CN111154679A - 一种黄曲霉毒素降解菌的高效发酵方法 - Google Patents

一种黄曲霉毒素降解菌的高效发酵方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种黄曲霉毒素降解菌的高效发酵方法，属于生物技术领域，包括种子液制备、发酵培养、添加携氧剂、测定黄曲霉毒素含量等步骤；利用本发明提供的在黄曲霉毒素降解菌的发酵体系中添加十二烷作为携氧剂的方法，能够提高目标菌种发酵效率，得到的目标菌种的发酵产物能显著的降低黄曲霉毒素的残留率，发酵20h的上清液降解黄曲霉毒素后的毒素残留率相比不加携氧剂的空白对照组降低了24.41％，毒素残留率仅为9.6％。

Description

一种黄曲霉毒素降解菌的高效发酵方法
技术领域
本发明属于(涉及)微生物技术领域，特别涉及到一种添加携氧剂的黄曲霉毒素降解菌的高效发酵方法。
背景技术
黄曲霉毒素(aflatoxins)是一类含有二氢呋喃环结构的次级代谢产物，是一类毒性极强的天然毒素。其产生主要是由黄曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)等在一定的环境条件下生物合成的。黄曲霉毒素对人类有强毒性和高致癌性，广泛的分布在霉变的谷物及坚果(包括大米、玉米、花生、棉籽等)、被污染的乳及乳制品中。目前已发现的黄曲霉毒素共有18种，其中最常见的黄曲霉毒素主要是黄曲霉毒素B1、B2、G1及G2，其中，黄曲霉毒素B1是目前已知的含量最多、致癌效率最高的天然致癌物质。国际癌症研究机构(IARC)将黄曲霉毒素列为一类致癌物。黄曲霉毒素具有较强的耐热性，其中黄曲霉毒素B1的分解温度为268℃，而黄曲霉毒素被加热到280℃才开始被裂解破坏，在食品加工过程中含量几乎不会减少，所以黄曲霉毒素能被保留在整条食物链中而不会被普通加工流程除去。因此，被污染的农产品等食品生产原料内聚集的黄曲霉毒素是人类极大的健康威胁。
如何去除黄曲霉毒素一直是一个棘手的问题，目前常规的手段有物理去除法、化学去除法和生物去除法。这些方法在实验室环境下都有较好的效果，但在应用中都因为成本、方法特性等原因不能广泛的应用，存在一定的局限性。
目前生物酶解法是黄曲霉毒素降解的最新研究方向，采用培养菌株提取活性物质来分解黄曲霉毒素摆脱了以往传统方法的限制，有着大规模生产成本低、解毒物质几乎无毒性、且应用限制小，是化学和物理降解黄曲霉毒素方法的有竞争性的替代，具有良好的应用前景和研究价值。阿耶波多氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)DT也是这样一种能分解黄曲霉毒素的菌株。该菌种是从杭州(E120°12’，N30°16’)地区的园地、垃圾焚烧站等地收集的植物样品中分离筛选出的，对黄曲霉毒素有降解作用的一种野生菌，目前研究该菌种在LB培养基内37℃、摇床上180rpm培养24h的发酵上清液取900μL与100μL、浓度为20μg/mL的黄曲霉毒素甲醇溶液在37℃避光消解72h，黄曲霉毒素的降解率可达78％。
对于需氧微生物来说，发酵体系内的溶氧水平是微生物生长繁殖的限制性底物。氧气在水中的溶解度较差，因此采用多种方法增大氧气在水中的溶解度，改善供氧条件能很好的提高菌种生长速率，达到提高胞内外产物产量的目的。传统的增加通气量的方式包括增大搅拌速率、增大通气量等，但这些方式无疑都会增大能源消耗，在实际生产应用中会增加生产成本。氧气在水中的溶解度较差，但在一些碳氢化合物和碳氟化合物中溶解度较好，例如正十六烷、十二烷、全氟化碳等。通过向培养液中添加一定量的碳氢化合物并通过摇床摇动等方法使这些碳氢化合物在气-液分界面来回穿梭能提高菌种的供氧量，加快菌的生长速度，提高胞内外物质产量。Adam W.Westbrook等人研究了氧载体在工程枯草芽孢杆菌异源产生HA中的应用。初步筛选的七种潜在氧载体中，其中在含有正庚烷、正十六烷、全氟甲基萘烷和全氟-1,3-二甲基环己烷的培养物中观察到HA滴度和/或细胞密度的显著改善。对载体浓度、载体添加时间和搅拌速率进行进一步调整，导致培养结果进一步改善，在仅培养10小时后HA滴度就达到4.5g/L。王爽等人使用6％的二甲基硅油、大豆油、橄榄油及表面活性剂吐温-80分别作为携氧剂添加到发酵初期的纳他霉素发酵液中，使纳他霉素的产量提高了50％以上，添加表面活性剂吐温-80使产量提高了82％。因此，探究黄曲霉毒素降解菌对氧气的依赖情况，通过改善供氧条件以达到提高菌种发酵效率，最终增强黄曲霉毒素降解能力就成为了可能。
发明内容
本发明的目的在于提供一种黄曲霉毒素降解菌的高效发酵方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
(1)种子液制备：将待用的黄曲霉毒素降解菌DT接种到细菌基础(LB)培养基中培养得到种子液；
(2)发酵培养：将步骤(1)所述种子液接种到细菌基础(LB)培养基中；
(3)添加携氧剂：在发酵4-10h后加入体积百分比0.5％-1.5％的十二烷；
(4)发酵培养15-25h可认为发酵完毕。
在所述步骤(1)中，所采用的待用黄曲霉毒素降解菌为阿耶波多氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)DT，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNo.14949，保藏日期为2017年11月22日。所述的阿耶波多氏芽孢杆菌DT在申请号为CN201711458433.1的发明中已经公布。菌种保存于质量分数为25％甘油中存放在-80℃冰箱中；使用时，先将菌种接种在细菌基础琼脂(LB琼脂)培养基上进行菌种活化，在37℃培养箱培养12～24h，待有菌落形成挑取适量单菌落接种到新的LB琼脂培养基上，在37℃培养箱培养12～24h获得待用的黄曲霉毒素降解菌；
在所述步骤(1)中，培养条件为37℃、摇床转速180rpm，培养时间为10-14h；
在所述步骤(2)中，将所述种子液以体积百分比2％-10％的比例接种到细菌基础(LB)培养基中，培养温度为37℃，摇床转速220-240rpm；
在上述方案中，所述细菌基础(LB)培养基为：氯化钠10.0g/L、酵母浸粉5.0g/L、胰蛋白胨10.0g/L，水为蒸馏水，121℃高压灭菌20min；所述细菌基础琼脂(LB)培养基为：氯化钠10.0g/L、酵母浸粉5.0g/L、胰蛋白胨10.0g/L、琼脂条15～20g/L，水为蒸馏水，121℃高压灭菌20min。
在所述步骤(4)中，用发酵20h的上清液降解黄曲霉毒素72h，能显著降低黄曲霉毒素的残留率，具体步骤为：选择37℃、240rpm作为固定发酵条件，且在培养4h后分别加入1％的十二烷，取培养20h的培养液1mL并离心，取900μL上清液和100μL黄曲霉毒素溶液混合，避光37℃消解72h后使用超高压液相色谱(UHPLC)测定残留黄曲霉毒素含量，如图3结果显示，20h上清液黄曲霉毒素残留率明显低于使用菌种降解黄曲霉毒素的实验组，加入十二烷的发酵上清液降解黄曲霉毒素后的毒素残留率相比不加携氧剂的空白对照组降低了24.41％，残留率仅为9.6％。
在上述方案中，黄曲霉毒素B1(AFB1)标品购于北京百灵威科技公司；十二烷试剂为国产分析纯。高效液相色谱试剂(甲醇、乙腈等)均为国产色谱纯。
本发明的有益效果为：用此法能提高毒素降解菌阿耶波多氏芽孢杆菌DT的发酵效率，加入十二烷作为携氧剂得到的目标菌种的发酵上清液能显著的降低黄曲霉毒素的残留率，取目标菌种的上清液900μL并加入100μL的20μg/mL AFB1标准液进行降解后，毒素残留率相比不加携氧剂的空白对照组降低了24.41％，残留率仅为9.6％。
附图说明
图1为不同摇床转速对DT生长的影响；
图2为发酵初始加入1％不同携氧剂对DT生长的影响；
图3为发酵初始加入2％不同携氧剂对DT生长的影响；
图4为发酵4h后加入1％不同携氧剂对DT生长的影响；
图5为发酵4h后加入1％不同携氧剂对DT培养液溶氧的影响；
图6为培养20h的DT上清液和菌体对黄曲霉毒素的降解效果。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
(1)菌种培养：实验前将菌种从冰箱取出，用碎冰保温，使用灭菌竹签或枪头挑取适量菌种接种在LB琼脂培养基上，在37℃培养箱培养12-24h进行菌种活化，待有菌落形成用灭菌竹签挑取单菌落接种到新的LB琼脂培养基上，在37℃培养箱培养12-24h待用；
(2)种子液的制备：用灭菌竹签从二转培养基上挑取单菌落接种到LB培养基中，并在37℃、摇床转速180rpm条件下培养12h得到种子液；
(3)菌种供氧条件的梯度实验：将种子液以体积百分比2％的比例接种到LB培养基(250mL锥形瓶，装液量50mL)中进行实验，培养温度为37℃，设置160rpm、180rpm、200rpm、220rpm、240rpm、260rpm六个不同摇床转速梯度，每组设置3个平行样，培养30h左右，每2h取样200μL，在波长600nm测定OD值并做出生长曲线。
(4)实验结果：如图1，在一定范围内，阿耶波多氏芽孢杆菌DT的发酵效率随供氧量增大而增大，在温度为37℃时培养14h，转速为220rpm的实验组相比180rpm的实验组OD600提高了55.1％。
结果表明，在摇床转速220-240rpm范围内该菌种发酵效率最高。
实施例2
(1)菌种培养：实验前将菌种从冰箱取出，用碎冰保温，使用灭菌竹签或枪头挑取适量菌种接种在LB琼脂培养基上，在37℃培养箱培养12-24h进行菌种活化，待有菌落形成用灭菌竹签挑取单菌落接种到新的LB琼脂培养基上，在37℃培养箱培养12-24h待用；
(2)种子液的制备：用灭菌竹签从二转培养基上挑取单菌落接种到LB培养基中，并在37℃、摇床转速180rpm条件下培养12h得到种子液；
(3)携氧剂种类筛选及添加量比较：选取三种碳氢化合物作为携氧剂的筛选对象：正十六烷、十二烷、正庚烷。分别在发酵初期加入1％、2％的携氧剂，选择240rpm、37℃作为实验条件以探究不同携氧剂添加量和不同种类携氧剂对DT发酵的影响，设置不添加携氧剂、其他条件相同为对照组。实验中每2h测定一次OD值，并分别做出生长曲线如图2、图3。
(4)实验结果：如图2，添加了1％十二烷的培养液相对于对照组提前两小时进入稳定期，且菌体生长速度更快，生物量更多，发酵8h后OD值达1.269，比对照提高了9.97％，发酵效率更高，通过方差检验得到P<0.05，表明对照组与加入1％十二烷组有显著差异。而正十六烷与正庚烷对比对照组则没有显著优势，添加1％的正十六烷组发酵初期生长速度优于对照组，但峰值明显低于对照组；而正庚烷则是从发酵初期起发酵速度就低于对照组，峰值也未超过对照组，没有对DT的生长起到促进作用，反而降低了发酵效率。到了发酵后期，DT进入衰退期，添加了携氧剂的组别OD值降低速率低于对照组。
如图3，调整三种携氧剂的添加量到2％并不能对DT的发酵产生积极影响，且三者之间并没有统计学意义上的差距；同时，添加2％的正庚烷会明显抑制DT前期生长，使菌种进入稳定期的时间延后9h。
结果表明，添加了1％十二烷的培养液该菌种发酵效率更高。进一步实验中，在1％附近调整十二烷的添加量，最终得到较佳的十二烷添加量范围为0.5％-1.5％。
实施例3
(1)菌种培养：实验前将菌种从冰箱取出，用碎冰保温，使用灭菌竹签或枪头挑取适量菌种接种在LB琼脂培养基上，在37℃培养箱培养12-24h进行菌种活化，待有菌落形成用灭菌竹签挑取单菌落接种到新的LB琼脂培养基上，在37℃培养箱培养12-24h待用；
(2)种子液的制备：用灭菌竹签从二转培养基上挑取单菌落接种到LB培养基中，并在37℃、摇床转速180rpm条件下培养12h得到种子液；
(3)携氧剂添加时间对发酵的影响：分别在接种时和培养4h后加入1％的三种携氧剂，培养24h左右，每2h取样200μL，在波长600nm测定OD值并做出生长曲线。选择240rpm、37℃作为实验条件，以探究添加携氧剂不同时间对于DT发酵的影响；
(4)实验结果：如图4，当添加携氧剂的时间从发酵初期延迟到发酵4h后，十二烷和正十六烷对DT发酵效率有一定的提高，十二烷、正十六烷分别使DT菌8h的OD值提高5.01％、9.28％，且P<0.05，有显著性差异；而正庚烷仍然对DT发酵效率产生负面影响。当DT进入衰退期时，添加了十二烷、正十六烷的处理组与对照组保持了几乎一致的衰退水平。
结果表明，在发酵4h后添加1％的正十六烷、十二烷能增大稳定期的细胞量。进一步实验中，调整十二烷的加入时间，最终得到较佳的十二烷添加时间为发酵4-10h。
实施例4
(1)菌种培养：实验前将菌种从冰箱取出，用碎冰保温，使用灭菌竹签或枪头挑取适量菌种接种在LB琼脂培养基上，在37℃培养箱培养12-24h进行菌种活化，待有菌落形成用灭菌竹签挑取单菌落接种到新的LB琼脂培养基上，在37℃培养箱培养12-24h待用；
(2)种子液的制备：用灭菌竹签从二转培养基上挑取单菌落接种到LB培养基中，并在37℃、摇床转速180rpm条件下培养12h得到种子液；
(3)携氧剂对培养液中溶氧(DO)的影响：选择发酵4h后加入1％的正庚烷、十二烷、十六烷，并在37℃、240rpm的条件下培养，每隔几小时使用氧微电极测定DO，通过校准氧微电极软件，使用软件将电极微电压信号转化成溶氧量，单位为μmol/L。整理数据做出溶氧曲线图如图5。具体实施方式为：实验前将溶氧电极链接到电脑上，并将电极放在纯水中平衡1-2h，直至电极在10min内电压变化小于0.1mV。使用气泵向纯水中泵气20min以上得到氧饱和溶液，同时配制氧零点液，测定两点数据绘制标准曲线。测定培养液OD值的同时，在锥形瓶刚从摇床上取出事迅速将灭菌的溶氧微电极伸入培养液中，平衡5-10S后读数。
(4)实验结果：如图5，6h测定DO，4组的DO值仍然很低，对照组DO仅为1.807μmol/L，但添加了十二烷和正十六烷的DO分别比对照组增长了43.9％、28.2％。随后随着培养时间的延长，培养液中的DO迅速增加，直至8h后，DT进入稳定期，耗氧量降低，溶液中DO开始趋于稳定，16h时，添加了十二烷、正十六烷的组培养液DO分别较对照提高了31.49％、14.8％。培养过程中培养液DO值的变化趋势一直与DT生长趋势存在着一致性。
结果表明，在发酵4h后添加1％的正十六烷、十二烷都能明显增大溶液溶氧。
实施例5
(1)菌种培养：实验前将菌种从冰箱取出，用碎冰保温，使用灭菌竹签或枪头挑取适量菌种接种在LB琼脂培养基上，在37℃培养箱培养12-24h进行菌种活化，待有菌落形成用灭菌竹签挑取单菌落接种到新的LB琼脂培养基上，在37℃培养箱培养12-24h待用；
(2)种子液的制备：用灭菌竹签从二转培养基上挑取单菌落接种到LB培养基中，并在37℃、摇床转速180rpm条件下培养12h得到种子液；
(3)黄曲霉毒素的降解实验：将种子液以2％(v/v)的接种量接种到新鲜的LB培养基，实验仍然选择37℃、240rpm作为固定发酵条件，且在培养4h后分别加入1％的十二烷、正十六烷、正庚烷，分别取培养10h、20h的培养液1mL并离心，取900μL上清液和100μL黄曲霉毒素溶液混合、1mL无菌水溶解离心出的菌种后取900μL与100μL黄曲霉毒素溶液混合，避光37℃消解72h后使用超高压液相色谱(UHPLC)测定残留黄曲霉毒素含量。
具体实施方式为：取1mL培养液离心，取上清液900μL并加入100μL的20μg/mL AFB1标准液，并在37℃避光的条件下反应72h，设置加入相同浓度AFB1但无菌的LB培养液作为对照；同时取离心后的菌种加入无菌水1mL，涡旋1min混匀，取900μL并加入100μL的20μg/mLAFB1标准液，并在37℃避光的条件下反应72h，设置加入相同浓度AFB1但无菌的水作为对照。待反应完毕后，向反应体系中加入等体积的二氯甲烷来提取AFB1,每次涡旋1min，收集并转移提取过后的二氯甲烷相到新的无菌离心管中，此提取操作重复3遍。提取液使用氮吹仪缓慢吹干，剩下的残留物用0.5mL液相流动相(无菌纯水：乙腈：甲醇＝6：3：1)溶解，液相测定方法参照Raksha Rao K等人(Raksha Rao K,Vipin AV,Haiprasad,et al.Bologicaldetoxcation of AflatoxinBl by Bacillus licheniformis CFR1[J].Food Control,2017,71:234-241.)及Samuel M S等人(Samuel M S,Sivaramakrishna A,MehtaA.Degradation and detoxification of aflatoxin B1 by Pseudomonas putida[J].International Biodeterioration&Biodegradation,2014,86:202-209.)的方法并略有改动：将样品过膜(0.22μm)并设置超高压液相色谱进样20μL，使用Promosi1 C18色谱柱(4.6*250nm，5μm)洗脱，流动相配比为无菌纯水：乙腈：甲醇＝6：3：1(v/v/v)，采用等度洗脱的洗脱方式，洗脱流速为1mL/min，测定波长为326nm，柱温30℃。
AFB1的残留率计算公式为：
残留率(％)＝处理组AFB1峰面积/对照组AFB1峰面积*100％
(4)实验结果：结果见图6，四个不同实验条件下20h上清液黄曲霉毒素残留率明显低于使用菌种降解黄曲霉毒素的实验组，活体菌体细胞对黄曲霉毒素的降解作用很弱，20h时上清液组中加入1％十二烷的组相较于其他组残留率更低，且有显著性差异(P<0.05)。20h其他上清液实验组中，正庚烷组不能提升AFB1的降解率，正十六烷组与对照组并没有显著性差异。
结果表明，在温度37℃、摇床转速240rpm的条件下培养阿耶波多氏芽孢杆菌DT，并在发酵4h时加入1％的十二烷，选用发酵20h的上清液处理黄曲霉毒素72h，能显著的降低黄曲霉毒素的残留率。加入十二烷的发酵上清液的毒素残留率相比不加携氧剂的空白对照组降低了24.41％，残留率仅为9.6％。
本发明未尽事宜为公知技术。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种黄曲霉毒素降解菌的高效发酵方法，其特征在于：在黄曲霉毒素降解菌的发酵体系中添加合适的携氧剂，步骤如下：
(1)种子液制备：将待用的黄曲霉毒素降解菌接种到LB培养基中培养得到种子液；所述的黄曲霉毒素降解菌为阿耶波多氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)DT，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.14949，保藏日期为2017年11月22日；
(2)发酵培养：将步骤(1)所述种子液接种到LB培养基中；
(3)添加携氧剂：在发酵培养4-10h后加入相对于发酵液体积百分比为0.5％-1.5％的十二烷；
(4)发酵培养15-25h认为发酵完毕。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：在所述步骤(1)中，培养条件为37℃、摇床转速180rpm，培养时间为10-14h。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：在所述步骤(2)中，将所述种子液以体积百分比2％-10％的比例接种到LB培养基中，培养温度为37℃，摇床转速220-240rpm。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：，所述的黄曲霉毒素降解菌保存于质量分数25％的甘油中并存放在-80℃冰箱中；在所述的步骤(1)使用前，还包括前置活化步骤；
所述的前置活化步骤具体为：先将菌种接种在LB琼脂培养基上进行菌种活化，在37℃培养箱培养12-24h，待有菌落形成挑取适量单菌落接种到新的LB琼脂培养基上，在37℃培养箱培养12-24h获得待用的黄曲霉毒素降解菌。
5.如权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于：所述LB培养基为：氯化钠10.0g/L、酵母浸粉5.0g/L、胰蛋白胨10.0g/L，水为蒸馏水，121℃高压灭菌20min；所述LB琼脂培养基为：氯化钠10.0g/L、酵母浸粉5.0g/L、胰蛋白胨10.0g/L、琼脂条15～20g/L，水为蒸馏水，121℃高压灭菌20min。
6.一种权利要求1-5任一项所述方法制备得到的发酵液。
7.权利要求6所述发酵液在制备降解黄曲霉毒素的制剂中的应用。
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