CaCO3的MRS固体上培养，在37℃生化培养箱中孵育48h，对具有溶钙圈的单菌落进行划线纯化，并将纯化后的菌株进行革兰氏染色与接触酶实验，革兰氏染色阳性与接触酶实验为阴性的可初步鉴定为乳酸菌。再根据菌落拉丝表型（图2）结合多糖产量，筛选出高产多糖的菌株LAN4。
菌株LAN4的鉴定：采用16S rDNA测序方法，引物为细菌通用引物27F和1492R，PCR扩增体系：2×MightyAmp Buffer 30 μL，MightyAmp DNA Polymerase 1.5μL，引物27F和1492R 各1.5 μL，ddH2O 25.5μL。PCR扩增条件：98 ℃预变性2 min；98 ℃变性10 s，55℃复性15 s，68℃延伸90 s，40个循环；72℃延伸10 min，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测合格的送至生工生物工程股份有限公司测序，测序结果提交至EZBiocloud中进行同源性检索，寻找与目的基因序列同源性最大的菌株并构建其系统发育树，如图3所示，菌株LAN4与发酵粘液乳杆菌（Limosilactobacillus fermentum）亲缘关系最近，且在EZBioCloud中比对分析得到LAN4与发酵粘液乳杆菌CECT562的相似性达98.78%，因此，菌株LAN4可鉴定发酵粘液乳杆菌。菌株LAN4于2022年04月07日送至广东省微生物菌种保藏中心保藏，分类命名：Limosilactobacillus fermentum LAN4，保藏编号为：GDMCC NO：62193，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
实施例2：不同的培养基对发酵粘液乳杆菌LAN4胞外多糖产量的影响
培养基A （MRS培养基）：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉粉5 g/L，酵母粉4 g/L，磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，乙酸钠5g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.05g/L，吐温80 1.0 mL/L。
培养基B（改良MRS培养基）：葡萄糖30 g/L，蛋白胨40 g/L，磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，乙酸钠5g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.04g/L，吐温80 1.0 g/L。
培养基C：葡萄糖90 g/L，酵母提取物10 g/L，乙酸钠6g/L，柠檬酸铵5g/L，吐温802.0 mL/L，初始pH6.5。
培养基D：蓝莓汁1L，乳糖60g，大豆肽6g。（蓝莓汁的制备方法是：将冷冻蓝莓在室温解冻，打浆，在4500 r/min 条件下离心15 min，40目滤布过滤得到蓝莓汁，用0.1 mol/L碳酸氢钠调节pH 值至4.5备用）。
培养基E：大白菜汁1L，葡萄糖60g，碳酸钙5g，蛋白胨30 g（大白菜汁的制备方法是：将新鲜大白菜切碎后与水按质量比1:1混合，用匀浆机打浆，打浆后用纱布过滤得到大白菜汁）。
培养基F：芥菜汁1L，葡萄糖60g，碳酸钙5g，蛋白胨30 g（芥菜汁的制备方法是：将新鲜芥菜切碎后与水按质量比1:1混合，用匀浆机打浆，打浆后用纱布过滤得到芥菜汁）。
培养基G：复合蔬菜汁1L，葡萄糖60g，碳酸钙5g，蛋白胨30 g。（复合蔬菜汁的制备方法是：将新鲜大白菜与与芥菜切碎后，按质量比为1:1混合，然后加入同质量的水，用匀浆机打浆，打浆后用纱布过滤得到复合蔬菜汁）。
培养基H：复合蔬菜汁1L，葡萄糖30g，麦芽糖30g，氯化钠40g，碳酸钙5g，蛋白胨30g。（此处的复合蔬菜汁的制备同培养基G）。
将斜面保藏的发酵粘液乳杆菌（Limosilactobacillus fermentum）LAN4接种于MRS肉汤培养中，37℃静置培养12 h作为发酵粘液乳杆菌种子液；取2%（V/V）的种子液于接种于上述几种培养基（每种培养基做3个平行），于37℃培养16h。发酵结束后，将发酵液10000r/min离心15min，去除沉淀收集上清液；将80%三氯乙酸加至上清液中使其最终质量浓度为4%(W/V)，并于4℃静置12h，然后10000r/min离心8min，取上清液；往上清液中加入2倍体积无水乙醇，于4℃冰箱冷藏12h后，然后10000r/min离心5min，收集沉淀；往收集的沉淀中加水复溶后透析24h，期间每间隔6h换水1次，定容后再通过苯酚硫酸法测定其多糖产量。
发酵粘液乳杆菌（Limosilactobacillus fermentum）LAN4在不同的培养基中多糖产量与表1所示。由表1结果可知，不同的培养基对发酵粘液乳杆菌产多糖的影响非常大。A为MRS液体培养基，MRS液体培养基为乳酸菌培养的常用培养基，但发酵粘液乳杆菌在MRS液体培养基产多糖能力较低，B培养基与C培养基均为以MRS培养基为基础，进行优化后适合产多糖的培养基，但上述2种培养基产多糖量仍然比较低。申请人以复合蔬菜汁、葡萄糖、麦芽糖、氯化钠、碳酸钙及蛋白胨为基础得到的培养基（培养基H），发酵后多糖含量高达3.42 g/L。多糖产量是MRS培养基的38倍之多。
表1 发酵粘液乳杆菌在不同的培养基中发酵生产的多糖的产量
。
实施例3：混菌共培养对发酵粘液乳杆菌LAN4产多糖的影响
将发酵粘液乳杆菌（Limosilactobacillus fermentum）LAN4在MRS肉汤培养12 h后作为种子液备用该种子液的有效菌浓度是2×109CFU/mL；将解淀粉盐水球菌（Salinicoccus amylolyticus）HL-6接种于4%氯化钠营养肉汤中，于37℃、120r/min下培养16h后作为种子液备用，该种子液的有效菌浓度是1.6×109CFU/mL。
实验分为3组，即发酵粘液乳杆菌组（接入2%（V/V）的发酵粘液乳杆菌种子液于实施例2中培养基H）、解淀粉盐水球菌HL-6组（接入2%（V/V）的发酵粘液乳杆菌种子液于实施例2中培养基H），与混菌组（分别接入1%（V/V）的发酵粘液乳杆菌种子液与解淀粉盐水球菌HL-6种子液于实施例2中培养基H），每个组3个平行。接种完成后，将接入种子液的发酵培养基置于37℃，培养16h。发酵结束后，测定发酵液中多糖含量，测定方法参考实施例2。
由表2结果可知，采用发酵粘液乳杆菌与解淀粉盐水球菌HL-6混菌培养组的多糖含量与发酵粘液乳杆菌单独培养组相比，多糖含量显著提高，多糖含量增加了43%。而单独培养解淀粉盐水球菌HL-6菌组，发酵液中产生的多糖为0，可见，采用与解淀粉盐水球菌HL-6共培养的方法，可以促进发酵粘液乳杆菌发酵生产多糖，发酵粘液乳杆菌与盐水葡萄球菌均来源于海洋环境，具有较强的耐盐性，可能盐水葡萄球菌的某种代谢产物有助于发酵粘液乳杆菌生产多糖。也或者是盐水葡萄球菌能够将蔬菜汁中亚硝酸盐快速的去除，有利于发酵粘液乳杆菌产多糖，具体促进机制待进一步探索。
表2 混菌培养对发酵粘液乳杆菌产多糖的影响
。
实施例4：发酵粘液乳杆菌乳酸菌胞外多糖的制备
将斜面保藏的发酵粘液乳杆菌（Limosilactobacillus fermentum）LAN4接种于MRS肉汤培养中于37℃，培养12h获取种子液；将斜面保藏的解淀粉盐水球菌HL-6接种于营养肉汤（含氯化钠4%）培养基中，于37℃，120r/min，培养16小时作为种子液；将上述两种制备的种子液均按1%（V/V）的接种量接种于灭菌后冷却至室温的发酵培养基（实施例2中培养基H：蔬菜汁1L，葡萄糖30g，麦芽糖30g，氯化钠40g，碳酸钙5g，蛋白胨30 g/L）中，于37℃，静置发酵20h。
发酵结束后，将发酵液10000r/min离心15min，去除沉淀收集上清液；将80%三氯乙酸加至上清液中使其最终质量浓度为4%(W/V)，并于4℃静置12h，然后10000r/min离心8min，取上清液；往上清液中加入2倍体积无水乙醇，于4℃冰箱冷藏12h后，然后10000r/min离心5min，收集沉淀；往收集的沉淀中加水复溶后透析24h，期间每间隔6h换水1次，得到粗多糖溶液，冷冻干燥后得到粗多糖；粗多糖用超纯水配制成10 mg/mL的溶液在SepharoseCL-6B凝胶柱（2.5 × 60 cm）上进行纯化，洗脱液为0.1 mol/L的NaCl溶液。最后收集组分，再次透析、冷冻干燥后得到纯化后的多糖产品EPSLAN4。
实施例5：发酵粘液乳杆菌乳酸菌胞外多糖的平均分子量测定
配制1mg/mL以上制备得到的胞外多糖EPSLAN4溶液，采用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)配备示差折光检测器(RID)测定分子量，用0.1 mol/L的NaNO3溶液以1 mL/ min的流速洗脱柱子。此外，以聚乙二醇（PEG）绘制的校准曲线lg Mw= 18.339965 - 1.122002x1+ 0.026204x2 - 0.000217x3，R2＝0.9998，估算重均分子量。如图4所示，EPSLAN4在HPGPC上表现为连续的单峰，计算其重均分子量为21.44 KDa。
实施例6：发酵粘液乳杆菌乳酸菌胞外多糖的单糖组成
（1）将10 mg的EPSLAN4与三氟乙酸（TFA）混合，然后用N2封管，置于120 ℃烘箱中水解2 h，冷却后添加甲醇，并在70 ℃水浴下利用N2吹干，然后重复该步骤2次以去除TFA，最后加入NaOH溶液充分溶解残渣，以获得EPSLAN4水溶液。
（2）单糖衍生化：取等体积的多糖水解液和PMP甲醇溶液，漩涡混匀，在70 ℃反应2h，冷却至室温后用HCl（0.3mol/L）将pH调至7后，再加3倍体积于多糖水解液的水和氯仿，混匀静置，弃去氯仿相，如此萃取2次后将水相用0.45μm微孔膜过滤，由此得到单糖衍生化待测溶液。
（3）检测：采用配有WAD检测器的UtiMate 3000 HPLC对待测溶液进行检测。检测条件如下：色谱柱：C18柱（250 mm*4.6 mm，粒度5μm）；流动相A：100 mm磷酸钠缓冲液（pH=6.4）；流动相B：乙腈；检测波长：245 nm；柱温：30 ℃；流速：1 mL/min；进样量：20μL。
EPSLAN4经水解后采用高效液相色谱测定其单糖组成，EPSLAN4是由葡萄糖（70.33%）、甘露糖（23.02%）、半乳糖（4.02%）、葡萄糖醛酸（0.76%）、半乳糖醛酸（0.51%）组成的杂多糖。
实施例7：多糖的抗炎活性
EPSLAN4对RAW264.7细胞活力的影响：将RAW264.7细胞按照3 × 104个/孔接种到96孔板中，放入培养箱培养24 h。然后除去旧培养基，加入含有不同浓度EPSLAN4（25、50、100、200、400、800、1200 μg/mL）的无血清RPMI-1640，继续培养24 h，以不含EPSLAN4培养的RAW264.7细胞作为空白组。用CCK-8法检测细胞活力，采用酶标仪在450nm处测量各孔的吸光度。图5为EPSLAN4对RAW264.7细胞活力的影响，EPSLAN4给药24小时后，25～800 μg/mL浓度范围内的RAW264.7细胞活力与空白组相比无显著差异，当浓度达到1200 μg/mL时，细胞活力显著下降。
EPSLAN4对脂多糖诱导RAW264.7细胞NO、IL-6和TNF-α分泌量的影响：将RAW264.7细胞按照4 × 105个/孔接种到12孔板中，培养24 h后去除旧培养基。然后用不同浓度的EPSLAN4（100、200、400、800μg/mL）和脂多糖（LPS；1μg/mL）共同培养24h，以不含EPSLAN4和LPS培养的细胞为空白组，以含LPS不含EPSLAN4培养的细胞为对照组。取等体积的培养上清液与Griess试剂混合测定上清液中的NO水平，按照制造商的说明，收集细胞培养上清液，加入ELISA试剂测定IL-6和TNF-α。如图6所示，1 μg/mL的LPS显著增加了RAW264.7细胞NO的分泌量，与对照组相比EPSLAN4在200～800 μg/mL范围内以剂量依赖的方式降低LPS诱导RAW264.7细胞NO、IL-6和TNF-α的分泌量。
EPSLAN4对LPS诱导RAW264.7细胞中MAPK信号通路的影响：将RAW264.7细胞按照9× 105个/孔接种到6孔板中, 蛋白质样本用含有PMSF（10 μM）的RIPA裂解液进行裂解。将蛋白样品SDS-PAGB电泳后，将蛋白通过电转至NC膜，再用含5％脱脂牛奶的TBST溶液封闭1小时，加入ERK、p-ERK、p38、p-p38、JNK、p-JNK的一抗(1:1000)在4 ℃冰箱摇床过夜，再用二抗(1:5000)室温孵育2小时。采用天能5200化学发光系统检测抗体信号。利用Image J软件对条带强度进行量化和归一化。
MAPK通路是参与调节炎症因子和细胞因子的主要信号通路之一，主要包括ERK、JNK和p38，磷酸化激活MAPK后进入细胞核参与转录调控。如图7所示，与空白组相比LPS有效激活MAPK信号通路中相关蛋白的表达，与对照组相比200～800μg/mL的EPSLAN4可降低细胞中p-p38蛋白的表达，EPSLAN4浓度为400、800 μg/mL时细胞中p-JNK和p-ERK的蛋白水平均显著下降。这些结果表明，EPSLAN4可以抑制LPS诱导RAW 264.7细胞MAPK信号通路关键蛋白的磷酸化。
实施例8：多糖的免疫调节活性
EPSLAN4对RAW264.7细胞吞噬能力的影响：将RAW264.7细胞按照3 × 104个/孔接种到96孔板中，放入培养箱培养24 h。然后除去旧培养基，再用不同浓度的EPSLAN4（25、50、100、200μg/mL）或脂多糖（LPS；1μg/mL）继续培养24h。去除旧培养基，加入中性红试剂200 μL，培养箱中孵育2 h后，移除中性红试剂，用PBS润洗细胞3次后，加入细胞裂解液于摇床裂解10 min后，在波长540 nm除测定吸光值。从图8中可以看出，EPSLAN4在25～200 μg/mL范围内可有效增强RAW264.7细胞吞噬中性红的能力，表明该多糖可以有效激活巨噬细胞参与免疫调节。
EPSLAN4对RAW264.7细胞的NO、IL-6和TNF-α分泌量的测定：将RAW264.7细胞按照4× 105个/孔接种到12孔板中，培养24 h。然后除去旧培养基，再用不同浓度的EPSLAN4（25、50、100、200μg/mL）或脂多糖（LPS；1μg/mL）培养24h。取等体积的细胞培养上清液和Griess试剂混合以测定细胞培养上清液中NO水平。按照制造商的说明，收集细胞培养上清液，加入ELISA试剂测定IL-6和TNF-α的值。
图9的纵坐标代表RAW264.7细胞的NO、TNF-α和IL-6的分泌量，由图9可知EPSLAN4（25、50、100、200 μg/mL）培养24小时后，均以剂量依赖的方式促进NO、IL-6和TNF-α，且与空白组均有显著的差异。这些结果表明EPSLAN4在25～200 μg/mL的浓度范围内可以有效激活RAW264.7细胞参与免疫调节。
实施例9：发酵粘液乳杆菌LAN4胞外多糖对南美白对虾免疫力的影响
将基础饲料粉碎后，分别添加0、0.5g/kg、1.0g/kg、1.5g/kg发酵粘液乳杆菌胞外多糖（制备方法参照实施例4），并混匀。通过挤条机压制成条状饲料，最后通过一系列烘箱熟化、干燥、冷却、破碎机等制成颗粒试验饲料。
实验分为4组，即对照组（不添加发酵粘液乳杆菌LAN4胞外多糖），0.5g/kg多糖组，1.0g/kg多糖组和1.5g/kg多糖组。
将1200尾南美白对虾幼虾随机分为4 个处理组，每处理组3个重复，每个重复100尾，各重复平均体质量无显著差异。每天按体质量的8%投饲料，分4次定时、定量投喂，每天换水、清污，并记录采食量，试验期为55d。
（1）发酵粘液乳杆菌胞外多糖对南美白对虾血清免疫指标的影响
在试验结束当天，每个重复选取50 尾虾心脏采集血液样品，然后置于无菌的离心管中，在4℃、5000r/min离心10min，分离血清并保藏在-20℃ 冰箱中，用于测定血清酚氧化酶、超氧化物歧化酶和溶菌酶的活性。使用南京建成生物工程研究所试剂盒测定南美白对虾
血清酚氧化酶、超氧化物歧化酶和溶菌酶的活性，具体测定方法参考使用说明书。
由表3结果可知，与对照组相比，添加发酵粘液乳杆菌胞外多糖均可以提高对虾血清酚氧化酶、超氧化物歧化酶和溶菌酶的活性，且随着发酵粘液乳杆菌胞外多糖对添加量的增加，酚氧化酶、超氧化物歧化酶和溶菌酶的酶活性也增加。综上，发酵粘液乳杆菌胞外多糖可增强南美白对虾血清免疫指标。
表3 发酵粘液乳杆菌胞外多糖对南美白对虾血清免疫指标的影响
（2）发酵粘液乳杆菌胞外多糖对南美白对虾对肝胰腺免疫指标的影响
在试验结束的当天，每个重复选取30 尾虾采集肝胰腺，并将采集的肝胰腺其放置于-80℃ 冰箱冻藏备用。分析时, 称取一定质量的肝胰腺，按照9 倍体积(M ∶ V) 加入提前在4℃ 冰箱中预冷的0.1 mol·L-1pH6.4的磷酸缓冲液稀释，在冰浴中用匀浆器匀浆，将匀浆液在4℃、5000r·min-1离心10min 后，取上清液，用于酚氧化酶、超氧化物歧化酶和溶菌酶、碱性磷酸酶和丙二醛含量的测定。使用南京建成生物工程研究所试剂盒测定南美白对虾肝胰腺酚氧化酶、超氧化物歧化酶、碱性磷酸酶和溶菌酶的活性及丙二醛的含量，具体测定方法参考使用说明书。
由表4结果可知，与对照组相比，饲粮中添加发酵粘液乳杆菌胞外多糖可显著降低南美白对虾肝胰腺组织中丙二醛的含量，且随着多糖含量的增加，丙二醛的含量逐渐降低；饲粮添加发酵粘液乳杆菌胞外多糖可显著增加肝胰腺组织中超氧化物歧化酶、酚氧化酶和碱性磷酸酶的活性，且随着多糖含量的增加，超氧化物歧化酶、酚氧化酶和碱性磷酸酶的活性逐渐增加。综上，发酵粘液乳杆菌胞外多糖可增强南美白对虾肝胰腺免疫指标。
表4 发酵粘液乳杆菌胞外多糖对南美白对虾肝胰腺免疫指标的影响
。
实施例10：发酵粘液乳杆菌制备的增强免疫功能的南美白对虾发酵饲料及其应用效果：
将斜面保藏的发酵粘液乳杆菌（Limosilactobacillus fermentum）LAN4接种于MRS肉汤培养中于37℃，培养12h获取种子液；将斜面保藏的盐水葡萄球菌HL-6接种于营养肉汤（含氯化钠4%）培养基中，于37℃，120r/min，培养24小时作为种子液；将新鲜的大白菜与芥菜切碎后，按照质量比为1：1的比例混合，然后加入等质量的水，用匀浆机打浆，打浆后用纱布过滤，收集滤液即可得到蔬菜汁备用；将制备的两种菌种的种子液均按2%（V/V）的接种量接种于灭菌后冷却至室温的发酵培养基（蔬菜汁1L，葡萄糖30 g，麦芽糖30g，氯化钠40g，碳酸钙5g，蛋白胨30 g）中，于37℃，静置发酵16 h；发酵结束后，将400公斤发酵液接入到1000公斤南美白对虾全价配合饲料中，加入葡萄糖20公斤、麦芽糖20公斤、蛋白胨10公斤、磷酸氢二钾5公斤、碳酸钙20公斤，接入0.5公斤枯草芽孢杆菌（山东蔚蓝生物科技有限公司，有效菌含量为1×1011CFU/g）、0.5公斤地衣芽孢杆菌（山东蔚蓝生物科技有限公司，有效菌含量是1×1011CFU/g）和0.8公斤酿酒酵母（安琪酵母股份有限公司，有效菌含量是2×1010CFU/g），并混匀；将混匀后的原料装入到呼吸膜发酵袋中，每袋装入10公斤，密封好后进行静置发酵96 h。即可得到富含发酵粘液乳杆菌胞外多糖的增强动物免疫功能的南美白对虾发酵饲料。
将不产胞外多糖的植物乳杆菌（CICC 22696）代替发酵粘液乳杆菌（Limosilactobacillus fermentum）LAN4按照上面的方法制备南美白对虾发酵饲料，并将该发酵饲料作为发酵饲料对照组。
实验分3组，即未发酵的饲料组，发酵饲料对照组，增强免疫功能的发酵饲料组。将900尾南美白对虾幼虾随机分为3 个处理组，每处理组3 个重复，每个重复100 尾，各重复平均体质量无显著差异。每天按体质量的8%投饲料料（发酵饲料需以饲料的干重计），分4次定时、定量投喂, 每天换水、清污，并记录采食量，试验期为55d。
（1）发酵饲料对对虾生长性能的影响
每周统计采食量，并于试验第55 d称取试验虾的重量，并计算增重率、成活率以及饲料转化率。
增重率（%）=（终末体质量-初始体质量）/初始体质量×100%
成活率（%）=（试验结束时虾尾数/试验开始时投放的虾尾数）×100%
由表5结果可知，与未发酵饲料相比，发酵饲料组可以显著提高南美白对虾的增重率与成活率，与发酵饲料对照相比，利用发酵粘液乳杆菌制备的增强免疫功能的发酵饲料的增重率与成活率略有提高。
表5 发酵饲料对南美白对虾生长性能的影响
（2）发酵饲料对南美白对虾血清免疫指标的影响
在试验结束当天，每个重复选取50 尾虾心脏采集血液样品，然后置于无菌的离心管中，5000r·min-14℃ 离心10min，分离血清并保藏在-20℃ 冰箱中，用于测定血清酚氧化酶、超氧化物歧化酶和溶菌酶的活性。使用南京建成生物工程研究所试剂盒测定南美白对虾
血清酚氧化酶、超氧化物歧化酶和溶菌酶的活性，具体测定方法参考使用说明书。
由表6结果可知，与未发酵饲料相比，发酵饲料均可以提高对虾血清酚氧化酶、超氧化物歧化酶和溶菌酶的活性；与发酵饲料对照相比，利用发酵粘液乳杆菌制备的增强免疫功能的发酵饲料可显著提高对虾血清酚氧化酶、超氧化物歧化酶和溶菌酶的活性。可见，利用产胞外多糖发酵粘液乳杆菌制备的增强免疫功能的发酵饲料进一步提高了南美白对虾血清免指标。
表6 发酵饲料对南美白对对虾血清免疫指标的影响
（3）发酵饲料对南美白对虾对肝胰腺免疫指标的影响
在试验结束的当天，每个重复选取30 尾虾采集肝胰腺，并将采集的肝胰腺其放置于-80℃ 冰箱冻藏备用。分析时, 称取一定质量的肝胰腺，按照9 倍体积(M ∶ V) 加入提前在4℃ 冰箱中预冷的0.1 mol·L-1pH6.4的磷酸缓冲液稀释，在冰浴中用匀浆器匀浆，将匀浆液在4℃、5000r·min-1离心10min 后，取上清液，用于酚氧化酶、超氧化物歧化酶和溶菌酶、碱性磷酸酶和丙二醛含量的测定。使用南京建成生物工程研究所试剂盒测定南美白对虾肝胰腺酚氧化酶、超氧化物歧化酶、碱性磷酸酶和溶菌酶的活性及丙二醛的含量，具体测定方法参考使用说明书。
由表7结果可知，与未发酵饲料相比，发酵饲料对照组降低了南美白对虾肝胰腺组织中丙二醛的含量，增加了超氧化物歧化酶的活性，但对酚氧化酶和碱性磷酸酶活性无显著影；与发酵饲料对照组相比，利用发酵粘液乳杆菌制备的增强的免疫功能的发酵饲料可进一步降低南美白对虾肝胰腺组织中丙二醛的含量，并且还可显著增加南美白对虾肝胰腺组织中酚氧化酶、超氧化物歧化酶和碱性磷酸酶的活性。可见，利用产胞外多糖发酵粘液乳杆菌制备的增强免疫功能的发酵饲料进一步提高了南美白对虾肝胰腺免疫指标。
表7 发酵饲料对南美白对虾肝胰腺免疫指标的影响
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Claims (6)
1. 一种强化动物免疫功能的发酵饲料，所述的发酵饲料中含有发酵菌株发酵粘液乳杆菌LAN4和解淀粉盐水球菌HL-6，所述的发酵粘液乳杆菌（Limosilactobacillus fermentum）的保藏编号为：GDMCC NO：62193，解淀粉盐水球菌HL-6（Salinicoccusamylolyticus）的保藏编号为：GDMCC NO：60715。
2. 权利要求1所述的发酵饲料的制备方法，包括下述步骤：将发酵粘液乳杆菌LAN4和解淀粉盐水球菌HL-6的种子液均按体积分数1-5%的接种量接种于灭菌后冷却至室温的发酵培养基中，于37℃～41℃，静置发酵16 -24h；按照发酵液质量：发酵原料的质量比为0.4～0.9：1的比例将发酵液与发酵原料混合，加入营养物，接入枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和酵母菌，并混匀；于10℃～50℃，静置发酵48h～96h，即得；
所述的发酵粘液乳杆菌（Limosilactobacillus fermentum）的保藏编号为：GDMCC NO：62193、解淀粉盐水球菌HL-6（Salinicoccus amylolyticus）的保藏编号为：GDMCC NO：60715；
所述的发酵培养基的配方为：蔬菜汁1L，葡萄糖10～60g，麦芽糖10～60g，氯化钠30～60g，碳酸钙1～10g，蛋白胨10～60 g；
所述的蔬菜汁的制备方法为：将新鲜的大白菜与芥菜切碎后，按照湿重质量比为1：0.5～1.5的比例混合，然后按照蔬菜：水的质量比为1:0.5～1.5的比例加入水，用匀浆机打浆，打浆后用纱布过滤，收集滤液即可得到蔬菜汁；
所述的发酵原料为全价配合饲料或饲料原料，所述的饲料原料为豆粕、麸皮和玉米粉中的一种或其组合物；
所述的营养物为葡萄糖、麦芽糖、蛋白胨、磷酸氢二钾与碳酸钙所组成的混合物，所述的营养物的加入量以加入的营养物的质量占发酵原料总质量百分比计，分别为：葡萄糖0.01%～5%，麦芽糖0.01%～5%，蛋白胨0.01%～5%，磷酸氢二钾0.01%～5%，碳酸钙0.01%～5%。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和酵母菌添加量均为占发酵原料总质量百分比计为0.01%～0.1%，菌剂产品的有效菌含量均为2×1010CFU/g～1×1011CFU/g；所述的发酵粘液乳杆菌LAN4的有效菌浓度为1×108CFU/mL～5×109 CFU/mL；解淀粉盐水球菌HL-6的有效菌浓度为1×108CFU/mL～5×109 CFU/mL。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：发酵在呼吸膜发酵袋、发酵池、发酵木箱或发酵槽装置中进行。
5.权利要求1所述的发酵饲料在制备提高动物免疫力饲料中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，应用过程包括：发酵结束后，以全价配合饲料为原料制备的发酵饲料产品直接进行饲喂；或以饲料原料制备的发酵饲料进行烘干粉碎后，再应用于全价配合饲料中。
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