KR20110043040A - 광범위 항균활성 및 소화효소를 보유한 미생물의 분리 및 이를 이용한 기능성 대나무발효액의 제조방법 - Google Patents

광범위 항균활성 및 소화효소를 보유한 미생물의 분리 및 이를 이용한 기능성 대나무발효액의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항균활성 및 소화효소활성을 보유하고 있는 비병원성 미생물을 이용하여 대나무를 발효함으로써 항균력과 소화력, 항산화효과 등이 모두 강화되어 있는 대나무발효액의 제조방법에 관한 것으로 제조 공정에서 물의 사용이 요구되는 보조사료, 발효식품 등의 제조 시 물을 대신하여 본 발명에 의한 발효액을 사용함으로써 제품의 기능성을 손쉽게 증가시킬 수 있는 기능성 강화용 대나무발효액을 제공하는 기술이다.
대나무, 항균활성, 소화력, 기능성, 대나무발효액

Description

광범위 항균활성 및 소화효소를 보유한 미생물의 분리 및 이를 이용한 기능성 대나무발효액의 제조방법{Isolation of Microbes with Wide Range of Antibiotic and Digestive Activities and Method of Manufacturing Functional Bamboo-fermented Water Using These Microbes}
본 발명은 식품이나 사료 등 발효 제품의 제조시 보통 사용되는 물을 대신하여 사용함으로써 항균력, 소화력, 항산화능 등의 기능성을 손쉽게 강화할 수 있는 발효액의 제조방법에 관한 것으로 대나무 흰가루에서 분리된 미생물 중 항균활성 및 프로테아제, 아밀라아제, 셀룰라아제, 리파아제 등의 소화효소 활성을 두루 갖는 미생물을 분리하고 이를 이용하여 대나무를 발효시킴으로써 제조된다.
최근 들어 식품과 사료의 제조 시 그 기능성을 강화하여 이를 소비하는 사람이나 가축의 건강을 유지하고자 하는 시도가 급격히 증가하고 있다. 대개 기능성 식품의 제조는 기능성을 나타내는 물질을 특정 동식물로부터 직접 추출하거나 기능성물질이 생성되도록 가공한 뒤 이를 추출하여 제조하고자 하는 식품에 첨가하는 방법이 주를 이루고 있다. 그러나 아직까지 이러한 식품제조 과정에서 흔히 사용하는 보통의 물 대신, 기능성이 강화된 변형된 액상을 사용함으로써 제조식품이나 사료의 기 능성을 확대하고자 하는 시도는 아직까지 있지 아니하다. 따라서 손쉽게 보통의 물을 기능성이 있는 액상 물로 가공사용할 수 있다면 기능성 물질의 첨가이전에 기본적으로 제품의 기능성을 향상시킬 수 있는 방법이 될 수 있다. 문제는 가급적 광범위하게 사용될 수 있도록 안전성과 기능성이 담보되어 있는 기능성 강화용 액상을 제조하는 방법을 개발하는 데 있을 것이다. 본 기술은 항균활성 및 각종 소화효소를 보유한 미생물들로 대나무를 일차 발효한 액상을 물 대신 사용하고자 하였는데, 그 이유는 다음과 같다.
첫째, 전통적으로 대나무는 각종 질병의 예방 및 치료에 사용될 수 있는 약재중의 하나로 인정받아 동의보감이나 신농본초경 등 고문서에도 그 용도 및 효능에 대해 자주 언급되고 있으며 근자에 이르러 그 효능을 과학적으로 입증하고자 하는 연구가 뒤따르고 있는 바, 대나무약재로 사용되는 죽엽, 죽여, 죽력, 죽황, 죽초액 등 대나무의 종류나 부위 또는 이의 가공방식에 따라 달리 제조되는 대나무 추출물들에 대한 실험결과를 통해 그 효능이 폭넓게 입증되고 있다. 예컨대 한국산 왕대, 솜대, 맹종죽, 조릿대 및 오죽의 항산화 효과(이민자와 문갑순, 한국식품과학회지, 2003, 35:1226-1232), 분죽 잎 추출물의 피부손상 회복효과(채세림 등, 방사선방어학회지, 2007, 32: 59-64, 32: 65-69), 죽력의 지질대사 및 여드름 개선 효과(나명순, 조선대 대학원논문집, 89p., 2004), 국내산 대나무 줄기와 잎의 에탄올 추출물의 항균활성 (백종원 등, 한국식품과학회지, 2002, 34:1073-1078 ), 대나무(이대)잎 추출물이 지방 및 고콜레스테롤 식이 급여에 의한 흰쥐의 지방 대사에 미치는 효과(한성희와 신미경, 한국식생활문화학회지, 2002, 17:30-36), 대나무 에탄올추 출물의 항산화 효과 및 아질산염 소거작용(임진아 등, 한국식품과학회지, 2004, 36:306-310), 대나무 Ethanol 추출물의 혈장 지질저하 효과(고영란 등, 한국영양학회 03 연합학술대회, 2003), 대나무 기름의 항균효과(이숙경, 한국식품위생안전성학회지, 2000, 15:55-59), 무좀균과 비듬균에 대한 대나무 기름의 항균효과(이숙경, 한국식품위생안전성학회지, 2003, 18:113-117), 대나무 추출물의 기능성 및 항균활성 (김낙구 등, 한국식품저장유통학회지, 2001, 8:475-480), 대나무 속 껍질 추출물로부터 타이로시네이즈 억제력과 항산화 활성을 갖는 페놀성 화합물의 분리 및 특성과 구조 결정(이은창, 공주대 대학원논문집, 66p., 2002), 대나무 추출물의 항고혈압효과(이혜숙, 인제대 대학원논문집, 55p, 2006) 등 주로 대나무 추출물의 성분과 항균효과, 항산화효과를 포함한 인간의 각종 질병에 관련된 생리활성 기능 등에 관한 연구들이 주를 이루고 있으며, 이러한 연구 결과들은 대나무의 안전성과 기능성을 입증하고 있다.
둘째, 미생물을 이용하여 대나무를 발효할 경우 기능성을 강화할 수 있는 연구결과들도 이미 보고되어 있다. 예컨대, 대나무 유래의 미생물을 이용한 발효액 및 그의 용도(김득수, 특허번호: 1006427980000), 대나무 유래의 미생물을 이용한 발효액 및 그의 제조 방법(이승원, 출원번호: 1020050037758), 그리고 대나무 잎 유래 곰팡이를 이용한 발효액이 어병세균의 증식에 미치는 영향(유진하, 한국양식학회 04 수산관련학회 공동학술대회 발표요지집, pp.407-408, 2004) 등이 그것으로 이들은 대나무의 껍질, 잎, 줄기, 뿌리 등의 대나무 재료위에 고두밥 또는 맵쌀밥을 놓아두어 균을 자연 증식시킨 다음, 여기에 다시 설탕 등의 당액을 추가하여 발효시키 는 과정에서 용출되어 나오는 소량의 용출액을 발효원액으로 이용, 가열 등의 방법으로 최종산물을 만들고 있다.
따라서 이러한 예들을 보면 물을 사용하는 통상의 식품제조나 사료제조시 대나무의 효력 및 미생물의 항균력과 소화력이 보강될 수 있는 대나무발효액을 제조하여 물 대신 사용함으로써 제조 식품이나 사료의 기능성을 손쉽게 강화할 수 있을 것임을 예견할 수 있다.
예컨대, 식품의 발효는 대개 발효를 통해 기능성과 풍미를 향상시키고 또 보존 기간을 길게 하려는 목적이 있다. 식품발효는 발효미생물을 이용한 일종의 소화이기 때문에 발효과정 중 식품의 소화가 증진된다면 발효의 속도를 향상시킬 수 있을 것이며 항균력이 강화된다면 잡균에 의한 부패를 막음으로써 식품의 보존기간을 늘릴 수 있다. 또한 어류 양식의 경우에는 사료 외에도 항생제, 영양제, 소화제 및 간장약과 같은 4가지 보조사료제를 통상적으로 추가 사용하고 있다. 이러한 추가기능들은 대나무추출액에서 얻어지는 항균활성 및 면역력증강 효과, 발효과정에 첨가하게 되는 다수 미생물에 의해 분비되는 소화효소들에 의한 소화력 증강 및 프로바이오틱 미생물들에 의한 항균활성 증가를 통해 제공할 수 있을 것이다. 이 같은 목적이 가능하기 위해서는 대나무를 이용하되 이를 발효하는데 도움을 줄 다양한 소화효소를 분비할 수 있고 동시에 항균력을 보유하고 있는 미생물을 선별, 사용하는 것이 필요하다. 본 발명에서는 대나무의 발효가능성이 높은 미생물을 분리하기 위하여 직접 대나무로부터 다양한 미생물들을 일차 분리한 뒤 이들 중 광범위 항균활성을 보이면서 동시에 프로테아제, 아밀라아제, 셀룰라아제, 리파아제 등의 소화효소 활성을 모두 갖는 미생물을 최종 선별하여 대나무를 발효시킴으로써 식품이나 사료제조시 보통의 물 대신 이를 사용할 수 있는 기능성 발효액을 제조하고자 한다. 또한, 이러한 발효액의 제조를 위해 선별된 미생물을 일차 배양하고자 할 때 미생물의 영양물질로 사용되는 대상 물질의 잉여물은 미생물의 배양이 끝난 이후에 손쉽게 배양액으로부터 분리, 제거되어야 한다. 이는 식품이나 사료의 제조과정에 물 대신 사용할 때 발효액에 포함되어 있는 대상물질의 찌꺼기가 제조식품이나 사료의 미관과 풍미를 해치지 않도록 해야 하기 때문이다. 대나무는 발효가 되면서도 그 형체가 쉽게 분해되지 않기 때문에 발효 후 남은 대나무 찌꺼기를 쉽게 제거할 수 있다는 점에서 매우 편리한 장점이 있다.
본 발명의 대나무발효액의 제조방법은 대나무 흰가루로부터 광범위 항균력 및 소화력을 갖는 미생물을 선별하는 단계 및 상기 미생물을 이용하여 대나무를 발효시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 대나무청국장 발효액의 제조방법에서 상기 대나무 흰가루는 분죽 또는 맹종죽의 흰가루인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 대나무청국장 발효액의 제조방법에서 사용할 미생물의 일차선발은 상기 대나무 흰가루를 미생물의 공급원으로 이용하되, 흰가루에서 직접 분리하거나 흰가루를 이용하여 대나무를 일차 발효한 다음 이 액으로부터 미생물을 분리하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 대나무청국장 발효액의 제조방법에서 대상 미생물의 이차 선발은 일차 선발한 미생물 중에서 스트렙토코거스 파이오제네스(Streptococcus pyogenes , Sp), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus , Sa), 에스체리치아 콜리(Escherichia coli, Ec), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa, Pa), 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium, St), 클렙시엘라 옥시토 카(Klebsiella oxytoca, Ko), 엔테로박터 클로아카에(Enterobacter cloacae, Ecl), 쉬겔라 손네이(Shigella sonnei, Ss), 비브리오 리토랄레스(Vibrio litoralis, Vl), 칸디다 알비칸스(Candida albicans, Ca), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis, Bs) 등을 항균력 시험 대상 미생물로 한 항균력 시험에서 1가지 이상의 시험대상 미생물에 대하여 항균활성을 나타내는 것과 프로테아제, 아밀라아제, 셀룰라아제, 리파아제의 소화효소를 분비하는 능력을 두루 갖는 것을 선별 기준으로 하여 최종 선별하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 대나무청국장 발효액의 제조방법에서 대나무발효액의 제조에 최종 사용되는 선별된 미생물은 상기 미생물 배양에서 분리한 하나 이상의 미생물인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 대나무발효액의 제조방법에서 대나무발효액 제조단계의 발효방법은 증류수에 대나무의 가공과정에서 흔히 생성되는 대나무 톱밥 등 대나무 분말을 10 내지 20 퍼센트(%) 비율로 넣고 121℃에서 1시간 고압, 증자한 배양배지에 상기 선별된 미생물을 각각 접종하여 30℃에서 1주일간 사전배양한 뒤 이를 혼합하여 스타터(Starter)로 사용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 대나무발효액의 제조방법에서 대나무발효액 제조단계의 발효방법은 대나무 200 그람을 증류수, 지하수, 또는 상수도 1 내지 5 리터에 넣고 미리 배양한 상기 스타터 미생물들을 5 내지 10 퍼센트(%)의 비율로 접종하여 발효를 개시하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 대나무발효액의 제조방법에서 대나무발효액 제조단계의 발효온도는 15 내지 60 ℃인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 대나무청국장 발효액의 제조방법에서 대나무발효액 제조단계의 발효기간은 3 내지 24개월인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 대나무청국장 발효액의 제조방법에서 대나무발효액은 상기 발효액의 상등액 만을 취한 것을 특징으로 한다.
상기와 같은 단계를 거쳐 제조되는 대나무발효액은 물의 사용이 필요한 식품이나 사료의 제조시에 물대신 사용하게 되며, 사용목적에 따라 이를 곧바로 사용하거나 여과과정을 거치거나, 100℃에서 1시간 중탕 또는 121℃에서 30분간 멸균한 뒤 사용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 대나무 흰가루로부터 총 458종의 미생물을 1차 분리한 뒤 이로부터 1종 이상의 항균력 테스트용 미생물에 대해 항균력을 나타내면서 동시에 프로테아제, 아밀라아제, 셀룰라아제, 리파아제 등 4종의 소화효소를 모두 분비하는 미생물을 수종 분리하였는바, 이들을 이용하여 대나무를 발효할 경우 대나무의 발효 효율이 증가할 뿐만 아니라 이로써 제조한 발효액은 항균력, 항산화력 등이 모두 증가하여 식품제조나 사료의 제조시 물을 사용하는 것보다는 이를 사용하는 것이 제조제품의 기능성향상에 훨씬 도움이 될 수 있다. 실제 본 발명에 의해 제조된 대나무발효액을 이용하여 청국장을 발효할 경우 청국장의 발효 효율이 증가하면서도 제조된 청국장의 보존기간이 길어지는 효과를 확인할 수 있음이 확인됨으로써 이같은 효과를 입증할 수 있었다.
본 발명의 대나무발효액은 대나무 흰가루로부터 미생물을 분리하고 이들 중 광범위한 항균활성과 다양한 소화효소를 분비하는 미생물을 최종 선발하여 이들을 이용하여 대나무를 발효함으로써 제조된다.
본 발명에서 대나무 흰가루는 대나무 줄기의 겉면 특히 마디근처에서 많이 발견되는 물질로 어린 죽순 때부터 나타나기 시작하여 1년생 대나무에서 주로 발견되다가 점차 사라지기 시작하며 일부는 마디의 굴곡 부분에 침착하여 오랫동안 관찰되기도 한다. 대나무 흰가루는 물에 잘 녹지 않으며 그 형태를 현미경으로 관찰하면 외견상으로는 진균류의 균사체나 일부 시아노세균의 형태와 유사한 미세구조를 하고 있다.
대나무 흰가루는 1년생 이하의 대부분의 대나무에서 가장 많이 발견되는 것으로 특별히 한정하지는 않지만, 그 양이 풍부한 분죽 또는 맹종죽의 흰가루를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 대나무흰가루에 서식하고 있는 미생물들을 분리하기 위해서는 다음과 같은 과정을 거친다.
대나무표면에 있는 흰가루를 미리 멸균한 면봉으로 문지른 뒤 이를 플레이트 카운트 아가(Plate Count Agar, PCA), 트립틱 소이 아가(Tryptic Soy Agar, TSA), 뉴트리언트 아가(Nutrient Agar, NA) 등 통상의 미생물 배양용 평판배지 또는 대나무를 증류수에 넣고 121℃에서 1시간 동안 고압 증자함으로써 얻어지는 추출액에 한천을 첨가하여 별도로 제조한 평판배지에 도말하고 20 내지 60℃에서 1주일간 배양하여 나타나는 미생물 집락들을 통상의 순수배양 방법(pure culture method)으로 분리함으로써 얻게 된다.
이렇게 수득한 미생물들은 통상의 배지를 이용하여 배양, 보존하며, 각종 소화효소의 분비여부는 트윈 아가(Tween agar, TA), 스킴 밀크 아가(Skim Milk Agar, SMA), 카르복시메틸 셀룰로오스 아가(Carboxymethyl Cellulose Agar, CMCA), 스타아치 아가(Starch Agar, SA) 등을 이용하여 배양하면서 이들의 성장으로 만들어 지는 미생물의 집락 주위에 체외 가수분해효소를 분비할 때 나타나는 투명환 또는 불투명환 등의 발달 여부로써 판독한다.
본 발명에서는 분리된 미생물에 대하여 항균력을 시험하기 위해 통상 사용되는 스트렙토코커스 파이오제네스(Streptococcus pyogenes ) 등의 상기 표준 미생물들을 대상으로 분리된 미생물이 항균력을 나타내는 지의 여부를 조사하여 이 중 3 가지 이상의 항균력시험 미생물에 대하여 항균활성을 보이는 것을 선택하고, 소화력이 큰 미생물을 선발하기 위하여 프로테아제, 아밀라아제, 셀룰라아제, 리파아제 등 4가지의 효소활성을 각각 조사하여 이들 중 4가지 효소를 모두 분비하는 것을 주요 대상 미생물으로 선발하되 비록 4가지 효소를 모두 분비하지는 않으나 특정 효소의 활성이 매우 높은 것도 선발 대상에 포함하도록 한다.
본 발명에서는 분리된 미생물에 대하여 그람염색 등 통상의 생리생화학적 동정실험과 자동 미생물동정기의 이용 및 16S rDNA에 대한 염기서열 분석을 통해 그 종류를 동정한다.
이상의 방법으로 대나무 흰가루로부터 항균활성이 광범위하고 소화효소를 다양하게 분비할 수 있는 미생물 8종을 최종적으로 선발하였으며 이들을 스타터로 활용하여 본 발명의 목표인 기능성 대나무발효액을 제조한다. 이들의 항균활성 및 소화효소의 분비 여부를 판정할 수 있는 배지상의 성상의 한 예를 도1에 나타내었다.
본 발명의 대나무발효액의 제조방법은 기질로 대나무를 사용하되 대나무를 물을 이용하여 깨끗이 세척하여 곧바로 사용하거나 또는 세척한 후 건조하여 사용하는 것이 바람직하다. 대나무는 잎이나 줄기, 뿌리 어느 부위나 사용할 수 있지만, 바람직하게는 줄기를 사용한다. 줄기를 기질로 이용할 때에는 사용상의 편의성과 미생물에 의한 이용이 용이하도록 세절하여 사용하는 것이 바람직하다.
상기 분리 선별된 미생물을 스타터로 이용한 대나무발효액 제조단계의 발효온도는 10 내지 35 ℃, 바람직하게는 15 내지 30 ℃, 보다 바람직하게는 20 내지 25 ℃의 상온이다.
대나무발효액 제조단계의 발효기간은 1 내지 12개월, 보다 바람직하게는 2 내지 3개월이다.
기질로 사용되었던 대나무는 발효로 증가하기 시작하는 대나무발효액의 갈변화에 따른 흡광도가 최대가 된 이후부터는 어느 때라도 제거할 수 있으나 바람직하게는 식품이나 사료의 제조 등 이후의 과정에 물대신 사용되기 직전까지 충분히 발효되도록 한 뒤 제거하는 것이 바람직하다.
본 발명에 의해 제조되는 대나무발효액의 기능성은 제조된 대나무발효액에 대하여 항균력, 소화력, 항산화효과에 대한 조사를 통해 확인한 바, 상기의 분리된 미생물에 대한 항균력 및 효소활성 방법과 동일한 방법으로 항균력 및 소화효소 활성을 조사하고, 통상의 DPPH 라디칼의 제거실험을 통해 항산화효과를 조사한 결과 대나무를 자연발효시킨 대조구에 비해 상기 선별된 미생물을 스타터로 하여 대나무발효액을 제조할 경우 발효기간이 단축되는 것은 물론 항균활성, 소화효소활성, 항산화활성이 모두 증가되는 것이 확인되었다
본 발명에 의해 제조되는 대나무발효액은 물을 사용하는 식품이나 사료의 제조과정에서 단순히 물 대신 사용함으로써 최종 제조되는 식품 또는 사료의 발효를 증진시키고 보존기간을 연장시킬 수 있으며 무엇보다 그 기능성을 손쉽게 증가시킬 수 있다. 이러한 식품제조로의 응용가능성은 그 한 예로 대나무발효액을 이용하여 청국장을 제조할 경우 청국장의 냄새가 줄어들고 보존기간이 연장되는 것을 실제 발효를 통해 확인하였다.
본 발명에 의해 제조되는 대나무발효액의 실제 활용에 있어서 사용되는 대나무발효액은 대나무발효액 제조가 완료된 후에 그대로 사용하는 것이 가장 바람직하나, 청국장의 발효에서와 같이 제2의 미생물을 사용해야 하는 경우 대나무발효액에 있는 미생물에 의해서 제2의 발효미생물에 의한 발효과정이 방해될 것이 우려될 때는 대나무발효액을 100℃에서 30분간 미리 중탕하거나 보다 바람직하게는 막여과 장치를 통해 여과한 뒤 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 대나무 흰가루로부터 항균력 및 효소활성이 큰 미생물의 분리 및 동정
전남의 담양 및 나주 영산포에 대규모로 서식하고 있는 맹종죽 군락에서 2008년 8월부터 12월까지 총 5회에 걸쳐 흰가루를 채취하였다.
채취한 대나무 흰가루를 Plate Count Agar(PCA), Tryptic Soy Agar(TSA), Nutrient Agar(NA) 등의 통상의 미생물배양용 평판배지, 그리고 대나무 줄기의 가공과정에서 통상 만들어지는 대나무톱밥을 10배 무게의 증류수에 넣고 121℃에서 1시간 용출시킨 대나무추출액에 한천을 첨가하여 만든 Bamboo Extract Agar(BEA)에 살포하여 상온에서 1주일간 배양시킴으로써 나타나는 미생물 집락들을 통상의 방법으로 순수분리하고 이를 동일 조성의 사면배지에 배양한 뒤 사용할 때까지 4℃에 보관하였다. 이러한 방법으로 총 458 가지의 미생물들을 분리하였으며, 이들을 대상으로 Starch Agar(SA), Skim Milk Agar(SMA), Tween agar(TA), Carboxymethyl Cellulose Agar(CMCA)를 이용하여 아밀라아제(A), 프로테아제(P), 리파아제(L), 셀룰라아제(C) 등의 4가지 효소에 대한 활성을 조사한 결과 전체 분리균 중 이들 효소에 대해 양성을 나타내는 것은 각각 아밀라아제가 192 개, 프로테아제가 256 개, 리파아제가 157 개, 그리고 셀룰라아제가 177 개였으며 총 30개의 균주가 4 효소 모두에 대해서 양성을 나타내었다(표1).
시료채취 지역
( 분리균수 ) 		시료채취
시기 		시료채취 건당 분리균수 a 효소활성 양성 균수
아밀라아제 프로테아제 리파아제 셀룰라아제 전체 양성균수
영산포
(177)		 8 월 29 25 15 13 12 7
9 월 37 30 27 17 16 6
10 월 36 9 14 8 7 1
11 월 25 12 19 6 16 2
12 월 50 11 32 14 22 2
담양1 (145) 8 월 32 24 18 6 13 1
9 월 23 15 20 11 6 2
10 월 37 11 12 16 8 0
11 월 22 7 12 3 12 2
12 월 31 7 22 10 15 2
담양2 (136) 8 월 23 14 9 3 8 1
9 월 17 6 9 12 2 2
10 월 36 10 16 17 14 0
11 월 26 5 13 9 10 1
12 월 34 6 18 12 16 1
계 　 458 192 256 157 177 30
상기 분리균 중 4가지 효소에 대해서 모두 양성의 활성을 보이는 균주를 비롯하여 비록 한, 두 가지 효소에 대하여 활성이 있으나 그 활성이 두드러지게 큰 미생물을 포함한 총 44개 분리균주들을 대상으로 항균력을 조사하고 이를 동정한 결과는 표2에 나타내었다. 이들에 대한 항균력 시험은 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus , Sa), 클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca, Ko), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa, Pa), 에스체리치아 콜리(Escherichia coli, Ec), 스타필로코커스 호미니스(Staphylococcus hominis , Sh), 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium, St), 비브리오 리토랄레스(Vibrio litoralis, Vl) 등 7개 균주에 대해서 통상의 방법으로 평판배지에 이들의 배양막을 형성한 것 위에 조사 대상 분리 미생물을 백금이로 도말하거나 그 배양액을 10 ㎕를 점적하여 주변에 투명한 영역이 발생하는 지의 여부를 통해 확인하였다.
미생물의 동정은 그람염색, 카탈라아제, 옥시다제, 베타헤몰리시스 등의 기초시험을 거친 후 자동 미생물동정기(Vitec 3500 System)를 이용하고 최종적으로 중요한 분리균주에 대하여서는 동정의 정확도를 높이기 위해서 이들의 16S rDNA의 염기서열을 알아낸 뒤 이를 블라스트(BLAST)에 적용하여 확인하도록 하였다. 이들의 동정 결과 유사한 기능을 갖는 균주들이 5번에 걸친 시료채취 과정에서 상당수가 중복되어 채취되는 것을 알 수 있다. 가장 높은 빈도로 발견되는 균주는 주로 바실러스 속(Genus Bacillus)으로서 전체 44개 균주 중에 61 퍼센트(%)에 해당하는 27개를 차지하고 있으며 지오바실려스(Geobacillus) 속이 8개로 그 다음을, 클라비박터(Clavibacter ) 속, 라이프소니아(Leifsonia ) 속, 스타필로코커스(Staphylococcus ) 속의 균주가 각각 2개씩, 그 외 아그로박테리움(Agrobacterium ), 아르스로박터( Arthrobacter ) 속, 패니바실러스(Paenibacillus ) 속 미생물이 각각 1개씩 발견되었다. 단일 균종으로서는 기존의 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus ) SAFR-032(또는 ATCC7061) 균주와 99 퍼센트(%) 유사성을 보이는 균주로 동정되는 것이 12개(N8-15, N8-19, DBF8-15, N9-18, DBF11-13, DBF12-27, N11-14, N9-45, DBF12-26, DBF12-28, DBR12-25, N12-38)로 가장 많이 채취되었는데 이들 균주는 시료를 채취한 시기와 장소를 가리지 않고 발견되고 있을 뿐 아니라 이 균종에 속하는 분리 균의 하나인 NF11-14 균주의 경우 높은 효소활성을 보일 뿐만 아니라 비교적 광범위한 항균활성을 보이고 있기 때문에 대나무 또는 대나무 흰가루에서 가장 큰 역할을 하고 있을 것임을 예상할 수 있다. 다음으로 널리 발견되는 균주는 기존의 지오바실러스(Geobacillus ) sp. Y412Mc10 ctg6와 93 내지 96 퍼센트(%)의 유사성이 있는 것으로 동정되는 균주들로 총 8개(N8-12, N8-3, N9-2, N8-36, DBR9-2, N8-38, DBR11-22, DBR12-26)가 발견되었는데 이 역시 흰가루 시료의 채취 시기와 장소에 상관없이 고르게 발견되고 있어 대나무 또는 대나무 흰가루에서 중요한 역할을 할 것으로 예상된다. 다만 이들 중 항균력을 보이는 것은 DBR12-26 한 개밖에 없으며 그것도 한 가지 시험균주에서만 항균력을 보이는 것으로 보아 항균력 생산능력은 크지 않은 것으로 보인다. 비록 분리 건수는 단 2번이나 조사한 7가지 항균력 시험용 균주에 대해서 모두 항균활성을 나타내는 균주는 기존의 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens ) FZB42 균주와 99 퍼센트(%)의 유사성을 나타내는 N11-1과 N11-2 균주로서 이들은 4가지 효소활성 역시 양성을 보이고 있어 본 발명의 목적에 가장 부합할 수 있는 균주로 판단된다(도1). 또한 4가지 효소에 모두 활성을 보이는 것 중 항균력 시험용 균주에 대해서 2가지 이상에서 항균활성을 나타내는 균주로서 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스(Bacillus subtilis subsp. subtilis ) str. SMYSMY와 96 내지 99 퍼센트(%)의 유사성을 나타내는 N12-37, DBF11-25, DBR12-31 3개 균주도 본 발명의 목적에 부합하는 균주로 판단된다. 그 밖에 항균활성은 없지만 4가지 효소 모두에 대해 활성을 나타내는 균주로서 기존의 클라비박터 미시가넨시스 아종 세페도니쿠스(Clavibacter michiganensis subsp . sepedonicus )와 96 퍼센트(%)의 유사성을 보이는 DBR9-7, N9-24-Y, 그리고 기존의 라이프소니아 자일리 아종 자일리(Leifsonia xyli subsp . xyli ) str.CTCB07과 95%의 유사성을 보이는 DBR9-5, N9-24-O 균주도 높은 소화력을 요구하는 본 발명의 목적에 부합하는 균주로 판단된다. 비록 빈번하게 발견되기는 하였으나 그 일부가 병원성인 것으로 알려져 있는 기존의 바실러스 세레우스(Bacillus cereus ) 과 99 내지 100 퍼센트(%) 유사성을 보이는 DBR8-33, N8-20, N12-29, DBF12-33, DBR12-21 균주 그리고 기존의 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)와 96 내지 98 퍼센트(%)의 유사성을 보이는 DBR12-12, DBF12-21 균주는 본 발명의 목적을 위한 선별대상에서 제외하였다.
균주라벨 염기서열분석 동정결과( Sequence ID ) Enzyme activity 1 Antibiotic activity
P A L C Sa Ko Pa Sh Ec St Vl
N8 -3 Geobacillus sp.Y412Mc10ctg6(93%)
Paenibacillus sp.JDR-2ctg5(93%) 		+ + + + - - - - - - -
N8 -12 Geobacillus sp.Y412Mc10ctg6(93%)
Paenibacillus sp.JDR-2ctg5(93%) 		+ + + + - - - - - - -
N8 -15 Bacillus pumilus ATCC7061 BAT.Contig112 (99%) + + + + - - - - - - -
N8 -19 Bacillus pumilus ATCC7061 BAT.Contig112 (99%) + + + + - - - - - - -
N8 -20 Bacillus cereus G9842(100%)
Bacillus.cereus Wgcontig_1112319163074(100%)
B.thuringiensis serovar israelensisATCC35646sg1910(99%) 		+ + + + - - - - - - -
N8 -36 Geobacillus sp.Y412Mc10ctg6(94%)
Paenibacillus sp.JDR-2ctg5(93%) 		+ + + + - - - - - - -
N8 -38 Geobacillus sp.Y412Mc10ctg6(95%)
Paenibacillus sp.D14cont1.265(95%) 		+ + + + - - - - - - -
DBR8 -3 Bacillus cereus G9241cont1870(100%)
B.thuringiensis serovar israelensisATCC35646sg1910(99%)
B.cereusG9842(99%) 		+ + + + - - - - - - -
DBF8 -15 Bacillus pumilus SAFR-032(99%) + + + + - - - - - - -
N9 -2 Geobacillus sp.Y412Mc10ctg6(93%)
Paenibacillus sp.D14cont1.265(93%)
Paenibacillus sp.JDR-2ctg5(92%) 		+ + + + nt nt nt nt nt nt nt
N9 -18 Bacillus pumilus SAFR-032(99%) + + + + nt nt nt nt nt nt nt
N9 -24-Y Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus(96%)
C.michiganensis subsp.michifanensisNCPPB382(96%) 		+ + + + nt nt nt nt nt nt nt
N9 -24-O Leifsonia xyli subsp.xylistr.CTCB07(95%)
Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus(95%)
C.michiganensis subsp. michifanensisNCPPB382(95%) 		+ + + + nt nt nt nt nt nt nt
N9 -29 Bacillus thuringiensis serovar israelensisATCC35646sg1910 (99%)
B. cereus G9842(99%) 		+ + + + nt nt nt nt nt nt nt
N9 -42 Bacillus licheniformis ATCC14580 (97%) + + + + nt nt nt nt nt nt nt
N9 -45 Bacillus pumilus ATCC7061BAT.contig112 (99%) + + + + nt nt nt nt nt nt nt
DBR9 -2 Geobacillus sp.Y412Mc10ctg6(94%)
Paenibacillus sp.D14cont1.265(93%)
Paenibacillus sp.JDR-2ctg5(92%) 		+ + + + nt nt nt nt nt nt nt
DBR9 -5 Leifsonia xyli subsp.xylistr.CTCB07(95%)
Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus(95%)
C. michiganensis subsp.michifanensisNCPPB382(94%) 		+ + + + nt nt nt nt nt nt nt
DBR9 -7 Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus(96%)
C.michiganensis subsp. michifanensis NCPPB382(96%) 		+ + + + nt nt nt nt nt nt nt
DBR9 -26 Agrobacterium tumefaciens str.C58 + + + + nt nt nt nt nt nt nt
N10 -38 Bacillus thuringiensis serovar israelensis ATCC35646sg1910 (99%)
B.cereusG9842 (99%) 		+ + + + nt nt nt nt nt nt nt
N11 -1 Bacillus amyloliquefaciens FZB42 (99%) + + + + + + + + + + +
N11 -2 Bacillus amyloliquefaciens FZB42,complete genome (99%)
Bacillus subtilis subsp. subtilis str. SMY SMY_ctg1, whole genome shotgun (99%)
Bacillus subtilis subsp. subtilis str. NCIB 3610 BS3610_ctg1, whole genome (99%) 		+ + - + + + + - + -
N11 -14 Bacillus pumilus SAFR-032,complete genome(99%) + - + + + - + - + + +
N11 -17 Paenibacillussp.oraltaxon786 str.D14cont1.265, whole genome(95%)
Geobacillus sp.Y412MC10ctg65, whole genome shotgun sequence(94%)
Paenibacillus sp. JDR-2, complete genome (94%)		 + - - + + - - - - - -
DBR11 -7 Arthrobacter sp.FB24(96%) + + + + - - - - - - -
DBR11 -22 Geobacillus sp.Y412Mc10ctg6(95%)
Paenibacillus sp.JDR-2ctg5(92%) 		+ + + + - - - - - - -
DBF11 -13 Bacillus pumilus SAFR-032, complete genome (99%) + - + + + + - - - - -
DBF11 -25 Bacillus subtilis subsp.subtilis str.SMYSMYctg1(99%) + + + + - - - - - - -
N12 -25 Bacillus sp.NRRL B-149111099999053144, whole genome shotgun(97%)
Bacillus sp NRRL B-149111099999053115, whole genome shotgun (97%) 		+ - - - + - - - - - -
N12 -37 Bacillus subtilis subsp.subtilis str.SMYSMY_ctg1, whole genome shotgun sequence(97%)
Bacillus subtilis subsp.subtilis str. JH642 JH642_ctg1, whole genome (97%)
Bacillus subtilis subsp.subtilis str.NCIB 3610 BS3610_ctg1, whole genome shotgun sequence (97%)
Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168 BS168_ctg1, whole genome shotgun sequence (97%)
Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168, complete genome (97%) 		+ + - - + + - - + + -
N12 -38 Bacillus pumilus ATCC7061BAT.Contig112, whole genome shotgun(99%)
Bacillus pumilus ATCC7061BAT.Contig116, whole genome shotgun (99%)		 - - - - + - - - - - -
N12 -29 Bacillus cereus G9241 cont1870(100%)
B. thuringiensis serovar israelensis ATCC35646 sg1910(99%)
B. cereus G9842(99%) 		+ + + + - - - - - - -
DBR12 -12 Staphylococcus aureus subsp.aureus MSSA476, complete genome(96%)
Staphylococcus aureus subsp.aureus MW2, complete genome (96%)
Staphylococcus epidermidis RP62A, complete genome (96%)
Staphylococcus warneri L37603 contig00210, whole genome shotgun (96%) 		+ - - - + - - - - - -
DBR12 -19 Bacillus sp.NRRLB-149111099999053144,whole genome shotgun(97%)
Bacillus sp.SG-11101501000787, whole genome shotgun sequence(97%) 		+ + - - + - - - - - -
DBR12 -25 Bacillus pumilus ATCC7061BAT.Contig112, whole genome shotgun(99%)
Bacillus pumilus ATCC7061BAT.Contig115, whole genome shotgun(99%)
Bacillus pumilus ATCC7061BAT.Contig116, whole genome shotgun(99%) 		+ - - + + - - - - - -
DBR12 -26 Geobacillus sp.Y412MC10 ctg65, whole genome shotgun sequence(94%)
Paenibacillus sp. JDR-2, complete genome (93%) 		- + + + - - + - - - -
DBR12 -21 Bacillus cereus H3081.97g contig2_1113133506686(99%) + + + + - - - - - - -
DBR12 -31 Bacillus subtilis subsp. subtilis str.SMYSMY ctg1(96%) + + + + + + - + - - -
DBF12 -21 Staphylococcus warneri L37603 contig00210, whole genome shotgun(98%)
Staphylococcus aureus subsp. aureus MSSA476, complete genome (98%)
Staphylococcus saprophyticus subsp. saprophyticus ATCC 15305, complete genome (98%)		 + + + - + - - - - - -
DBF12 -26 Bacillus pumilus ATCC7061BAT. Contig112, whole genome shotgun(99%) - - - + + - - - - - -
DBF12 -27 Bacillus pumilus SAFR-032, complete genome(99%)
Bacillus pumilus ATCC7061 BAT.Contig112, whole genome shotgun (99%)		 + - + + + - - - + - -
DBF12 -28 Bacillus pumilus ATCC7061 BAT.Contig112, whole genome shotgun(99%)
Bacillus pumilus ATCC7061 BAT.Contig116, whole genome shotgun (99%)
Bacillus pumilus SAFR-032, complete genome (99%)
Bacillus pumilus ATCC7061BAT.Contig115, whole genome shotgun (99%) 		+ - - + + - - - - - -
DBF12 -33 Bacillus cereus H3081.97g Contig2_1113133506686(99%) + + + + + - - - - - -
1. P: 프로테아제, A: 아밀라아제, L:리파아제, C: 셀룰라아제
실시예 2: 대나무발효에 사용할 흰가루 미생물의 선별
참고예 1에서 분리동정된 미생물들 중에서 상기에서 언급한 것처럼 사람에게 질병을 유발하는 병원성일 가능성이 높은 것으로 알려져 있는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus ) 또는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus ) 등과 관련이 있는 균들은 우선 제외하고 남은 균종에서 항균범위가 넓은 균, 효소활성이 다양한 균, 그리고 특정 효소 활성이 매우 높은 균 등을 선별기준으로 하여 N11-1, N11-14, N12-37, DBR9-7, N9-24-Y, DBR9-5, DBR12-26, DBF8-15 등 총 8개의 균종을 선정하였다. 선별된 균주들은 그들의 분리에 사용된 평판배지에 각각 도말하고 30℃에서 3일간 배양한 뒤 멸균된 증류수 10 ml를 첨가하여 수확하고 사용할 때까지 4℃에 냉장 보관한다.
실시예 3: 대나무발효액의 제조
ⅰ) Starter의 제조
선별된 미생물을 활성화한 스타터를 제조할 목적으로 이들 미생물을 사전 배양할 액체배지는 다음과 같이 제조한다. 증류수에 대나무 가공과정 중 흔히 만들어지는 대나무톱밥이나 또는 대나무를 인위적으로 분말화하여 제조된 대나무 분말을 10내지 20 퍼센트(%) 비율로 넣고 대나무 내의 영양성분이 충분히 용출되도록 121℃에서 1시간이상 고압, 증자한다. 이로부터 대나무 분말을 제거하기 위해 실온에서 1시간 이상 방치한 뒤 침전된 대나무가 들어가지 않도록 멸균된 천을 이용하여 상등액 만을 조심히 거른 액을 스타터용 배양배지로 한다. 선별된 미생물을 배양할 때는 스타터용 배양배지 200 ㎖를 500 ㎖용 삼각플라스크에 각각 넣고 121℃에서 30분간 고압, 증자한 뒤 4℃에서 냉장보관 중인 상기 선별된 미생물 배양액 10 ㎖ 씩을 각각 접종하여 30℃에서 1주일간 중탕 배양한다. 대부분 성장이 용이하나 만일 성장이 지연되는 균주에 대해서는 상기 대나무추출액으로 만들어진 스타터용 배양배지에 미리 멸균 제조된 10% 효모추출물 용액(Yeast Extract, Difco)을 최종 농도가 0.1 %가 되도록 무균적으로 첨가한 뒤 배양을 시작한다. 배양이 끝나면 곧바로 동량을 모두 혼합하여 본 발명의 최종 목표인 기능성 대나무발효액을 제조하기 위한 스타터(Starter)로서 사용한다.
ⅱ) 대나무발효액의 제조
본 발명의 목표인 대나무발효액은 상기 스타터 미생물들을 이용하여 대나무를 발효시킴으로써 제조된다.
통상 2년생의 맹종죽 대나무 줄기를 높이 10 cm 정도의 크기로 절단, 세척한 후 10 kg 단위로 그물망에 넣어 둔다. 500L 용의 플라스틱 통에 상수도물 또는 식수용 지하수를 200L가 되도록 넣은 뒤 여기에 상기 그물망에 넣어 둔 대나무 50 kg을 침지하고, 스타터 미생물 배양액을 10L 첨가 접종한 후 20 내지 30 ℃의 실온에서 1 내지 12개월, 보다 바람직하게는 2 내지 5개월간 발효시킨다.
발효가 끝나면 발효에 사용된 대나무는 그물망을 꺼냄으로써 손쉽게 제거할 수 있고, 침전물을 제거하기 위해 주로 상등액 만을 취함으로써 대나무발효액 제조 과정을 완성한다. 대나무발효액은 그 상태 그대로 사용하거나 대나무발효액 내에 존재하는 미생물들을 제거할 필요가 있을 경우는 100℃에서 1시간 이상 끓이거나 121℃에서 30분간 열처리하여 멸균할 수도 있고, 만일 미생물들은 제거하되 효소활성이 그대로 유지되어야할 필요가 있을 때는 지름 0.22 내지 0.45 ㎛의 멸균된 밀리포아 필터 등을 사용하는 통상의 막여과 장치를 이용하여 대나무 발효액을 여과한 뒤 사용할 수도 있다.
실험예 1: 대나무 발효정도 및 대나무발효액의 기능성 향상 여부 조사
상기 대나무발효액 제조과정에서 발효의 정도는 발효가 진행됨에 따라 증가하게 되는 발효액의 갈변정도를 분광광도계를 이용하여 400nm의 파장에서의 흡광도로써 조사하고 또한 이 과정에서 성장하게 되는 미생물의 수의 변화를 통해 판별하며, 대나무발효액의 기능성의 발달 정도는 발효가 진행 중인 발효액 10 ㎖를 채취하여 지름 0.45 ㎛의 멸균된 밀리포아 필터로 여과 멸균한 뒤, 그 액을 이용하여 항균활성 및 효소활성을 각각 조사함으로써 판별한다. 항균활성의 경우 아가홀 방법(신영준 등, 2002, 한국생물공학회지 15:584-588)에 따라 평판배지에 비브리오 리토랄리스(Vibrio litoralis ), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes ) 등 항균력 시험용 미생물 균주를 도말하고 상기 여과액 60 ㎕를 평판배지에 미리 만들어 둔 5 mm 크기의 아가홀에 점적하여 35 ℃에서 24시간 배양한 뒤 아가홀 주변에 시험용 미생물의 성장이 억제됨으로써 나타나는 투명환의 크기로 조사한다. 효소활성의 경우도 같은 방법으로 아가홀에 상기 필터여과액을 60 ㎕씩 첨가하여 나타나는 투명환의 크기로 조사한다. 프로테아제와 아밀라아제는 뉴트리언트 아가(Nutrient Agar, Difco)에 스킴 밀크(skim milk)를 0.1%, 가용성 전분(soluble starch)을 2% 각각 포함시킨 평판배지들을, 리파아제의 경우에는 증류수 1 ℓ에 펩톤(peptone) 10 g, 염화칼슘(CaCl22H2O) 0.1 g, 소금(NaCl) 5 g 트윈80(tween80) 10 g, 그리고 한천(agar) 15 g을 첨가하여 만든 평판배지를, 셀룰라아제의 경우 증류수 1 ℓ에 펩톤(peptone) 10 g, 효모추출물(Yeast Extract) 5 g, 카르복시메틸셀룰로오스 (carboxymethylcellulose, Sigma) 10 g, 한천(agar) 15 g을 첨가하여 만든 평판배지를 각각 이용한다. 단, 이들 효소의 활성은 아가홀에 필터여과액을 침적한 후 35 ℃에서 12시간 배양한 뒤 홀 주변에 나타나는 변화로써 조사하되, 아밀라아제와 셀룰라아제의 경우 1% 요오드액과 1% 콩고레드(Congo Red) 액을 배지표면에 각각 뿌려 발색시킨 후 홀 주변에 나타나는 투명환의 크기로써 조사한다. 프로테아제의 경우는 아무런 추가 처리 없이도 효소에 의해 스킴 밀크(Skim milk)가 가수분해되면 배지가 투명해지기 때문에 홀 주변에 나타나는 투명환의 크기로 그 활성을 조사할 수 있다. 그러나 리파아제의 경우는 반대로 홀 주변에 나타나는 불투명환의 크기로써 그 활성정도를 조사한다.
이 때, 선별된 미생물의 Starter를 접종하지 않고 대나무에 원래부터 존재하는 미생물들에 의해 자연발효(또는 부패)가 진행될 수 있도록 자연상태의 대나무를 같은 크기로 세절하여 같은 방법으로 증류수에 넣어둔 것을 대조구로 하여 본 발명의 선별 미생물들을 접종해 준 것과 비교한다.
조사 결과, 대나무가 발효됨에 따라 증가하는 갈변정도는 본 발명에 의해 선발된 발효균주를 미리 접종해준 시험구가 대조구에 비해 흡광도가 훨씬 빨리 증가하는 것으로 보아 선별된 균주를 이용함으로써 대나무 발효의 속도를 현저히 증가시킬 수 있음을 알 수 있었다. 이는 미생물의 수적 변화를 볼 때도 마찬가지였다.
항균활성 및 여타 효소들의 활성 역시 모두 대조구에 비해 훨씬 빠른 시기에 더 높게 발달되고 있어 본 발명에 의한 미생물들을 이용할 경우 기능성이 있는 대나무발효액을 빠르고 손쉽게 제조할 수 있음을 확인할 수 있었다(표 3).
조사항목 시험군 배양기간 (월)
0 1 2 3 4 5
성장정도
(cells/ml)		 대조군 3.8*103 2.2*106 3.2*1010 3.1*1011 3.3*107 3.4*107
시험군 7.1*10 5 6.3*10 9 5.0*10 11 3.0*10 8 3.5*10 7 1.7*10 7
갈변정도
(OD400nm)		 대조군 0.002 0.132 0.344 0.715 0.828 1.103
시험군 0.014 0.510 1.182 1.355 1.536 1.621
항균력
(mm)		 대조군 0 1 1 2 3 3
시험군 1 5 9 7 8 6
프로테아제
(mm)		 대조군 0 2 5 7 11 9
시험군 3 7 13 15 16 17
아밀라아제
(mm)		 대조군 0 2 3 5 8 9
시험군 2 5 11 13 16 15
리파아제
(mm)		 대조군 0 1 2 5 7 7
시험군 2 8 15 14 14 12
셀룰라아제
(mm)		 대조군 0 2 4 7 9 10
시험군 1 6 13 12 14 12
본 발명에서 대조구의 경우, 대나무에 자연서식하고 있는 미생물을 이용하여 발효가 진행되도록 하였으나, 만일 대나무발효액을 식품으로 활용하는 경우와 같이 사용상의 안전성을 확보하기 위해 불특정 미생물의 작용을 배제하고자 대나무를 사전에 멸균 조작한다면, 상기의 대조구와 같은 자연발효로 발생할 수 있는 효과는 아예 나타나지 않을 것이다. 그 경우 본 발명에서와 같이 선별된 미생물을 통한 대나무발효액 제조기술은 그 의미가 더더욱 크게 나타난다는 것은 자명하다.
실험예 2: 대나무발효액의 항산화효과 확인
동의보감 등에서 언급되고 있는 바와 같은 대나무 추출액은 항산화 효과를 포함한 다양한 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 본 발명을 위해 문헌상에 예시되어 있는 이러한 대나무의 효과들을 일일이 조사할 수는 없기 때문에 다만 그 한 예로서 대나무가 나타내는 대표적인 기능성의 하나인 항산화효과에 대하여 조사하여 대신하고자 하는 바, 그 이유는 항산화효과는 면역증강 및 노화방지, 항암효과 등 여타의 기능성과의 관련성이 비교적 광범위하기 때문이다.
본 발명에서 대나무의 항산화 효과가 대나무를 미생물로 발효한 후에도 여전히 유지되는지를 확인하기 위해서 분말로 가공한 대나무를 1시간 이상 고압, 증자하여 만든 대나무 추출액과 본 발명에서와 같이 선발된 미생물로 2개월간 발효한 대나무발효액, 그리고 미생물을 처리하지 않고 같은 기간 동안 자연 발효시킨 대나무 자연발효액(대조구)을 대상으로 항산화능을 비교 조사하였다. 디피피에이치(DPPH, 1,1-diphenyl- 2-picrylhydrazyl) 라디칼의 제거능력을 측정하는 방법(Leong and Shui, 2002)으로 항산화능을 조사한 결과, 자연발효액의 항산화능은 극히 낮은 반면, 선별된 미생물을 이용하여 발효한 본 발명의 발효액은 열수추출한 대나무 추출액과 마찬가지로 높은 수준의 항산화능을 보유하고 있음이 확인된다(도면2). 이는 대나무의 기능성 물질을 유기 용매가 아닌 보통의 물로 추출할 때는 통상적으로 고온을 이용해야 하는 것과는 달리, 본 발명에서는 열처리를 하지 않고서도 선별된 미생물들을 이용한 발효를 통해 대나무의 항산화 기능을 증가시킬 수 있음을 의미한다.
이상을 종합해 보면 본 발명은 강한 항균력, 소화력 등의 특수 능력을 발휘하는 선별된 미생물들을 이용하여 대나무를 상온에서 발효시킴으로써 항균력, 소화력, 항산화력 등의 기능을 갖는 발효액을 손쉽게 제조할 수 있다는 것을 입증한다.
실험예 3: 대나무발효액을 이용한 청국장의 제조 및 발효 정도 비교
상기와 같이 제조된 대나무발효액은 보통의 물을 사용하는 곳에서 물 대신 사용하는 간단한 방법을 통해 그 기능성들이 손쉽게 추가될 수 있기 때문에 본 발명은 이러한 기능들이 요구되는 여타의 음료나 식품, 사료의 제조에 활용되어 손쉽게 제품의 가치를 향상시킬 수 있는 기술임은 의심의 여지가 없다. 이러한 응용 가능성을 청국장의 제조실험 예를 통해 검증하였다.
본 발명에 의해 선별된 미생물을 이용하여 대나무를 발효한 발효액을 이용하여 청국장을 제조할 경우 청국장의 품질이 증가하는 지의 여부를 보통의 물을 이용하여 제조한 대조구 청국장과 비교하여 확인한다. 통상 청국장은 발효 전에 대두를 상수도물이나 식용 지하수로 하루 밤 동안 침지를 하여 콩을 불리고 증자를 한 뒤 청국장균을 접종하여 발효를 개시한다. 본 발명에서는 물대신 2개월간 발효하여 제조한 대나무발효액으로 대두를 불린 다음 청국장을 제조하도록 하였다. 단, 대나무발효액에 생존하고 있는 미생물들이 본래의 청국장 발효균에 의한 점질물 생성에 미치는 영향을 최소화하기 위해 대나무발효액을 미리 60 분간 중탕한 뒤 대두를 침지하도록 하였다.
중탕한 대나무발효액에 대두를 3:1의 비율로 넣고 상온에서 16시간 침지한다. 대조구의 경우 식수용 상수도물을 이용하여 같은 방법으로 침지한다. 침지가 끝난 시험구 및 대조구용 대두를 121℃에서 90분간 증자하고, 여기에 청국장 발효균의 하나인 바실스러 서브틸리스(Bacillus subtilis ) NG24 균주 배양액을 고루 살포한 뒤 43℃에서 24시간 발효한 다음 4℃ 냉장고에 24시간 보관하여 숙성함으로써 청국장의 제조를 완성한다. 여기서 청국장 발효균 배양액은 ㎖ 당 1 내지 10 억 개의 발효균을 함유한 배양액으로서 본 발명의 실험예에서는 침지한 대두 1 Kg 당 10 ㎖ 의 비율로 사용하였다. 대나무발효액을 사용하여 침지한 상기 청국장의 품질을 분석하기 위하여 청국장의 발효정도 및 발효가 끝난 청국장의 보존성을 대조구와 함께 비교 조사한다. 발효정도는 청국장의 발효에 의해 생성되는 점질물(폴리감마글루탐산, poly-γ-glutamic acid, PGA)의 양으로써 비교하였는데, 발효가 끝난 청국장의 대두 주변에 생성되어 있는 점질물을 청국장 무게의 4배에 해당하는 증류수(청국장 1 g당 증류수 4 ㎖)로 녹여낸 뒤 원심분리를 통해 대두를 제거하고 그 상등액에 최종 농도가 70 %가 되도록 알코올을 첨가하여 점질물 만을 원심분리를 통해 침전, 추출하여 그 무게를 측정함으로써 조사한다. 청국장의 보존성은 대기 중의 곰팡이류가 침투할 수 있도록 청국장을 보관하고 있는 용기의 뚜껑을 열고 1 시간 동안 방치한 뒤 다시 밀봉하고 이를 상온에서 1 개월간 방치한 뒤 잔존하고 있는 점질물의 양 및 곰팡이류의 증식 여부로써 판단한다.
그 결과 생성된 점질물의 양은 일반 물을 이용한 대조구의 경우 청국장 1 g 당 평균 9.3 mg의 점질물이 생성된 것에 비해서 대나무발효액을 이용한 시험구는 청국장 1 g 당 11.4 mg의 점질물이 생성됨으로써 발효에도 적지 않은 도움을 주는 것을 알 수 있었으며, 이렇게 제조된 청국장의 보존성을 확인하기 위해 발효 후 1 개월 후에 점질성의 양 및 곰팡이균의 생성여부를 조사한 결과 대조군의 경우 청국장 1 g 당 평균 7.6 mg의 점질물이 남아 있는 것에 반해 시험구는 10.4 mg의 점질물이 남아 있었으며 곰팡이의 발생건수도 대조구는 10개 시료 중 1건인 것에 반해 시험구는 0건으로 부패균인 곰팡이 발생이 억제되는 것이 확인되었다. 이는 보통의 물 대신 대나무발효액을 이용하여 식품을 제조할 경우 제조식품의 보존성(안전성)이 눈에 띠게 향상되는 것임을 입증하고 있다(표4).
결론적으로 본 발명은 이상의 실시예와 실험예들을 통해 살펴본 바와 같이 광범위 항균력과 소화력을 갖는 특수 미생물의 선별과 이들의 적절한 조합을 통해 대나무를 발효함으로써 미생물과 대나무의 장점을 극대화하는 것이 본 발명의 핵심으로, 선별된 기능성 미생물들을 이용하여 제조되는 대나무발효액을 식품이나 사료의 제조시 단순히 물 대신 사용함으로써 이들의 기능성을 손쉽게 향상시킬 수 있는 기술로서 범용으로 활용될 수 있는 여지가 매우 크기 때문에 그 의미가 크다 할 수 있다.
이상에서 본 발명에 의한 기능성 대나무발효액의 제조방법에 관하여 구체적으로 설명하였으나, 이는 본 발명의 가장 바람직한 실시양태를 기재한 것일 뿐, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니며, 첨부된 특허청구범위에 의해서 그 범위가 결정되어지고 한정되어진다. 또한, 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 누구나 본 발명의 명세서의 기재내용에 의하여 다양한 변형 및 모방을 행할 수 있을 것이나, 이 역시 본 발명의 범위를 벗어난 것이 아님은 명백하다고 할 것이다.
도 1은 대나무 흰가루에서 분리된 N11-1 균주의 배양액을 이용한 항균활성(A-I) 및 효소활성(J-M)에 대한 아가홀 방법 조사 결과를 나타내주는 사진이다. (A) 스타필로코커스 호미니스(Staphylococcus hominis), (B) 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), (C) 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) (D) 클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), (E) 엔테로박터 클로아카에(Enterobacter cloacae), (F) 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), (G) 칸디다 알비칸스(Candida albicans), (H) 에스체리치아 콜리(E. coli) (disk diffusion method), (I) 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhymurium), (J) 스킴밀크 아가에서의 프로테아제 활성, (K) 전분 아가에서의 아밀라아제 활성 (L) 시엠시 아가 에서의 셀룰라아제 활성, (M) 트윈아가에서의 리파아제 활성(세포외 활성은 음성으로 나타남).
도 2는 대나무의 열수추출액, 본 발명에 의한 미생물발효액 및 자연발효액의 항산화능을 비교한 그림이다.

Claims (6)

  1. ⅰ) 대나무를 물에 불려 발효할 목적으로, 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 에스체리치아 콜리(Escherichia coli), 스타필로코커스 호미니스(Staphylococcus hominis), 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium), 비브리오 리토랄레스(Vibrio litoralis) 등과 같은 통상의 항균력 시험용 세균 중 하나 이상의 세균에 대해서 항균활성을 나타내면서 동시에 프로테아제, 리파아제, 아밀라아제, 셀룰라아제와 같은 소화효소를 하나 이상 분비하는 것을 특징으로 하는 것을 기준으로 하여 대나무 흰가루에서 미생물을 선별하되, 보다 바람직하게는 그람염색, 당 발효실험 등을 포함한 통상의 세균학적 동정실험 및 16S rDNA에 대한 염기서열 분석을 통해 잠정적으로 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens)로 동정되는 N11-1, 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus)로 동정되는 N11-14, DBR12-26, DBF8-15, 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스(Bacillus subtilis supsp. subtilis)로 동정되는 N12, 클라비박터 미시가넨시스 아종 네페도니쿠스 (Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus)로 동정되는 DBR9-7와 N9-24-Y, 라이프소니아 자일리 아종 자일리(Leifsonia xyli subsp. xyli)로 동정되는 DBR9-5, 그리고 지오바실러스속의 종(Geobacillus sp.)으로 동정되는 DBR12-26 등 8종의 미생물을 선별하는 단계와;
    ⅱ) 대나무 잎 또는 줄기, 보다 바람직하게는 대나무 톱밥을 10 내지 20 퍼센트(%) 중량 비율로 물에 넣고 121 ℃에서 30 내지 90 분간 중탕함으로써 제조되는 대나무 추출액에서 각각 30 ℃에서 1 주일 정도 사전 배양하는 단계와;
    ⅲ) 상기 배양액을 대나무를 발효할 스타터로 사용하기 위하여 같은 양씩 혼합하는 단계와;
    ⅳ) 대나무 잎, 죽순, 또는 줄기, 보다 바람직하게는 맹종죽 대나무 줄기를 높이 10 cm 정도의 크기로 절단, 세척한 후 10 kg 단위로 그물망에 미리 넣어 둔 다음 이를 20 내지 30 % 의 중량 비율이 되도록 물에 넣은 뒤 상기 스타터 미생물 혼합액을 5 %의 비율로 첨가 접종하는 단계와;
    ⅴ) 이를 15 내지 45 ℃ 보다 바람직하게는 20 내지 30 ℃에서, 1 내지 12개월 보다 바람직하게는 2 내지 5개월간 발효시키는 단계와;
    ⅵ) 발효가 끝난 대나무를 포함한 침전물을 제거하기 위해 상등액 만을 취합하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 대나무발효액의 제조방법
  2. 제 1 항에 있어서, 상기의 항균활성 및 소화효소 분비 활성이 있는 미생물로서는 그들의 특성을 규명할 목적으로 통상의 16S rDNA 염기서열을 분석하는 방법에 의할 경우 N11-1의 경우 16S rDNA 염기서열의 일부가 기존의 바실러스 아밀로리퀴패시언스(Bacillus amyloliquefaciens) FZB42 균주와 99 %의 유사도를, N11-14의 경우 기존의 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus) SAFR-032과 99 %의 유사도를, DBF8-15의 경우 기존의 바실러스 퓨밀리스(Bacillus pumilus) ATCC7061 BAT. Contig112와 99%의 유사도를, N12-37의 경우 기존의 바시러스 서브틸리스 아종 서브틸리스(Bacillus subtilis subsp. subtilis) str. SMYSMY와 97 %의 유사도를, DBR9-7과 N9-24-Y의 경우 기존의 클라비박터 미시가넨시스 아종 세페도니쿠스(Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus)와 96 %의 유사도를, DBR9-5의 경우 기존의 라이프소니아 자일리 아종 자일리(Leifsonia xyli subsp. xyli) str.CTCB07과 95 %의 유사도를, 그리고 DBR12-26의 경우 기존의 지오바실러스(Geobacillus) sp. Y412MC10 ctg65와 94 %의 유사도를 보이는 것과 같은 특징을 갖는 미생물을 하나 이상 포함하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 대나무발효액은 상기 8가지 선별된 미생물 중 한 가지 미생물만을 이용하여 제조하거나 혹은 각각의 미생물로 각각 제조된 대나무발효액을 나중에 혼합하여 제조하는 방법을 포함한다.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 발효를 통해서 제조되는 대나무발효액은 항균력, 소화력, 그리고 항산화력이 모두 발휘되는 것을 특징으로 하는 방법
  5. 제 1 항에 있어서, 대나무발효액은 중탕, 멸균, 여과 등의 방법으로 2차 가공한 액 을 포함한다.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 방법 또는 특징으로 제조된 대나무발효액을 유효성분으로 함유하는 음료, 식품 또는 어류양식용 첨가제.
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