CN115385980A - 一种坛紫菜源胰脂肪酶抑制肽及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于食品加工技术领域，公开了一种坛紫菜源胰脂肪酶抑制肽及其制备方法和应用。该方法包括将鲍鱼内脏组织捣碎并采用浸提液浸提，离心处理，冷冻干燥，得到鲍鱼内脏粗酶；将坛紫菜粉采用鲍鱼内脏粗酶进行酶解，灭酶，离心处理，喷雾干燥，得到坛紫菜蛋白粉；将坛紫菜蛋白粉为氮源配置发酵培养基，接种纳豆芽孢杆菌发酵反应，离心处理，先采用超滤膜进行膜分离后再采用凝胶过滤柱进行色谱分离，收集第二个吸收峰的组分，得到胰脂肪酶抑制肽。本发明通过鲍鱼内脏酶特定酶、纳豆芽孢杆菌特定菌种对坛紫菜蛋白进行酶解和发酵反应所得胰脂肪酶抑制肽具有高胰脂肪酶抑制率，可以广泛应用于具有健身、减肥营养保健食品中。

Description

一种坛紫菜源胰脂肪酶抑制肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于食品加工技术领域，涉及一种坛紫菜源胰脂肪酶抑制肽及其制备方法和应用。

背景技术

近年来，肥胖发生率呈快速上升趋势，肥胖已成为仅次于吸烟之后的第二个健康危险因素，肥胖也是继癌症和心脑血管疾病之后威胁人类健康的第三大疾病。肥胖和饮食密切相关，当人体摄入食物的热量大于消耗量时，多余的热量会转变为脂肪，在体内积聚形成肥胖，食物脂肪的过量摄入会增加发生肥胖的风险。因此，控制饮食中脂肪的摄入和机体对于脂肪的吸收对改善肥胖有重要作用。胰脂肪酶能将膳食中的脂肪分解为小分子的甘油和脂肪酸，人体可以在肠道内再吸收并合成新的脂肪。抑制肥胖的最有效的方法之一是抑制小肠中的胰脂肪酶活性，使胰脂肪酶丧失部分分解能力，减少脂肪再合成，从源头上控制脂肪进入血液，从而降低脂肪的消化和吸收，起到减肥降脂的作用。市面上许多减肥药虽疗效显著但其副作用也明显，如奥利司他(Orlistat)具有失眠、乏力、增加心率以及会导致人体出现胃肠排气增多、脂肪泻等不良反应。而天然食物源制备得到的活性多肽则具有生物活性高、无副作用、易吸收的特点。因此，从天然食物中寻找高效、低毒、低副作用的胰脂肪酶抑制肽已成为食品生物技术界、营养学界研究的热点。

坛紫菜是我国特有的传统海水养殖大宗品种，其具有高蛋白、高纤维、低热值以及低脂肪的特点，其中蛋白质含量可达25-50％，含有丰富的氨基酸，是生物活性肽的理想蛋白源。然而，作为一种典型的藻类植物，有效的破壁是制备坛紫菜蛋白的重要前提。另一方面，纳豆是日本传统的健康食品，具有良好的降脂、降血压功效。其中，纳豆芽孢杆菌在发酵过程中通过分解大豆蛋白进行繁殖，进而产生的纳豆激酶、维生素K等被认为是纳豆具有降脂、降血压功效的关键原因。值得关注的是，纳豆芽孢杆菌在发酵过程中也会分泌大量的蛋白酶，已有学者报道其能分解鱼类蛋白产生抗菌肽。与动物蛋白以及陆生植物蛋白不同，坛紫菜蛋白主要成分为藻胆蛋白，纳豆芽孢杆菌在参与坛紫菜蛋白过程中是否能产生活性肽，迄今为止未见相关报道。关于从坛紫菜中提取胰脂肪酶抑制肽的研究仍属于技术空白点。

发明内容

本发明的目的是为了寻找一种从天然食物源中制备得到胰脂肪酶抑制肽，而提供一种从坛紫菜中(植物中)提取胰脂肪酶抑制肽的制备方法，打破了从坛紫菜中提取胰脂肪酶抑制肽的技术空白点，该胰脂肪酶抑制肽具有高胰脂肪酶抑制率、高纯度且低副作用的优点。

具体地，本发明通过以下技术解决方案实现：

本发明的第一方面提供了一种坛紫菜源胰脂肪酶抑制肽的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)鲍鱼内脏粗酶的制备：将鲍鱼内脏组织捣碎并采用浸提液浸提，将所得浸提产物离心处理提取上清液，之后将所得上清液冷冻干燥后制得鲍鱼内脏粗酶；

(2)坛紫菜蛋白粉的制备：利用步骤(1)中所得鲍鱼内脏粗酶对坛紫菜粉进行酶解，灭酶后进行离心处理提取酶解上清液，将酶解上清液进行喷雾干燥制得坛紫菜蛋白粉；

(3)胰脂肪酶抑制肽的制备：将步骤(2)中所得坛紫菜蛋白粉为氮源配制发酵培养基，接种纳豆芽孢杆菌并进行发酵，发酵结束后离心取发酵上清液，利用截留分子量为3kDa超滤膜将所得发酵上清液进行超滤处理，收集透过超滤膜的外液，再将外液进行冷冻干燥后复溶，再上样凝胶过滤柱进行色谱分离，收集第二个吸收峰的组分，得到胰脂肪酶抑制肽。

在一种优选实施方式中，步骤(1)中，所述鲍鱼内脏为鲜活皱纹盘鲍内脏、鲜活杂色鲍内脏、鲜活九孔鲍内脏中的至少一种。所述鲍鱼内脏取完后需立即处理或保存于-18℃以下温度3个月以内。

在一种优选实施方式中，步骤(1)中，所述浸提液为水、pH值为6.5～8.5的磷酸盐和Tris-HCl缓冲液中的至少一种。

在一种优选实施方式中，步骤(2)中，所述酶解在水的存在下进行，所述水的添加量为坛紫菜粉体积的20～40倍，所述鲍鱼内脏粗酶的添加量为坛紫菜粉质量的3～11％。

在一种优选实施方式中，步骤(2)中，所述酶解反应的条件包括酶解温度为30～50℃，酶解时间为1.5～4h。

在一种优选实施方式中，步骤(3)中，所述纳豆芽孢杆菌的接种量为发酵培养基质量的1～9％。

在一种优选实施方式中，步骤(3)中，所述发酵反应的条件包括发酵pH值为3.0～9.0，发酵时间为8～40h。

在一种优选实施方式中，步骤(3)中，所述色谱分离的条件包括凝胶过滤柱为Sephadex G-15凝胶柱或SuperdexTM peptide 10/300GL凝胶柱，流动相为超纯水，流速为0.1～1.0mL/min。

本发明的第二方面提供了一种坛紫菜源胰脂肪酶抑制肽，其采用如上方法制备制得。

本发明的第三方面提供了所述坛紫菜源胰脂肪酶抑制肽在具有健身、减肥营养保健食品中中的应用。

本发明通过采用鲍鱼内脏酶这一特定酶对坛紫菜进行酶解反应，极大幅度提高了坛紫菜蛋白的提取率，为坛紫菜的利用率提供了基础保障，并且创新性地使用纳豆芽孢杆菌这一特定菌种对坛紫菜蛋白进行发酵从而制得胰脂肪酶抑制肽，打破了从坛紫菜中提取胰脂肪酶抑制肽的技术空白点，同时通过超滤膜和凝胶过滤柱相结合对坛紫菜源胰脂肪酶抑制肽进行分离纯化，经上述特定的制备方法制得的坛紫菜源胰脂肪酶抑制肽具有高胰脂肪酶抑制率。本发明制备得到的胰脂肪酶抑制肽具有高胰脂肪酶抑制率、高纯度且低副作用的优点，可以广泛应用于健身、减肥营养保健食品中，对促进人类健康具有重要且深远的意义。

附图说明

图1为测试例1中纳豆菌接种量对发酵液胰脂肪酶抑制活性的影响；

图2为测试例2中pH值对发酵液胰脂肪酶抑制活性的影响；

图3为测试例3中发酵时间对发酵液胰脂肪酶抑制活性的影响；

图4为实施例1中超滤膜对胰脂肪酶抑制肽的分离效果；

图5为实施例1中凝胶柱层析对胰脂肪酶抑制肽的纯化效果；

图6为坛紫菜在不同破壁方式下的蛋白提取率和固形物提取率对比；

图7为坛紫菜在不同菌种发酵后测得外液中胰脂肪酶抑制肽的得率和半数抑制浓度IC₅₀对比。

具体实施方式

坛紫菜中藻胆蛋白是胞内蛋白，因此对细胞壁的破壁效果关系到紫菜蛋白的利用率。鲍鱼内脏是鲍鱼在加工过程中产生的主要副产物，占鲍鱼体重的20～30％，通常会被丢弃或加工成低价值饲料，造成环境污染和资源浪费。目前，从鲍鱼内脏和消化液中鉴定出多种多糖水解酶，包括β-甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶和褐藻胶裂解酶等，是一种理想的酶制剂原料。本申请的发明人通过深入且广泛的研究发现，采用鲍鱼内脏酶对坛紫菜进行酶解不仅可以显著提升坛紫菜中藻胆蛋白细胞壁的破壁效果，大幅度提升紫菜蛋白的提取率，从而提高坛紫菜的利用率，而且还充分发挥了废弃鲍鱼内脏的价值，变废为宝，使得鲍鱼内脏得到高效利用，从而进一步降低了坛紫菜源胰脂肪酶抑制肽的制备成本。鲍鱼内脏可以是新鲜鲍鱼内脏，也可以是冻存的鲍鱼内脏。优选地，所述鲍鱼内脏为鲜活皱纹盘鲍内脏、鲜活杂色鲍内脏、鲜活九孔鲍内脏中的至少一种，且取完后需立即处理或保存于-18℃以下温度3个月以内。

本发明对步骤(1)中所采用的浸提液的种类没有特别的限定，只要能够充分将鲍鱼内脏粗酶提取出来即可，例如，可以为水、pH值为6.5～8.5的磷酸盐、Tris-HCl缓冲液中的至少一种。此处采用的水可以为常温水，也可以为低温冷藏蒸馏水。所述磷酸盐和Tris-HCl缓冲液的浓度可以为10～30mM。

由步骤(1)所得鲍鱼内脏粗酶的酶活力优选为2000～2500U/g，例如2000U/g、2100U/g、2200U/g、2300U/g、2400U/g、2500U/g以及它们之间的任意值。本发明采用DNS法测定鲍鱼内脏粗酶的酶活力，其中，酶活力定义如下：在37℃条件下，每小时分解4％坛紫菜产生1μg还原糖所需要的酶量定义为一个酶活力单位。

步骤(2)中，所述酶解一般在水的存在下进行。本发明对制备坛紫菜蛋白粉过程中所使用的坛紫菜粉、鲍鱼内脏粗酶以及水的用量没有特别的限定，优选地，所述水的添加量为坛紫菜粉质量的20～40倍，例如20倍、25倍、30倍、35倍、40倍以及它们之间的任意值。优选地，所述鲍鱼内脏粗酶的添加量为坛紫菜粉质量的3～11％，例如3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％以及它们之间的任意值。本发明对酶解反应条件没有特别的限定，只要鲍鱼内脏粗酶能够将坛紫菜进行充分破壁即可。优选地，步骤(2)中，所述酶解反应条件包括酶解温度为30～50℃，例如30℃、35℃、40℃、45℃、50℃以及它们之间的任意值。所述酶解反应条件包括酶解时间为1.5～4h，例如1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h以及它们之间的任意值。当酶解反应条件控制在上述优选范围时，可以将坛紫菜进行彻底的破壁，大幅度提升坛紫菜蛋白的提取率，提高坛紫菜的利用率。当酶解反应完全后进一步对酶解反应物进行灭酶。本发明对灭酶的条件没有特别的限定，通常在80～100℃的高温下对鲍鱼内脏粗酶进行灭酶5～20min即可。优选地，本发明需要对所得酶解上清液进行喷雾干燥，喷雾干燥条件包括进样温度可以为170℃～180℃，例如170℃、175℃、180℃以及它们之间的任意值；进料量可以为15～20％，例如15％、16％、17％、18％、19％、20％以及它们之间的任意值；固定热风流量可以为25～30m³/h，例如25m³/h、26m³/h、27m³/h、28m³/h、29m³/h、30m³/h以及它们之间的任意值。

食品被发酵的本质是由于微生物分解代谢食物中的营养物质得到新的次生代谢物质和转化物质赋予发酵食品独特的风味和营养。本发明将制得的坛紫菜蛋白粉为氮源配制发酵培养基，接种纳豆芽孢杆菌并进行发酵反应从而制备得到胰脂肪酶抑制肽。采用发酵的方式制得胰脂肪酶抑制肽不仅纯度高，而且还具有高的胰脂肪酶抑制率。上述发酵培养基可以按下述方式进行制备得到：将坛紫菜蛋白粉6g、葡萄糖3g、磷酸二氢钾0.3g、磷酸氢二钾0.75g、硫酸镁1.5g以及300mL蒸馏水进行混匀、调节pH至7.0并巴氏杀菌30min制得。为了制备得到高的胰脂肪酶抑制率，需要对发酵反应中的纳豆芽孢杆菌接种量、发酵pH值以及发酵时间进行合理选择。优选地，步骤(3)中，以发酵培养基的质量计，所述纳豆芽孢杆菌的接种量为1～9％，例如1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％以及它们之间的任意值。步骤(3)中，发酵反应条件包括发酵pH值可以为3.0～9.0，例如3.0、5.0、7.0、9.0以及它们之间的任意值。发酵时间可以为8～40h，例如8h、16h、24h、32h、40h以及它们之间的任意值。经上述发酵反应制得的得到胰脂肪酶抑制肽，需要对其进行分离纯化。将离心得到的发酵上清液首先采用超滤膜对其进行膜分离，收集透过超滤膜的外液，在将外液进行冷冻干燥后进行复溶，再上样于凝胶过滤柱进行色谱分离，收集第二个吸收峰的组分即为胰脂肪酶抑制肽。其中，所述色谱分离的条件包括凝胶过滤柱为Sephadex G-15凝胶柱，流动相为超纯水，流速为0.1～1mL/min。

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

制备例1鲍鱼内脏粗酶的制备

将鲍鱼内脏剁碎后加入4倍体积量的低温冷藏蒸馏水进行浸提，在温度为4℃、离心力为10000g的条件下进行离心处理20min，采用双层绢布过滤上清液，冷冻干燥即得鲍鱼内脏粗酶粉末。采用DNS法测定鲍鱼内脏粗酶的酶活力，酶活力定义：在37℃条件下，每小时分解4％坛紫菜产生1μg还原糖所需要的酶量定义为一个酶活力单位。本次实验提取所得鲍鱼内脏粗酶的酶活力为2300U/g。

制备例2坛紫菜蛋白粉的制备

(1)将坛紫菜在30℃烘箱中烘干至恒重并磨成粉末，过40目筛得到坛紫菜干粉；

(2)取上述坛紫菜干粉500g，加入25倍体积的去离子水和7％制备例1制备得到的鲍鱼内脏粗酶，在35℃温水中酶解2.5h得到酶解液；

(3)将上述酶解液置于100℃沸水浴中10min进行灭酶处理后在离心力为8000g的条件下离心处理15min，将所得上清液喷雾干燥制得紫菜蛋白粉。其中，喷雾干燥条件为：进样温度为170℃、进料量为15％，固定热风流量为25m³/h。

测试例1纳豆芽孢杆菌接种量对发酵液胰脂肪酶抑制活性的影响

(1)将活化后的纳豆芽孢杆菌从斜面培养基上取两环至LB培养基中，于37℃、200r/min的恒温摇床下培养24h，制得种子菌悬液。

(2)于1000mL锥形瓶中加入制备例2中所得的坛紫菜蛋白粉6g、葡萄糖3g、磷酸二氢钾0.3g、磷酸氢二钾0.75g、硫酸镁1.5g以及300mL蒸馏水混匀后调节体系pH至7.0，巴氏杀菌30min，得到发酵培养基。

(3)待步骤(2)中所得发酵培养基冷却至室温后，以发酵培养基的质量计，分别接种步骤(1)中所得种子菌悬液1％、3％、5％、7％、9％，并于37℃、200r/min的恒温摇床下培养24h，得到发酵液。

(4)将步骤(3)中所得发酵液置于沸水浴20min灭菌后，在离心力为10000g的条件下进行离心处理15min提取发酵上清液。以p-NPA(乙酰对硝基苯酯，下同)为底物测定发酵上清液的胰脂肪酶抑制率，结果如图1所示。由图1可知，在接种量为7％时，发酵上清液的胰脂肪酶抑制率最高。

测试例2：pH值对发酵液胰脂肪酶抑制活性的影响

(1)将活化后的纳豆芽孢杆菌从斜面培养基上取两环至LB培养基中，于37℃、200r/min的恒温摇床下培养24h，制得种子菌悬液。

(2)于1000mL锥形瓶中加入制备例2中所得的坛紫菜蛋白粉6g、葡萄糖3g、磷酸二氢钾0.3g、磷酸氢二钾0.75g、硫酸镁1.5g以及300mL蒸馏水进行混匀后将体系pH分别调节至3.0、5.0、7.0、9.0、11.0，巴氏杀菌30min，得到发酵培养基。

(3)待步骤(2)中所得发酵培养基冷却至室温后，以发酵培养基的质量计，分别接种步骤(1)所得种子菌悬液7％，并于37℃、200r/min的恒温摇床培养下24h，得到发酵液。

(4)将步骤(3)中所得发酵液置于沸水浴20min灭菌后，在离心力为10000g的条件下进行离心处理15min提取发酵上清液。以p-NPA为底物测定发酵上清液的胰脂肪酶抑制率，结果如图2所示。由图2可知，在发酵pH为7.0时，发酵上清液的胰脂肪酶抑制率最高。

测试例3：发酵时间对发酵液胰脂肪酶抑制活性的影响

(1)将活化后的纳豆芽孢杆菌从斜面培养基上取两环至LB培养基中，于37℃、200r/min恒温摇床下培养24h，制得种子菌悬液。

(2)于1000mL锥形瓶中加入制备例2中所得的坛紫菜蛋白粉6g、葡萄糖3g、磷酸二氢钾0.3g、磷酸氢二钾0.75g、硫酸镁1.5g以及300mL蒸馏水进行混匀后调节体系pH至7.0，巴氏杀菌30min，得到发酵培养基。

(3)待步骤(2)中所得发酵培养基冷却至室温后，以发酵培养基的质量计，分别接种步骤(1)所得种子菌悬液7％，于37℃、200r/min恒温摇床分别培养8h、16h、24h、32h、40h，得到发酵液。

(4)将步骤(3)中所得发酵液置于沸水浴20min灭菌后，在离心力为10000g的条件下进行离心处理15min提取发酵上清液。以p-NPA为底物测定发酵上清液胰脂肪酶抑制率，结果如图3所示。由图3可知，在发酵时间为24h时，发酵上清液的胰脂肪酶抑制率最高。

实施例1胰脂肪酶抑制肽的制备

(1)将活化后的纳豆芽孢杆菌从斜面培养基上取两环至LB培养基中，于37℃、200r/min恒温摇床下培养24h，制得种子菌悬液。

(2)于1000mL锥形瓶中加入制备例2中所得的坛紫菜蛋白粉6g、葡萄糖3g、磷酸二氢钾0.3g、磷酸氢二钾0.75g、硫酸镁1.5g以及300mL蒸馏水进行混匀后调节体系pH至7.0，巴氏杀菌30min，得到发酵培养基。

(3)待步骤(2)中所得发酵培养基冷却至室温后，以发酵培养基的质量计，分别接种步骤(1)所得种子菌悬液7％，于37℃、200r/min恒温摇床分别培养24h，得到发酵液。将所得发酵液置于沸水浴20min灭菌后，在离心力为10000g的条件下进行离心处理15min提取发酵上清液。

(4)使用3kDa超滤膜对步骤(3)中所得发酵上清液进行超滤，分别将内液、外液冻干后测定其胰脂肪酶抑制率，结果如图4所示。由图4可知，外液对胰脂肪酶IC₅₀为7.15mg/mL，内液对胰脂肪酶IC₅₀为25.40mg/mL，说明外液对胰脂肪酶具有高的抑制率。

(5)将步骤(4)中超滤所得的外液冷冻干燥后，复溶以达到浓缩的目的。将复溶液上样于SuperdexTM peptide 10/300GL凝胶柱进行分离纯化，检测波长为220nm。使用超声脱气后的超纯水流洗凝胶柱60min，流速为0.5mL/min，结果如图5所示。由图5可知，凝胶柱层析一共得到三个峰，分别将三个峰冷冻干燥，测得第二个吸收峰的胰脂肪酶抑制率最高，其IC₅₀为1.81mg/mL。收集第二个吸收峰的组分，得到所需的胰脂肪酶抑制肽。

对比例1

采用超声法提取紫菜蛋白，具体方法为将500g坛紫菜干粉(其制备方法参考制备例2步骤(1))和25倍体积蒸馏水混匀，在冰浴中、350W超声下破壁25min，每超声6s，间隔9s。超声结束后在离心力为8000g的条件下进行离心处理15min，测定上清液的蛋白提取率及固形物提取率，结果如图6所示。

对比例2

采用冻融法提取紫菜蛋白，具体方法为将500g坛紫菜干粉(其制备方法参考制备例2步骤(1))和25倍体积去离子水进行混匀，-20℃冷冻6h后于4℃下放置9h待其完全融化，重复冻融3次。冻融结束后在离心力为8000g的条件下进行离心处理15min，测定上清液的蛋白提取率及固形物提取率，结果如图6所示。

对比例3

采用溶胀法提取紫菜蛋白，具体方法将500g坛紫菜干粉(其制备方法参考制备例2步骤(1))和25倍体积去离子水进行混匀，于4℃条件下静置2d。溶胀结束后在离心力为8000g的条件下进行离心处理15min，测定上清液的蛋白提取率及固形物提取率，结果如图6所示。

对比例4

采用商业复合酶酶解法提取紫菜蛋白，具体方法为将500g坛紫菜干粉(其制备方法参考制备例2步骤(1))和25倍体积去离子水进行混匀，采用纤维素酶和木管蛋白酶以质量比1:1的复合酶进行酶解，酶解条件包括加酶量为7％(以坛紫菜的质量计)、酶解温度为35℃，酶解时间为2.5h得到复合酶解液。酶解结束后，将上述酶解液置于100℃沸水浴中10min进行灭酶处理后在离心力为8000g的条件下进行离心处理15min，测定上清液的蛋白提取率及固形物提取率，结果如图6所示。

从图6结果可知，采用鲍鱼内脏酶这一特定酶对坛紫菜进行酶解反应，可以极大幅度提高了坛紫菜蛋白的提取率。

对比例5

采用酿酒酵母菌发酵提取坛紫菜源胰脂肪酶抑制肽，具体方法为将实施例1中的纳豆芽孢杆菌替换为酿酒酵母菌，其余条件与实施例1均相同，分别测得外液中胰脂肪酶抑制肽的得率和半数抑制浓度IC₅₀，结果如图7所示。

对比例6

采用德式乳杆菌发酵提取坛紫菜源胰脂肪酶抑制肽，具体方法为将实施例1中的纳豆芽孢杆菌替换为德式乳杆菌，其余条件与实施例1均相同，分别测得外液中胰脂肪酶抑制肽的得率和半数抑制浓度IC₅₀，结果如图7所示。

从图7结果可知，纳豆芽孢杆菌这一特定菌种对坛紫菜蛋白进行发酵，所得胰脂肪酶抑制肽具有高的胰脂肪酶抑制率，同时还具有高的胰脂肪酶抑制肽得率。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种坛紫菜源胰脂肪酶抑制肽的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)鲍鱼内脏粗酶的制备：将鲍鱼内脏组织捣碎并采用浸提液浸提，将所得浸提产物离心处理提取上清液，之后将所得上清液冷冻干燥后制得鲍鱼内脏粗酶；

(2)坛紫菜蛋白粉的制备：利用步骤(1)中所得鲍鱼内脏粗酶对坛紫菜粉进行酶解，灭酶后进行离心处理提取酶解上清液，将酶解上清液进行喷雾干燥制得坛紫菜蛋白粉；

(3)胰脂肪酶抑制肽的制备：将步骤(2)中所得坛紫菜蛋白粉为氮源配制发酵培养基，接种纳豆芽孢杆菌并进行发酵，发酵结束后离心取发酵上清液，利用截留分子量为3kDa超滤膜将所得发酵上清液进行超滤处理，收集透过超滤膜的外液，再将外液进行冷冻干燥后复溶，再上样凝胶过滤柱进行色谱分离，收集第二个吸收峰的组分，得到胰脂肪酶抑制肽。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述鲍鱼内脏为鲜活皱纹盘鲍内脏、鲜活杂色鲍内脏、鲜活九孔鲍内脏中的至少一种，且取完后需立即处理或保存于-18℃以下温度3个月以内。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述浸提液为水、pH值为6.5～8.5的磷酸盐和Tris-HCl缓冲液中的至少一种。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述酶解在水的存在下进行，所述水的添加量为坛紫菜粉体积的20～40倍，所述鲍鱼内脏粗酶的添加量为坛紫菜粉质量的3～11％。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述酶解反应的条件包括酶解温度为30～50℃，酶解时间为1.5～4h。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述纳豆芽孢杆菌的接种量为发酵培养基质量的1～9％。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述发酵反应的条件包括发酵pH值为3.0～9.0，发酵时间为8～40h。

8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述色谱分离的条件包括凝胶过滤柱为Sephadex G-15凝胶柱或SuperdexTM peptide 10/300GL凝胶柱，流动相为超纯水，流速为0.1～1.0mL/min。

9.一种坛紫菜源胰脂肪酶抑制肽，其特征在于，采用如权利要求1-8中任一项所述的方法制备制得。

10.权利要求9所述坛紫菜源胰脂肪酶抑制肽在具有健身、减肥营养保健食品中的应用。

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